仁青常觉在制备治疗前列腺癌药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了仁青常觉在制备治疗前列腺癌药物中的应用。仁青常觉是中华人民共和国2010年版药典一部记载的药品名称，仁青常觉系藏族验方，由珍珠、朱砂、檀香、降香、沉香、诃子、牛黄、人工麝香、西红花等一百余味药组成，功能为清热解毒、调和滋补。本发明克服了上述应用方面的技术偏见，通过药理实验发现，仁青常觉的石油醚提取物体外对前列腺癌细胞有较好的抑制作用，其效果与顺铂相当或略优；仁青常觉的多种提取物的含药血清体外对前列腺癌也均有显著的抑制作用。
【专利说明】仁青常觉在制备治疗前列腺癌药物中的应用
[0001]
【技术领域】
[0002]本发明涉及仁青常觉在制备治疗前列腺癌药物中的应用，属于医药领域。
【背景技术】
[0003]前列腺癌是男性生殖系最常见的恶性肿瘤，仅次于肺癌，在男性是癌症死亡的第二位。前列腺癌发病随年龄而增长，其发病率有明显的地区差异，我国以前发病率较低，但由于人口老龄化，近年来发病率有所增加。
[0004]仁青常觉是中华人民共和国2010年版药典一部记载的药品名称。
[0005]仁青常觉系藏族验方，成方于公元八世纪，最早是藏王、班禅、达赖以及达官贵人专用药，历经一千多年的应用历史，现如今，仁青常觉收载于《中国药典》(2010版)一部中。仁青常觉由珍珠、朱砂、檀香、降香、沉香、诃子、牛黄、人工麝香、西红花等一百余味药组成，功能为清热解毒、调和滋补。用于“隆、赤巴、培根”各病，陈旧性胃肠炎、溃疡，“木布”病，萎缩性胃炎，各种中毒症；梅毒，麻风，陈旧热病，炭疽，疖痛，干黄水，化脓等。现代药效学研究结果表明，本品具有抗炎、抑制溃疡形成、促进溃疡愈合等作用。急性毒性试验，长期毒性试验结果表明，本品无明显毒性。临床应用结果表明，本品治疗消化系统疾病，如各种急慢性胃炎、慢性萎缩性胃炎、消化性溃疡、肝硬化、化疗后消化道不良反应等方面显示良好疗效，并且有良好的保健作用，是藏医保健药品之一。
[0006]在仁青常觉的应用治疗领域，人们熟知其清热解毒、调和滋补的作用，熟知其用于“隆、赤巴、培根”各病，陈旧性胃肠炎、溃疡，“木布”病，萎缩性胃炎，各种中毒症；梅毒，麻风，陈旧热病，炭疽，疖痛，干黄水，化脓等的治疗。仁青常觉的功能主治、文献、专利等方面均未发现其可用于治疗前列腺癌的研究`。
【发明内容】
[0007]本发明目的是提供仁青常觉在制备治疗前列腺癌药物中的应用。
[0008]本发明的技术方案如下:
仁青常觉在制备治疗前列腺癌药物中的应用。
[0009]所述的仁青常觉是按其配方药材制备活性成分后制成的药学制剂。
[0010]所述的活性成分为仁青常觉配方药材的石油醚提取物、乙醇提取物或水提取物中的一种或多种，其中:
所述的石油醚提取物按如下方法制备:取仁青常觉研细后的细粉或其配方药材，加入体积重量比6倍的石油醚沸腾提取3次，每次I小时，40°C -50°C减压回收石油醚，即得；所述的乙醇提取物是按如下方法制得的:取仁青常觉研细后的细粉或其配方药材，加入体积重量比8倍的乙醇提取3次，每次1.5小时，50°C -60°C减压回收乙醇，干燥，即得；所述的回收乙醇的工艺参数为-0.07^-0.09Mpa，产品减压干燥的工艺参数为70°C, -0.08~-0.09Mpa ；
所述的水提取物是按如下方法制得的:取仁青常觉研细后的细粉或其配方药材，加入体积重量比8倍的水煎煮2次，每次2小时，滤过，滤液蒸干，即得。
[0011]所述的药学制剂为浓缩丸、糖衣片、薄膜包衣片或胶囊制剂。
[0012]所述的仁青常觉与化学药或中药或天然药物在制备治疗前列腺癌药物中的应用。
[0013]本发明中体积重量的单位对应关系为ml/g或1/kg。
[0014]有益效果:本发明克服了仁青常觉应用方面的技术偏见，通过药理实验发现，仁青常觉石油醚提取物体外对前列腺癌细胞有较好的抑制作用，其效果与顺钼相当或略优；而仁青常觉的水提取物的含药血清体外对前列腺癌也均有显著的抑制作用(p〈0.05)。
【具体实施方式】
[0015]下述实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。[0016]实验例1、仁青常觉各提取物的制备
一、样品
仁青常觉，青海金诃藏药药业股份有限公司生产，批号:20100707
二、方法和步骤
1、石油醚提取物:取仁青常觉研细后的细粉50g，加入体积重量比为6倍的石油醚600C~90°C沸腾提取3次，每次I小时。400C _50°C减压回收石油醚，得石油醚提取物2.71g。
[0017]2、乙酸乙酯提取物:取石油醚提取后的药渣，挥尽石油醚，加入体积重量比为6倍的乙酸乙酯进行沸腾提取3次，每次I小时。50°C -60°C减压回收乙酸乙酯，得乙酸乙酯提取物7.66g。
[0018]3、乙醇提取物:取乙酸乙酯提取后的药渣，挥尽乙酸乙酯，加入体积重量比为8倍的乙醇提取3次，每次1.5小时，50°C _60°C减压回收乙醇，干燥，得乙醇提取物4.68g。
[0019]4、水提取物:取乙醇提取后的药渣，加入体积重量比为8倍的水煎煮2次。每次2小时，滤过，滤液蒸干，得水提取物4.76g。
[0020]本发明中体积重量的单位对应关系为ml/g或1/kg，其它未特别说明的均为药学生产上惯用的参数或方法。
[0021]实验例2、仁青常觉对前列腺癌的抑制作用
一、实验原理
MTT 分析法以活细胞代谢物还原剂 3-(4, 5)_dimethylthiahiazo (_z_yl)_3，5_d1-phenytetrazoliumromide, MTT噻唑蓝为基础。MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下，tetrazolium环开裂,生成蓝色的formazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比(死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原)。还原生成的formazan结晶可在含50%的N，N- 二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠(pH 4.7)的MTT溶解液中溶解，利用酶标仪测定490 nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。
[0022]二、药物及试剂 1、动物
SPF级健康昆明种小鼠90只，体重30±2g，由山东鲁抗医药股份有限公司新实验动物提供，动物合格证号=SCXK鲁20130001。
[0023]2、实验细胞
前列腺癌(pc3)细胞，由山东省立医院提供。
[0024]3、实验药物
实验药物:实验例I制备的仁青常觉各提取物，各加生理盐水配制成500ml的混悬液。
[0025]阳性对照药物:顺钼，(齐鲁制药有限公司，批号:1010041DC)
试剂:1640细胞培养基(Hyclone，赛默飞世尔生物化学制品北京有限公司)；胎牛血清(Hyclone，赛默飞世尔生物化学制品北京有限公司)；胰酶细胞消化液(碧云天)，青霉素链霉素混合液双抗，注射用顺钼(齐鲁制药有限公司，批号:1010041DC)。
[0026]4、实验仪器
立式压力蒸汽灭菌锅(LDZX-50FBS，上海申安)；双人单面净化工作台(SW-CJ-1C，苏州净化)；二氧化碳培养箱(BB16UV/BB5060UV，HERAEUS);台式离心机(H3，Sigma);酶标仪(Multiskan MK3, Thermo Scientific);电热恒温鼓风干燥箱(101,上海鹏顺科学仪器有限公司)；倒置显微镜(XDS-1B，重庆光学仪器厂)；水浴恒温振荡器(SHZ-82，金坛市医疗仪器厂)；移液器(Gilson, Eppendorf);培养瓶(Corning) ；96 孔板(Costar, USA)
二、实验方法
1、仁青常觉体外对前列腺癌细胞的抑制作用实验 (I)细胞复苏和培养
从超低温冰箱中取冻存的前列腺癌(pc3)细胞，迅速投入预先加热到37°C的灭菌水中，待冻存液溶化后，2000r/min离心三分钟，收集细胞。然后以含10%胎牛血清的1640新鲜培养基在37°C、5%C02培养箱中培养。
[0027]待细胞生长至80%融合时，以0.25%的胰酶细胞消化液(含0.0296EDTA)进行消化，以I X IOm个细胞每孔接种于96孔板中，预留三个调零孔，调零孔只加不含血清的1640培养基，不加细胞。
[0028](2)加药
待96孔板中的细胞长满单层后，弃掉培养基，调零组、空白对照组加100μ I不含血清的1640培养基，阳性对照组加10 μ g/ml顺钼100 μ I。其他给药组每孔分别加入含梯度稀释浓度的筛选药物的1640培养基100 μ 1，加药一排。然后细胞在37°C、5%C02培养箱中继续培养24h，所加药物浓度为折算后的仁青常觉原药浓度。
[0029](3)测定
MTT法测定细胞存活率:在每孔加入5mg/mlMTT溶液20 μ I于培养箱内避光反应4 h。然后加入100 μ I DMSO用酶标仪于492nm测定OD值，计算抑制率:细胞生长抑制率=(对照组吸光度平均值一实验组吸光度平均值)/对照组吸光度平均值X 100%。
[0030]2、仁青常觉含药血清体外对前列腺癌细胞的抑制作用实验
(I)细胞复苏和培养
从超低温冰箱中取冻存的前列腺癌(pc3)细胞，迅速投入预先加热到37°C的灭菌水中，待冻存液溶化后，2000r/min离心三分钟，收集细胞。然后以含10%胎牛血清的1640新鲜培养基在37°C、5%C02培养箱中培养。
[0031](2)含药血清的制备昆明种小鼠90只，随机分为6组，空白对照组、顺钼组、仁青常觉石油醚提取物组、仁青常觉乙酸乙酯提取物组、仁青常觉乙醇提取物组、仁青常觉水提取物组，每组15只。仁青常觉各提取物组的给药浓度相当于IOmg仁青常觉原药/ml，顺钼组给药浓度为10 μ g/ml。各组小鼠连续灌胃3天，每天每只0.5ml，相当于人体最大建议剂量的100倍。其中空白对照组给予生理盐水。最后一天灌胃后I小时，10%水合氯醛麻醉，腹主动脉取血，3000转/min离心，取上层血清，_80°C保存。同组血清混合，0.22 μ m微孔滤膜过滤除菌于备用。
[0032](3) MTT法测定含药血清对不同肿瘤细胞生长的抑制状况
将CO2培养箱中培养的前列腺癌(PC3)细胞，以0.25%的胰酶细胞消化液(含
0.02%EDTA)进行消化，以IX IOm个细胞每孔接种于96孔板中，预留三个调零孔，调零孔只加不含血清的1640培养基，不加细胞。待96孔板中的细胞长满单层后，弃掉培养基，调零组、空白对照组加100 μ I不含血清的1640培养基，每孔分别加入含药血清的1640培养基100 μ 1，每个浓度的药物加6孔。然后细胞在37°C、5%C02培养箱中继续培养24h。加入5mg/mlMTT溶液20 μ I于培养箱内避光反应4 h。然后加入100 μ I DMSO用酶标仪于492nm测定OD值，计算抑制率:细胞生长抑制率=(对照组吸光度平均值一实验组吸光度平均值)/对照组吸光度平均值X 100%。
[0033]四、实验结果
所有数据均以(X土SD)显示,采用GraphPad Prism 5软件分析处理数据,利用t检验观察各组与空白组之间 是否存在显著性差异，P〈0.05为差异显著。
[0034]1、仁青常觉体外对前列腺癌细胞的抑制作用实验
对各种药物进行IC50计算，IC50值低于250 μ g/ml的药物进行验证。验证后的所有数据以X土SD表示，t检验比较组间差异的显著性，P〈0.05为差异显著。
[0035]IC50值低于250 μ g/ml的药物为:仁青常觉石油醚提取物，IC50值为68.74 μ g/ml。其他药物IC50值偏大或者对癌细胞没有抑制作用，不再做验证试验。
[0036]表1、不同提取物对前列腺癌细胞的抑制率(n=6，土SD)
【权利要求】
1.仁青常觉在制备治疗前列腺癌药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的仁青常觉在制备治疗前列腺癌药物中的应用，其特征在于，所述仁青常觉是按其配方药材制备活性成分后制成的药学制剂。
3.根据权利要求2所述的仁青常觉在制备治疗前列腺癌药物中的应用，其特征在于，所述的活性成分为仁青常觉配方药材的石油醚提取物、乙醇提取物或水提取物中的一种或多种，其中: 所述的石油醚提取物按如下方法制备:取仁青常觉研细后的细粉或其配方药材，加入体积重量比为6倍的石油醚沸腾提取3次，每次I小时，40°C -50°C减压回收石油醚，即得； 所述的乙醇提取物是按如下方法制得的:取仁青常觉研细后的细粉或其配方药材，加入体积重量比为8倍的乙醇提取3次，每次1.5小时，50°C -60 °C减压回收乙醇，干燥，即得；所述的回收乙醇的工艺参数为-0.07^-0.09Mpa，产品减压干燥的工艺参数为70°C, -0.08~-0.09Mpa ； 所述的水提取物是按如下方法制得的:取仁青常觉研细后的细粉或其配方药材，加入体积重量比为8倍的水煎煮2次，每次2小时，滤过，滤液蒸干，即得； 所述的体积重量的单位对应关系为ml/g或1/kg。
4.根据权利要求2所述的仁青常觉在制备治疗前列腺癌药物中的应用，其特征在于，所述的药学制剂为浓缩丸、糖衣片、薄膜包衣片或胶囊制剂。
5.根据权利要求1-4任一项所述的仁青常觉在制备治疗前列腺癌药物中的应用，其特征在于，所述的仁青常觉与化学药或中药或天然药物在制备治疗前列腺癌药物中的应用。
【文档编号】A61K35/56GK103610849SQ201310684013
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年12月9日 优先权日:2013年12月9日
【发明者】王海苹, 邵成雷, 姬涛, 张栋, 王京凯 申请人:山东阿如拉药物研究开发有限公司