一种天然免疫佐剂及其疫苗组合物和制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种天然免疫佐剂及其疫苗组合物和制备方法。所述天然免疫佐剂是至少包含皂甙和蜂胶两种组分的复方佐剂，将皂甙溶于水配制皂甙溶液，将蜂胶溶于95%的乙醇配制蜂胶乙醇溶液，然后将皂甙溶液与抗原按比例混匀，再加入蜂胶乙醇溶液或用水稀释后的蜂胶溶液，得到所述疫苗组合物。本发明首次将皂甙和蜂胶按一定比例配伍，并采用独特工艺制备成天然复方佐剂，与单一成分天然佐剂相比极大地提高了免疫反应水平，增强了免疫效果。
【专利说明】一种天然免疫佐剂及其疫苗组合物和制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及动物疫苗领域,特别涉及动物疫苗佐剂。
【背景技术】
[0002]“Adjuvant”，即佐剂，最早来源于希腊语“adjuvare”，也就是帮助的意思。免疫佐剂是指与抗原同时或预先应用，能增强机体针对抗原的免疫应答能力，或改变免疫反应类型的物质。常用的免疫佐剂很多，有油乳化剂、金属化合物、天然或人工合成的细菌产物、核酸序列、脂质体和免疫刺激复合物等，但均存在不同缺陷(如免疫效果不理想或毒副作用大等)，限制了其应用和发展。
[0003]目前国内所使用的畜禽疫苗仍以传统油佐剂疫苗为主，存在着免疫效果差、生产工艺复杂、副作用强等一系列严重问题。而天然提取物佐剂以可选择面广，成本低廉，具水溶性，毒性作用小，绿色天然等优点日益受到重视，这类新佐剂疫苗势必将取代传统的油佐剂疫苗。新佐剂疫苗的安全性高，生产设备投资少，生产工艺简单，估计每头份成本不高于现有油佐剂灭活疫苗，如能推广，必将产生巨大的社会、经济效益。
[0004]对于天然提取物佐剂，目前研究较为广泛的物质包括蜂胶、皂甙和各种脂质多糖
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[0005]皂甙(皂苷/皂草苷/皂角苷/皂素/皂苷元/肥皂草素/地奥皂甙)，是从各种天然植物中筛选到具有佐剂活性的成分。大量研究表明:皂甙为目前唯一能使外源性抗原既刺激机体Thl免疫应答，又能诱导CTL应答的佐剂。这一独特的性质使其成为亚单位疫苗、细胞内病原体疫苗及癌症疫苗的理想佐剂。目前应用范围主要包括口蹄疫疫苗、狂犬疫苗等兽用疫苗。
[0006]蜂胶具有广谱的生物学活性，是一种天然的免疫增强剂。应用蜂胶或配合抗原引入机体，既能引起特异性免疫应答，又能启动非特异性防御机制，增加抗体产量，增强补体活性和吞噬细胞的吞噬能力。用蜂胶制成的禽霍乱菌苗具有安全可靠和无毒副作用等优点。蜂胶所含的成分极其复杂，其本身是否有抗原性值得注意。波兰的一些学者研究表明，蜂胶本身无明显抗原性和过敏性，毒性作用较小。
[0007]但这些佐剂成分在现有制备技术下作为抗单独使用存在着诱导免疫反应产生水平低，免疫保护效果差等一系列问题。
【发明内容】
[0008]针对目前天然佐剂的不足，本发明的目的在于提供一种天然提取物的复方佐剂，以及利用该天然复方佐剂制备的疫苗组合物，以提高疫苗的免疫反应水平和免疫保护效
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[0009]为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案:
[0010]一种天然免疫佐剂，包含皂甙和蜂胶。
[0011]本发明的天然免疫佐剂是至少包含皂甙和蜂胶两种组分的复方佐剂，先分别配制皂甙溶液和蜂胶溶液，然后在配制疫苗时将它们与抗原按一定比例混匀，疫苗中皂甙和蜂胶的质量比为1: 0.8~1: 2。
[0012]上述皂甙溶液是将皂甙溶于水并除菌制得；而蜂胶溶液是先将蜂胶溶于95%的乙醇配制蜂胶乙醇溶液，该蜂胶乙醇溶液可直接应用于疫苗配制，也可以进一步用水稀释后再应用于疫苗配制。
[0013]通常，上述蜂胶乙醇溶液中蜂胶的浓度在100_350mg/ml。
[0014]基于上述天然免疫佐剂，本发明提供一种疫苗组合物，包括免疫佐剂和抗原，其中免疫佐剂至少包含皂甙和蜂胶两种天然物质。
[0015]上述疫苗组合物中，阜式的含量为4mg/ml~30mg/ml ;蜂胶的含量为5mg/ml~30mg/ml。 [0016]本发明的疫苗组合物通过下述方法制备得到:
[0017]I)将皂甙用灭菌水配制成一定浓度的皂甙溶液并除菌；
[0018]2)将蜂胶溶于95%的乙醇配制蜂胶乙醇溶液，然后直接或用灭菌水稀释后用于步骤3)；
[0019]3)将步骤I)制得的皂甙溶液与抗原按一定比例混合均匀，然后加入步骤2)制得的蜂
[0020]胶溶液，获得所述疫苗组合物。
[0021]上述步骤2)配制的蜂胶乙醇溶液浓度为100_350mg/ml。
[0022]在配制疫苗时先将皂甙与抗原按一定浓度比例混匀，然后在按一定浓度范围加入处理好的蜂胶乙醇溶液(或稀释后的蜂胶溶液)，混匀后即可，配苗过程不需要乳化，省时省力节约成本。由于本发明佐剂是由两种天然物质按特定浓度配制而成，而两种成分可以配成高浓度的浓缩液，在此情况下，以抗原液为溶质配苗可以大幅提高抗原在疫苗中所占的比例，起到浓缩疫苗的效果，提高了疫苗的免疫反应水平。
[0023]本发明首次将皂甙(皂苷/皂草苷/皂角苷/皂素/皂苷元/肥皂草素/地奥皂甙)和蜂胶按一定比例配伍，并且采用独特加工工艺将其制备成新型的天然复方佐剂，与单一成分天然佐剂相比极大地提高了免疫反应水平，增强了天然佐剂的免疫效果，而且制备过程绿色环保，不破坏佐剂成分的纯天然结构，在国内外尚属首创。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1是实施例1不同佐剂新城疫疫苗免疫鸡后的HI抗体滴度实验结果，其中a、b、c和d分别对应免疫后I周、2周、3周和4周的实验结果。
[0025]图2是实施例2复方天然佐剂新城疫抗原浓缩疫苗免疫鸡后的HI抗体滴度实验结果，其中a、b、c和d分别对应免疫后I周、2周、3周和4周的实验结果。
[0026]图3是实施例3不同浓度的佐剂新城疫疫苗免疫鸡后的HI抗体滴度实验结果，其中a、b、c和d分别对应免疫后I周、2周、3周和4周的实验结果。
【具体实施方式】
[0027]以下实施例仅是说明性的，应该明白，本发明并不受这些实施例的限制。
[0028]实施例1[0029]将提纯蜂胶块(黄酮含量> 98%)20g磨成细粉后，加入95%的乙醇60ml中(此例仅为配比比例)制得浓度为280mg/ml的蜂胶乙醇溶液，使蜂胶颗粒大小均一稳定，取上述溶液IOml缓慢加入低温灭菌水中(温度低于8°C )，并不停搅拌，定容至200ml，其终浓度为14mg/ml作为复合佐剂的蜂胶成分备用。另称取280mg的皂甙,用灭菌水定容为20ml，其终浓度为14mg/ml,除菌过滤后作为佐剂的阜式成分备用。
[0030]为了证明本发明的新型复方天然佐剂免疫效果好于以往天然佐剂，我们以新城疫(ND)灭活疫苗为例，进行免疫学比较，对比佐剂的免疫效果。
[0031]新型复方天然佐剂疫苗配制步骤为:先将上述皂甙成分与灭活新城疫抗原以体积比1: 2进行混合均匀后，再加入I体积的上述蜂胶成分溶液即可完成疫苗配制(A组)，疫苗中的蜂胶和皂甙成分浓度均为7mg/ml，抗原含量占到疫苗体积的50%。同时以单独蜂胶成分佐剂疫苗(B组，蜂胶成分浓度为7mg/ml，抗原含量占到疫苗体积的50%)和单独皂甙成分佐剂疫苗(C组，皂甙成分浓度为7mg/ml，抗原含量占到疫苗体积的50%)为对照。在第O天免疫30日龄SPF鸡(5只/组)，免疫方式为肌肉注射，免疫剂量为0.4ml/只。免疫后第7天、14天、21天、28天采血清测HI抗体滴度，实验结果见图1。结果表明新城疫复方天然佐剂灭活疫苗(A组)免疫后可产生较高水平的HI抗体，并且抗体持续时间长，免疫效果显著高于目前的天然佐剂(B组和C组)。
[0032]实施例2
[0033]本发明的复方佐剂是由两种天然物质按特定浓度配制而成，而两种成分可以配成高浓度的浓缩液，在此情况下，以抗原液为溶质配苗可以大幅提高抗原在疫苗中所占的比例，起到浓缩疫苗的效果， 提高了疫苗的免疫反应水平。为了验证佐剂此项优势进行如下实验:
[0034]将提纯蜂胶块(黄酮含量> 98%)20g磨成细粉后，加入95%的乙醇60ml中(此例仅为配比比例)制得浓度为280mg/ml的蜂胶乙醇溶液，使蜂胶颗粒大小均一稳定，作为复合佐剂的蜂胶成分备用。另称取2800mg的皂甙，用灭菌水定容为10ml，其终浓度为280mg/ml，除菌过滤后作为佐剂的皂甙成分备用。
[0035]在此以新城疫(ND)灭活疫苗为例，进行免疫学比较，对比佐剂的抗原浓缩效果。疫苗配制步骤为:先将上述皂甙成分与灭活新城疫抗原以体积比1: 40进行混合均匀后，再加入I体积的上述蜂胶成分溶液即可完成疫苗配制(A’组)，疫苗中的蜂胶和皂甙成分浓度均为7mg/ml，抗原含量占到疫苗体积的95%。此外设立对照组，对照组疫苗为实施例1中复方佐剂组(A组)，即疫苗中的蜂胶和皂甙成分浓度均为7mg/ml，抗原含量占到疫苗体积的50%。在第O天免疫30日龄SPF鸡(5只/组)，免疫方式为肌肉注射，免疫剂量为0.4ml/只。免疫后第7天、14天、21天、28天采血清测HI抗体滴度，实验结果见图2。结果表明新城疫复方天然佐剂抗原浓缩效果明显，A’组免疫后可产生更高的HI抗体水平，且持续时间更长。
[0036]实施例3
[0037]本发明的复方佐剂是由两种天然物质按特定浓度配制而成，为了说明佐剂的免疫增强效果与佐剂中蜂胶和皂甙浓度之间的关系，进行如下实验:
[0038]将提纯蜂胶块(黄酮含量> 98%)20g磨成细粉后，加入95%的乙醇60ml中(此例仅为配比比例)制得浓度为280mg/ml的蜂胶乙醇溶液，使蜂胶颗粒大小均一稳定，取上述溶液IOml缓慢加入低温灭菌水中(温度低于8°C )，并不停搅拌，定容至100ml，其终浓度为28mg/ml作为复合佐剂的蜂胶成分备用。另称取280mg的皂甙,用灭菌水定容为10ml，其终浓度为28mg/ml，除菌过滤后作为佐剂的皂甙成分备用。将上述皂甙成分与灭活新城疫抗原以体积比1: 2进行混合均匀后，再加入I体积的上述蜂胶成分溶液即可完成疫苗配制(A组)，A组中抗原含量占到疫苗体积的50%，疫苗中的蜂胶和皂甙成分浓度均为14mg/ml，
[0039]取280mg/ml的蜂胶乙醇溶液IOml缓慢加入低温灭菌水中(温度低于8°C )，并不停搅拌，定容至200ml,其终浓度为14mg/ml作为复合佐剂的蜂胶成分备用。另称取280mg的皂甙，用灭菌水定容为20ml，其终浓度为14mg/ml，除菌过滤后作为佐剂的皂甙成分备用。将上述皂甙成分与灭活新城疫抗原以体积比1: 2进行混合均匀后，再加入I体积的上述蜂胶成分溶液即可完成疫苗配制(B组)，B组中抗原含量占到疫苗体积的50%，疫苗中的蜂胶和皂甙成分浓度均为7mg/ml。
[0040]第O天免疫30日龄SPF鸡(5只/组)，免疫方式为肌肉注射，免疫剂量为0.4ml/只。免疫后第7天、14天、21天、28天采血清测HI抗体滴度，实验结果见图3。结果表明新城疫复方天然佐剂抗原浓缩效果明显，A组免疫后可产生更高的HI抗体水平，且持续时间更长。证明在一定浓度范 围内增加佐剂中蜂胶和皂甙成分的浓度可以提高佐剂的免疫增强效果。
【权利要求】
1.一种天然免疫佐剂，包含皂甙和蜂胶。
2.如权利要求1所述的天然免疫佐剂，其特征在于，所述天然免疫佐剂由皂甙和蜂胶两种组分组成，皂甙和蜂胶的质量比为1: 0.8~1: 2。
3.一种疫苗组合物，包括免疫佐剂和抗原，其中免疫佐剂包含皂甙和蜂胶。
4.如权利要求3所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物的免疫佐剂由皂甙和蜂胶两种组分组成，先分别配制皂甙溶液和蜂胶溶液，然后将它们与抗原按一定比例混合均匀，得到所述疫苗组合物。
5.如权利要求 3或4所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物中皂甙和蜂胶的质量比为1: 0.8~1: 2。
6.如权利要求3或4所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物中皂甙的含量为4mg/ml ~30mg/ml,蜂胶的含量为 5mg/ml ~30mg/ml。
7.一种制备权利要求3所述疫苗组合物的方法，包括以下步骤: 1)将皂甙用灭菌水配制成一定浓度的皂甙溶液并除菌； 2)将蜂胶溶于95%的乙醇配制蜂胶乙醇溶液，然后直接或用灭菌水稀释后用于步骤3)； 3)将步骤I)制得的皂甙溶液与抗原按一定比例混合均匀，然后加入步骤2)制得的蜂胶溶液，获得所述疫苗组合物。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤2)配制的蜂胶乙醇溶液浓度为100_350mg/ml。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所用皂甙和蜂胶的质量比为1:0.8~I: 2。
10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述疫苗组合物中皂甙的含量为4mg/ml~30mg/ml,蜂胶的含量为 5mg/ml ~30mg/ml。
【文档编号】A61K36/00GK103520219SQ201310481946
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年10月15日 优先权日:2013年10月15日
【发明者】胡艳欣 申请人:胡艳欣