一种獐芽菜苷鞘磷酸一胺醇受体拮抗剂的抗炎用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及獐芽菜苷对鞘氨醇-1-磷酸1受体拮抗剂的抗炎用途。
【背景技术】
[0002] S1P 受体（sphingosine-1-phosphate receptor，S1PR)是 G 蛋白偶联受体家族成 员之一，包括S1P1~S1P5,主要与G蛋白α亚型偶联发挥作用。
[0003] 炎症是具有血管系统的活体组织对损伤因子所发生的防御反应为炎症。血管反应 是炎症过程的中心环节。炎症是临床常见的一个病理过程，可以生于机体各部位的组织和 各器官。急性炎症平时具有红、肿、热、痛、机能掩藏等变化，同随时常伴有发热、白细胞增多 等全身反应。是机体对于刺激的一种防御反应。
[0004] 炎症的产生实质上是机体与致炎因子进行抗争的反映。这种分歧抗争贯穿炎症过 程的始终。致炎因子作用于机体后，一方面引发组织细胞的损坏，使局部组织细胞显现变 性、坏死；另一方面，诱导机体抗病机能增加，以益于清除致炎因子，使受损组织得到修复， 从而使机体的内环境以及内环境和外环境之间达到新的均衡。S1PR通过激活多条细胞内信 号途径发挥不同的生物学功能，包括调节细胞迀移、增殖、凋亡及细胞内钙离子动员、炎症 因子和黏附分子表达，以及调控血管发生、血管紧张度和通透性等，进而对心血管系统发挥 重要影响。S1P1广泛表达于各种组织和细胞，在保持血管通透性等方面具有协调作用。
[0005] 目前研究认为鞘氨醇-1-磷酸受体拮抗剂与多种细胞表面相应受体结合，在免疫 调节方面具有促进淋巴细胞归巢、抑制淋巴细胞外流，诱导淋巴细胞凋亡，并能影响树突状 细胞及调节性Τ细胞功能另小鼠实验显示S1P1在血管重建、神经形成、免疫细胞迀移、内皮 细胞屏障功能等方面发挥重要作用。所以建立S1P1拮抗剂筛选模型对治疗炎症和心血管 等疾病具有重要意义。
【发明内容】
[0006] 本发明在采用鞘氨醇-1-磷酸1受体拮抗剂高通量筛选模型，通过功能性验证寻 找先导化合物，发现了一类二咖啡酰基奎尼酸类鞘氨醇-1-磷酸1受体拮抗剂，为新型的抗 炎药开发提供先导化合物。本发明可为此类临床抗炎治疗药物的开发提供先导化合物，为 新型抗炎药物开发提供线索和实验依据。
[0007] 本发明的技术方案为：在中国仓鼠卵巢癌细胞（CH0)内稳定转染鞘氨醇-1-磷酸 1受体，建立鞘氨醇-1-磷酸1受体拮抗剂靶向激动剂高通量筛选模型，初筛，复筛，构效关 系分析，得到一类具有抗炎作用的候选药物。具体步骤如下：
[0008] 步骤一：建立及培养稳定转染鞘氨醇-1-磷酸1受体的CH0细胞株。
[0009] 步骤二：激动剂模型建立及阳性药验证，确定激动剂的ECS。。
[0010] 步骤三：拮抗剂模型建立及阳性性药验证。
[0011] 步骤四：采用稳转细胞株和实验确定的最佳检测条件对化合物进行鞘氨醇-1-磷 酸1受体拮抗剂的高通量筛选，得到有明显量效关系的化合物。
【附图说明】：
[0012] 图1 :激动剂量效曲线
[0013] 图2 :诘抗剂量效曲线
[0014] 图3 :先导化合物量效曲线
【具体实施方式】
[0015] 1.实验材料
[0016] (1)完全培养：DMEM ;10% FBS ;100U/mL Penicillin ;100 μ g/mL Str印tomycin ; 1000 yg/mL G418〇
[0017] (2)Stimulation Buffer(SB):含 ImM IBMX 的 DMEM〇
[0018] (3)主要仪器：C02培养箱；384 孔板；Paradigm ? Detection Platform。
[0019] 2.建立及培养稳定转染鞘氨醇-1-磷酸1受体的CH0鞘氨醇-1-磷酸1细胞株。
[0020] 3.最佳细胞数确定
[0021] (1)配制Forskolin梯度稀释液：需要用Forskolin对细胞进行刺激，所以应将 Forskolin储备液逐级稀释为最终浓度的2倍。
[0022] (2)配制不同浓度的细胞稀释液：用SB将1. (7)中重悬好的细胞分别稀释为 200cells/yL、400cells/yL及 800cells/yL。
[0023] (3)加样：将3. (1)中稀释好的Forskolin溶液按每个浓度2个复孔，5 μ L每孔加 入384孔板中，再加入2孔每孔各5 yL的SB作为cell negative control (CNC)。接着向 不同浓度的Forskolin溶液及CNC中加入3. (2)配制好的不同浓度的细胞稀释液各5 μ L。 将384孔板在500rpm下离心15s，使10 μ L试剂混合均匀以充分反应。为防止试剂蒸发造 成损失，将TopSeal-A膜贴于板面并将板放于室温下使之孵育45min。
[0024] (4)终止试剂：用 Lysis buffer (LB)将 cAMP-d2 稀释 40 倍，将 anti-cAMP 稀释 20 倍。取适量LB与稀释好的anti-cAMP溶液按1 : 1混合，向CNC中每孔各加入10 μ L ;将 剩余cAMP-d2溶液与anti-cAMP溶液按1 : 1混匀后加入到其余各孔，每孔10 μ L。将384 孔板在500rpm下离心15s，使20 μ L试剂混合均匀以充分反应。重新贴上TopSeal-A膜并 将板放于室温下继续孵育60min。
[0025] (5)检测：孵育时间到达后，揭去TopSeal-A膜，将板放于设定好程序的Paradigm? Detection Platform上检测。处理数据，确定最佳细胞数及Forskolin的ECS。。
[0026] 4.激动剂模型建立及阳性药验证，确定激动剂的ECS。：
[0027] (1)S1P1激动剂CS 2100使用DMS0配制成5mM储备液，因 S1P1偶联Ga i，需加入 Forskolin刺激cAMP产生。首先根据3. (5)中Forskolin的ECS。配制FSB，再用FSB逐级 稀释为最终浓度的2倍。
[0028] (2)配制含最佳细胞数的溶液：用SB将细胞稀释为3. (5)中得到的最佳细胞浓 度。
[0029] (3)加样：将4. (1)中稀释好的CS 2100溶液按每个浓度2个复孔，5 μ L每孔加入 384孔板中，再加入4孔每孔各5 μ L的SB，其中2孔作为CNC，另2孔作为non-stimulated contro 1 (NSC)。将4. (2)配制的细胞溶液按每孔5 μ L加入384孔板中。将384孔板在500rpm 下离心15s，使10 μ L试剂混合均勾以充分反应。为防止试剂蒸发造成损失，将TopSeal-A 膜贴于板面并将板放于室温下使之孵育45min。
[0030] (4)按3.⑷配制终止试剂。向CNC中每孔加入10 μ L LB/anti-cAMP溶液（1 : 1)， 向NSC及其余各孔每孔加入10yL cAMP-d2/anti-cAMP溶液（1 : 1)。将384孔板在500rpm 下离心15s使20 μ L试剂混合均匀以充分反应。重新贴上TopSeal-A膜并将板放于室温下 继续孵育60min。
[0031 ] (5)孵育时间到达后，揭去TopSeal-A膜，将板放于设定好程序的Beckman Paradigm上检测。处理数据，确定CS 2100的EC5。及EC s。。
[0032] 5.拮抗剂验证
[0033] (1) S1P1拮抗剂W146使用1Μ NaOH溶液配制成10mM储备液，以SB逐级稀释为最 终浓度的4倍。
[0034] (2)配制含最佳细胞数的溶液：用SB将细胞稀释为3. (5)中得到的最佳细胞浓 度。
[0035] (3)加样：将5. (1)中稀释好的W146溶液按每个浓度2个复孔，2. 5 μ L每孔加入 384孔板中，再加入4孔每孔各5 μ L的SB，其中2孔作为CNC，另2孔作为NSC，再加入2孔 每孔各2.5 yL的SB，作为cell positive control (CPC)。将5. (2)配制的细胞溶液按每 孔5 μ L加入384孔板中。将384孔板在500rpm下离心15s，使7. 5 μ L试剂（CNC及NSC为 10 μ L)混合均匀以充分反应。为防止试剂蒸发造成损失，将TopSeal-A膜贴于板面并将板 放于室温下使之孵育30min。
[0036] (4)根据 3. (5)中 Forskolin 的 ECS。配制 FSB，用 FSB 按 4. (5)中 CS 2100 的 EC 80配制CS 2100溶液。向CPC中加入FSB，每孔2.5 yL;其余各孔加入CS 2100溶液，每孔 2. 5 μ L ;CNC及NSC不加操作。将384孔板在500rpm下离心15s，使10 μ L试剂混合均勾以 充分反应。重新贴上TopSeal-A膜并将板放于室温下继续孵育45min。
[0037] (5)按3.⑷配制终止试剂。向CNC中每孔加入10 μ L LB/anti-cAMP溶液（1 : 1)， 向吧(：、0?(：及其余各孔每孔加入1(^1^〇41^-(12/^1^1-〇41^溶液（1:1)。将384孔板在 500rpm下离心15s使20 μ L试剂混合均匀以充分反应。重新贴上TopSeal-A膜并将板放于 室温下继续孵育60min。
[0038] (6)孵育时间到达后，揭去TopSeal-A膜，将板放于设定好程序的Paradigm? Detection Platform上检测。处理数据，确定诘抗剂的IC5。。
[0039] 6.采用摸索的最佳检测条件在稳转细胞中对鞘氨醇-1-磷酸1受体拮抗剂进行初 筛与复筛。处理数据，计算所筛选化合物IC5。。对筛选出的有效的化合物进行构效关系分 析。
[0040] 鞘氨醇-1-磷酸1受体活性筛选实验结果
[0041 ] 筛选得到的鞘氨醇-1-磷酸1受体拮抗剂为獐芽菜苷化合物，其结构式与1(：5。如 下：
[0042]
[0043] 先导化合物对鞘氨醇-1-磷酸1受体拮抗活性：
【主权项】
1. 式（I)的化合物或其药学上可以接受的盐用于制备鞘氨醇-1-磷酸1受体拮抗剂的 用途；2. 按照权利要求1的用途，作为鞘氨醇-1-磷酸1受体拮抗剂，用于治疗炎症的用途。
【专利摘要】本发明涉及式(I)的鞘氨醇-1-磷酸1受体拮抗剂或其药学上可接受的盐。此类化合物可以拮抗鞘氨醇-1-磷酸1受体，有效地产生抗炎作用。
【IPC分类】A61K31/7048, A61P29/00
【公开号】CN105287615
【申请号】CN201510828310
【发明人】严明, 汪豪, 高鹏, 张陆勇
【申请人】中国药科大学
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年11月20日