修饰腺苷受体激动剂纳米探针及其制备方法和用途
【专利摘要】本发明属生物医学领域，涉及修饰腺苷受体激动剂纳米探针及其制备方法和用途，所述纳米探针的通式为IR783-Den-(PEG-Reg)x，其中Den为探针载体第五代聚酰胺-胺型树枝状聚合物（Dendrimer）；IR783为近红外荧光基团，PEG为分子量为10k-40k的聚乙二醇；Reg为腺苷A2A受体特异性激动剂Regadenason,x为标记在探针上PEG-Reg的数目。本发明中在双功能聚乙二醇（Mal-PEG-NHS）的一端通过马来酰亚胺基连接探针载体Den，另一端通过N-羟基琥珀酰亚胺基连接腺苷受体激动剂Reg。通过控制投料比调节探针表面修饰腺苷受体激动剂的数量。本发明对提高脑部疾病诊疗效果，降低治疗过程中毒副作用，促进脑部疾病个性化治疗方案临床转化均具有重要研究和临床意义。
【专利说明】修饰腺苷受体激动剂纳米探针及其制备方法和用途
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医学领域，涉及修饰腺苷受体激动剂纳米探针及其制备方法和用 途。本发明通过构建介导脑毛细血管内皮细胞上腺苷受体活性的纳米探针实现对血脑屏障 开启时间窗口的的调控，从而实现对脑肿瘤、缺血性脑卒中等脑部重大疾病的诊疗效率。
【背景技术】
[0002] 近年来脑部重大疾病包括脑肿瘤、缺血性脑卒中、帕金森症、奥尔海默氏病等发病 率不断攀升，且具有复发率高、治愈率低、和病人生活质量差等特点。目前上述疾病诊疗面 临最大困难是血脑屏障（Blood-Brain Barrier, BBB)阻止诊断和治疗药物高效入脑。BBB 是由内皮细胞、周细胞、星状细胞和基底膜构成生理结构，是保护大脑的生理和免疫屏障。 但由于其低通透性低，大约98%的小分子药物和绝大多数的大分子药物不能有效入脑。不 同程度脑部疾病虽然会伴随局部BBB损伤，但构成BBB低通透性关键结构紧密连接（Tight Junctions，TJs)的存在仍限制治疗和诊断药物在脑内大内有效诊疗浓度。目前跨BBB药物 递送方法主要有三种：（1)化学方法，通过注射甘露醇等渗透调节剂改变内皮细胞渗透压 达到开启BBB目的。但其无选择性、不可控开启易造成电解质紊乱、癫痫等严重功能障碍性 疾病。（2)物理方法，利用聚焦超声联合微泡等方法将药物定点"挤压"入脑。但其对血管 壁和神经元潜在机械损伤，需要对病灶部位精确定位等因素限制其临床应用。（3)生物转胞 吞方法，脑毛细血管内皮细胞可通过受体介导的转胞吞作用或吸附介导的转胞吞作用将蛋 白或大分子药物转运入脑。此方法具有非侵入性，副作用小等特点。但由于受体表达水平， 内涵体小穴形成速度、胞内转运效率等因素制约，该方法效率较低，而且无区域选择性。
[0003] 腺嘌呤核苷受体是一类以腺嘌呤核苷为内源性配体的G蛋白偶联受体。Bynoe等 最近发现在腺苷受体四个亚型（A 1, A2A，A2b和A3)中，A1和A2a亚型受体激活后引发脑血管内 皮细胞的细胞骨架重组，导致紧密连接暂时性打开，从而提高药物跨BBB效率。与传统方法 不同的是，腺苷受体介导的BBB通透性增加是通过暂时性开启内皮细胞间紧密连接（TJs) 而实现的。该途径不但具有非侵入性、递药效率高及不受药物分子量影响等优点，而且该可 逆过程对BBB结构、功能影响较小，BBB功能的恢复能够将其通透性增加带来的副作用降到 最低。Regadenason (Lexi scan6)作为心肌灌注成像造影剂于2008年被FDA批准临床使用， 其主要成分2- (N-吡唑基）-腺苷衍生物可特异性激活腺苷A2a受体。与非特异性激动剂 如腺苷相比，Regadenason不但更高效地调节BBB通透性，还能有效避免非特异性腺苷受体 激活引起的支气管痉挛等副作用。因此基于腺苷A 2a受体介导的跨BBB递药方法具有重要 的科研及临床意义。
[0004] 有研究发现改变标记在纳米探针上的Angiopep-2肽的数目可以调控低密度脂蛋 白受体相关蛋白（LRP)参与的受体介导转胞吞跨BBB效率。另外，Jacobson等也发现多位 点标记的受体激动剂能够有效提高纳米粒对腺苷受体的选择性和激动效率。由于诊断或治 疗药物分子量、表面电荷和极性差异很大，针对目标药物药动学性质调控BBB开启时间窗 口将可能提高药物入脑效率，同时避免药物血液停留时间与BBB开启时间窗口不匹配带来 的毒副作用。因此，本申请的发明人拟改变探针载体上激动剂标记数目以调节BBB开启时 间窗口，从而实现不同类型药物的跨BBB入脑效率。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是在于提供修饰腺苷受体激动剂纳米探针及其制备方法和用途。以 期实现对脑部疾病的高效、安全、可调控递药。本发明中，所述纳米探针能够根据不同药物 药代动力学性质调控BBB的开启时间，实现颅内递药高效性和安全性的最大化。
[0006] 与小分子相比，纳米载体在肿瘤诊断和治疗过程中具有被动靶向性，血液循环时 间可调和多位点效应等优点。为调节BBB开启时间窗口，本发明构建了基于腺苷A2A受体 激动剂的纳米探针。其通式如下：
[0007] IR783-Den_(PEG-Reg)x
[0008] 通式中Den为探针载体第五代聚酰胺-胺型树枝状聚合物（Dendrimer)5PEG为分 子量为10-40k的聚乙二醇；IR783为羰花青类近红外荧光基团，Reg为腺苷A 2a受体激动剂 Regadenason, X代表修饰在纳米探针上腺苷受体激动剂数目。
[0009] 更具体的，本发明的修饰腺苷受体激动剂纳米探针可调节血脑屏障通透性，其由 以下四个功能部分组成：
[0010] (1)作为探针载体的第五代聚酰胺-胺型树枝状高分子Dendrimer，具有分子量及 物理尺寸均一、形貌规整、粒径合适（?7nm)、低毒及易于标记（128个伯胺基）等优点；
[0011] (2)探针上修饰的聚乙二醇链既能够将腺苷A2a受体激动剂桥连到载体上，降低激 动剂与受体作用的空间位阻，又可以提高纳米探针的生物相容性，延长其的血液循环时间， 减少其被肝脏和脾脏中网状内皮系统吞噬；
[0012] (3)近红外荧光基团IR783,具有穿透能力强、光稳定性好、吸光系数和量子产率 高等优点；IR783可以通过N-羟基琥珀酰亚胺基直接标记在载体表面；IR783的分子式如 下所示：
[0013]
【权利要求】
1. 修饰腺苷受体激动剂纳米探针，其通式如下： IR783-Den-(PEG-Reg)X 通式中，Den为探针载体第五代聚酰胺-胺型树枝状聚合物（Dendrimer) ;PEG为分子 量为10-40k的聚乙二醇；IR783为羰花青类近红外荧光基团，Reg为腺苷A2a受体激动剂 Regadenason, X代表修饰在纳米探针上腺苷受体激动剂数目。
2. 如权利要求1所述的修饰腺苷受体激动剂纳米探针，其特征在于，所述的腺苷A2a受 体激动剂Regadenason通过其氨基衍生物Reg-NH 2与双功能聚乙二醇键连标记到载体分子 上，Reg-NH2的分子式如下所示：
3. 如权利要求1所述的修饰腺苷受体激动剂纳米探针，其特征在于，Reg-NH2通过双功 能聚乙二醇[马来酰亚胺-聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺酯（Mal-PEG-NHS)]连接到载体 分子上，Mal-PEG-NHS的分子式如下所不：
4. 如权利要求1所述的修饰腺苷受体激动剂纳米探针，其特征在于，所述的载体材料 Den为第五代聚酰胺-胺型树枝状聚合物，每分子载体连接激动剂的数目为1-40个。
5. 如权利要求1所述的修饰腺苷受体激动剂纳米探针，其特征在于，所述的载体材料 Den为第五代聚酰胺-胺型树枝状聚合物，每分子载体连接激动剂的数目为1，4,8或16个。
6. 权利要求1的修饰腺苷受体激动剂纳米探针的制备方法，其特征在于，其包括步骤： 步骤1 :制备Reg-NH2 2, 6-二氯嘌呤核苷溶于氨饱和甲醇溶液中，80°C搅拌反应过夜，旋蒸除去溶剂，产物过 硅胶柱纯化，其中二氯甲烷：甲醇=9:1，得2-氯腺嘌呤核苷；将2-氯腺嘌呤核苷与一水合 肼室温搅拌反应l〇h，旋蒸除去未反应的肼，产物过硅胶柱纯化，其中二氯甲烷：甲醇=5:1， 得2-肼基腺嘌呤核苷；将2, 2-二甲酰基乙酸甲酯加入2-肼基腺嘌呤核苷的乙醇混悬液中 回流反应2h得缩合产物；经硅胶柱纯化，其中二氯甲烷：甲醇=5:1，的缩合产物加入I. OM 氢氧化钾甲醇溶液中室温搅拌反应12h，酯键断裂得羧酸衍生物；羧酸衍生物与N-叔丁氧 撰基-乙二胺缩合得叔丁氧撰基保护的广物Reg-NH 2-Boc ;Reg_NH2-Boc在二氟乙酸和二氯 甲烷1:1的溶液中搅拌反应4h，脱保护得Reg-NH 2, Reg-NH2在甲醇中重结晶纯化； 步骤2 :制备参比探针IR783-Den-(PEG)x 将载体材料Den溶于IX PBS (pH7. 4)中，滴加入聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺酯的 DMF溶液，室温搅拌反应2h，将反应液用截留分子量为IOkDa的超滤管超滤纯化3次，除去 原料和副产物，浓缩液冷冻干燥得Den-PEG ;适量Den-PEG溶于05M4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓 冲液（HEPES，pH8. 3)中，逐滴加入IR783-N-羟基琥珀酰亚胺酯（IR783-NHS)的DMF溶液， 室温搅拌反应2h，将反应液用截留分子量为IOkDa的超滤管超滤纯化3次，除去原料和副产 物，浓缩液冷冻干燥得绿色产物即为参比探针IR783-Den-(PEG) X，X代表修饰在探针上PEG 基团的数目； 步骤3 :制备目标探针IR783-Den-(PEG-Reg) X Reg-NH2溶于无水DMF中.加入三乙胺（TEA)，与溶于DMF的Mal-PEG-NHS混合，室 温搅拌反应2h ;IR783-Den-PEG溶于05M4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液（HEPES，pH8. 3) 中，将DMF混合液滴入此溶液中，室温搅拌反应过夜；将反应液用截留分子量为IOkDa 的超滤管超滤纯化3次，除去原料和副产物，浓缩液冷冻干燥得绿色产物即目标探针 IR783-Den-(PEG-Reg)X。
7. 权利要求1的修饰腺苷受体激动剂纳米探针在制备有序调控对血脑屏障开启时间 窗口中的用途，其中通过调节探针表面腺苷受体激动剂的标记数目实现所述的有序调控。
8. 按权利要求7所述的用途，其特征在于所述的有序调控是根据不同药物的药动学性 质，调节血脑屏障开启的时间窗口，实现不同类型药物或诊断试剂跨血脑屏障递送。
【文档编号】A61K31/7076GK104511026SQ201310456086
【公开日】2015年4月15日 申请日期:2013年9月29日 优先权日:2013年9月29日
【发明者】李聪, 高西辉, 钱隽 申请人:复旦大学