一种七肽混合物及其在制备贝氏柯克斯体疫苗中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种七肽混合物及其在制备贝氏柯克斯体疫苗中的应用。本发明提供的七肽组合物，由序列表的序列1所示的多肽、序列表的序列2所示的多肽、序列表的序列3所示的多肽、序列表的序列4所示的多肽、序列表的序列5所示的多肽、序列表的序列6所示的多肽和序列表的序列7所示的多肽组成。本发明提供的七肽混合物能够刺激机体产生特异性CD4+T细胞免疫应答对抗贝氏柯克斯体毒株攻击，为具有Q热疫苗功能的保护性抗原。本发明提供的七肽混合物可以通过固相合成的方法制备，操作简便、成本低、产量高。本发明对于贝氏柯克斯体的防控具有重大价值。
【专利说明】一种七肽混合物及其在制备贝氏柯克斯体疫苗中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种七肽混合物及其在制备贝氏柯克斯体疫苗中的应用。
【背景技术】
[0002]贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii)又称贝纳氏柯克斯体,为专性吞曬细胞内寄生的革兰阴性小杆菌，其所致疾病称为Q热(Q fever)。Q热分为急性和慢性两种临床类型。急性Q热表现为急性流感样症状，以头痛、发热、肺炎为主要特征，而慢性Q热主要表现为长期发热，常伴有心内膜炎、肝炎、骨髓炎等。目前已经报道的Q热病例遍及全球各大洲几乎所有国家，成为当前分布最广的人兽共患病之一。贝氏柯克斯体的感染剂量极低，单个病原体即可致病，因此该病原体已被某些国家用作生物武器、还可能被恐怖组织用作生物恐怖剂。
[0003]虽然抗生素治疗对Q热有效，但由于Q热能以气溶胶的形式传播，一旦流行难以控制。另外慢性Q热需要较长的疗程(可长达12个月)，且易复发。因此采用有效的疫苗作预防接种是防止Q热发生和流行的最有效手段。目前已问世的灭活Q热疫苗需要鸡胚大量繁殖贝氏柯克斯体进行制备，但是鸡胚繁殖量低，提取纯化贝氏柯克斯体的防护要求高、工艺复杂、成本昂贵，因此难以大量制备和推广使用。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是 提供一种七肽混合物及其在制备贝氏柯克斯体疫苗中的应用。
[0005]本发明提供的七肽组合物，由序列表的序列I所示的多肽、序列表的序列2所示的多肽、序列表的序列3所示的多肽、序列表的序列4所示的多肽、序列表的序列5所示的多肽、序列表的序列6所示的多肽和序列表的序列7所示的多肽组成。所述七肽组合物中,序列表的序列I所示的多肽、序列表的序列2所示的多肽、序列表的序列3所示的多肽、序列表的序列4所示的多肽、序列表的序列5所示的多肽、序列表的序列6所示的多肽和序列表的序列7所示的多肽的质量配比具体可为1:1:1:1:1:1:1。
[0006]本发明还保护所述七肽组合物在制备贝氏柯克斯体疫苗中的应用。所述疫苗为预防性疫苗。
[0007]本发明还保护一种贝氏柯克斯体疫苗，其活性成分为所述七肽组合物。所述疫苗为预防性疫苗。
[0008]有效的抗贝氏柯克斯体特异性免疫主要是通过激活CD4+T淋巴细胞及其它免疫活性细胞分泌的细胞因子，特别是Y干扰素(IFN-Y)和肿瘤坏死因子(TNF)来激活巨噬细胞及其他免疫效应细胞，增强这些细胞对贝氏柯克斯体的杀伤。本发明提供的七肽混合物能够刺激机体产生特异性CD4+T细胞免疫应答对抗贝氏柯克斯体毒株攻击，为具有Q热疫苗功能的保护性抗原。本发明提供的七肽混合物可以通过固相合成的方法制备，操作简便、成本低、产量高。本发明对于贝氏柯克斯体的防控具有重大价值。【专利附图】
【附图说明】
[0009]图1为七肽混合物刺激贝氏柯克斯体免疫小鼠的⑶4+T细胞的细胞因子表达水平 。
[0010]图2为七肽混合物的免疫保护效果评价。
【具体实施方式】
[0011]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0012]C57BL/6小鼠:军事医学科学院实验动物中心。小鼠组织淋巴细胞分离液:天津TBD公司，货号LTS1092。细胞RPM1-1640培养液:Hyclone公司，货号SH30809。胎牛血清(Fetal bovine serum, FBS):Hyclone 公司，货号 GWH0093。PerCP-标记的仓鼠抗小鼠CD3e单克隆抗体(Ant1-CD3e-PerCP):BD公司，货号347692。APC-标记的大鼠抗小鼠CD4单克隆抗体(Ant1-⑶4-APC):BD公司，货号24531。PE-标记的大鼠抗小鼠IFN-Y单克隆抗体(Ant1-1FN-y-PE):BD公司，货号41772。FITC-标记的大鼠抗小鼠TNF单克隆抗体(Ant1-TNF-a-FITC):BD 公司，货号 41623。莫能霉素(GolgiStop):BD 公司，货号 31509。破膜剂(Perm2):BD公司，货号347692。组织DNA提取试剂盒:Qiagen公司，货号69506。12孔板(12孔细胞培养板)=Costar公司，货号3513。弗氏完全佐剂(CFA) =Sigma公司，产品目录号为F-5881。弗氏不完全佐剂(IFA):Sigma公司，产品目录号为F-5506。7300 RealTime PCR System:Applied Bio systems 公司。
[0013]磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)的制备方法:取NaCl 8.5g、Na2HPO4 ? 12H20 2.86g、NaH2PO4 ? 2H20 0.312g，加MilliQ水溶解并定容至1000ml。T细胞培养液的制备方法:将95ml RPM1-1640培养液与5ml胎牛血清混合，得到T细胞培养液。细胞固定液的制备方法:将Ig多聚甲醛溶于PBS缓冲液并用PBS缓冲液定容至100ml。
[0014]实施例中所用的贝氏柯克斯体为贝氏柯克斯体新桥株(Coxiella burnetii)Xinqiao strain 在文 献 “Wen, B.，S.Yu, G.Yu, Q.Li, and X.Zhang.1991.Analysis ofproteins and lipopolysaccharides from Chinese isolates of Coxiella burnetiiwith monoclonal antibodies.Acta Virol 35:538-544.” 中公开过,公众可在法律及军队相关规定允许的范围内从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得。
[0015]实施例1、七肽混合物的制备
[0016]七种多肽和对照多肽见表1。
[0017]表1七种多肽和对照多肽的氨基酸序列以及其编码基因的序列
[0018]
【权利要求】
1.七肽组合物，由序列表的序列I所示的多肽、序列表的序列2所示的多肽、序列表的序列3所示的多肽、序列表的序列4所示的多肽、序列表的序列5所示的多肽、序列表的序列6所示的多肽和序列表的序列7所示的多肽组成。
2.如权利要求1所述的七肽组合物，其特征在于:序列表的序列I所示的多肽、序列表的序列2所不的多妝、序列表的序列3所不的多妝、序列表的序列4所不的多妝、序列表的序列5所示的多肽、序列表的序列6所示的多肽和序列表的序列7所示的多肽的质量配比
3.权利要求1或2所述七肽组合物在制备贝氏柯克斯体疫苗中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于:所述疫苗为预防性疫苗。
5.一种贝氏柯克斯体疫苗，其活性成分为权利要求1或2所述七肽组合物。
6.如权利要求5所述的疫苗，其特征在于:所述疫苗为预防性疫苗。
【文档编号】A61P31/04GK103638518SQ201310565892
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年11月14日 优先权日:2013年11月14日
【发明者】熊小路, 温博海, 齐永, 焦俊, 龚文平, 段长松 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所