用于调节基因表达的寡核苷酸及其用途

用于调节基因表达的寡核苷酸及其用途
【专利摘要】本发明涉及用于调节基因表达的寡核苷酸，特别是用于调节负责遗传、肿瘤或病毒来源的病状的基因。此外，本发明涉及所述寡核苷酸用于所述疾病的治疗和/或诊断的用途，所述寡核苷酸可能是化学修饰的。
【专利说明】用于调苄基因表达的寡核苷酸及其用途
[0001]说明书
[0002]本发明涉及用于调苄基因表达的寡核苷酸，特别是用于调节负责遗传、肿瘤或病毒来源的病状的基因。
[0003]此外，本发明涉及所述寡核苷酸用于所述疾病的治疗和/或诊断的用途，所述寡核苷酸可能是化学修饰的。
[0004]寡核苷酸是天然RNA或DNA核酸或合成核酸的短序列，例如，PNA(肽核酸)、LNA(锁核酸)和吗啉代寡核苷酸。
[0005]已经通过实验证明了寡核苷酸在转录和翻译水平上调苄基因的表达中是非常有效的。由于这种能力，寡核苷酸代表了用于各种病状治疗的有效方法，特别是遗传、肿瘤或病毒来源的疾病。
[0006]调苄基因的表达意味着可以将其抑制或激活。
[0007]例如，能够通过与基因的反义链形成互补键(Η--?ηθ C，B1ch B1ph Actal990，1049(2):99-125)或改变目标基因调控区中的染色质状况(Rossi JJ,Nat Chem B1l2007,3(3):136-7)来抑制基因转录的寡核苷酸是已知的。其他寡核苷酸能够抑制基因翻译，例如，通过与靶标信使RNA(mRNA)的互补键。在单链寡核苷酸的情况中，这种键通过RNase H复合物引起mRNA的酶降解。在其中寡核苷酸是双链“干扰”RNA分子的情况中，寡核苷酸与靶标mRNA的互补键通过RISC复合物的“沉默子”酶，引起信使的降解。在后一种情况中，寡核苷酸还可以是等于内源性miCToRNA的寡核苷酸，其依靠不完全的互补性，能够与靶标mRNA的3’ UTR(3’未翻译区)相连，引起mRNA的翻译被阻断。
[0008]寡核苷酸还可以诱导基因的激活或其转录的提高，例如，经由与长的反义非编码RNA 的互补键(Morris KV, Epigenetics, 2009,4 (5): 296-301),或通过抑制互补微 RNA,结果是微RNA的靶标mRNA的翻译提高。
[0009]为了提高它们在治疗和/或诊断条件中的有效性，可以将寡核苷酸进行化学修饰。例如，可以为了提高其特异性和/或与互补序列配对的效力，对寡核苷酸进行修饰，或为了使其对酶降解不太敏感、提高其药物动力学/药效谱，或促进其通过细胞膜，对寡核苷酸进行修饰。
[0010]除了天然核酸的寡核苷酸(B卩，DNA和/或RNA的短序列)，还存在合成核酸的寡核苷酸，例如，肽核酸(PNA)和锁核酸(LNA)，其已经得到了很大程度的研究和表征，以上全部的目的在于通过反基因策略来调苄基因的表达(即，设计来直接冲击(strike)基因)。PNA和LNA寡核苷酸，与全部修饰的寡核苷酸一样，通常在化学上比DNA或RNA寡核苷酸更稳定。可以通过合成嵌合寡核苷酸进一步提高它们的稳定性。嵌合寡核苷酸例如是其中插入了传统单体(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)和合成核碱基(单体)(例如，LNA单体)两者的寡核苷酸序列。
[0011]将LNA与反义策略一起使用，通过抑制靶标基因的转录产物来沉默基因(BraaschDA, Nucl Acids Res，2002，30 (23): 5160-7)。或者，LNA寡核苷酸也可以用于反义策略中，如Smith和同事所做的(Ge R，Faseb J，2007，1902-14)，他们设计了以这样的方式能够通过“链入侵”机理在核酸的两条链上相互作用的寡核苷酸序列，使得形成“Z-型”结构(限定为“Zorro”寡核苷酸)。
[0012]与其他寡核苷酸结构相比时，PNA寡核苷酸对酶更稳定。PNA可以通过“链入侵”结合双链DNA (DNAds)，或可以以互补方式结合单链DNA (DNAss)的分子，或它们可以结合RNA链，产生杂合双螺旋PNA/DNA或PNA/RNA结构，其与“同质双链”结构(如，DNA/DNA双链)相比，在热力学上非常稳定。
[0013]PNA代表了用于调苄基因表达的高度有利的系统，以上全部使用反基因策略。实际上，已经证明了 PNA对靶标序列呈现出高特异性，并且因此能够以有效的方式抑制蛋白质的表达。
[0014]因此，PNA代表了用于遗传或病毒的疾病的有前景的治疗方法。
[0015]PNA的唯一缺陷是它们具有有限的穿过细胞膜的能力的事实。然而，可以通过通常将寡核苷酸(并且特别是PNA)与能够给予更有效地穿过细胞膜的分子(载体)结合解决了这一限制。
[0016]实际上，寡核苷酸，并且特别是PNA，通常可以使用与其结合的载体(或“标记物”)来给药，例如，具有I至30个氨基酸长度的肽序列。
[0017]寡核苷酸的一个特别应用是调苄基因的表达，其在肿瘤中被激活或抑制。
[0018]公知肿瘤是由各种基因的失调引起的。通常，损害影响原癌基因(或也可能仅仅是致癌基因)，如 MYC 基因(tra cui MYC、MYCN、MYCLI)、存活素(BIRC5)、BCL2、PLK4、ALK和PKM2，其在肿瘤中被激活或超表达。此外，在肿瘤中，抗肿瘤或致癌抑制剂基因，如caspase-8和RASSFI,通常也是被灭活的。
[0019]特别地，MYC家族的致癌基因涉及各种人肿瘤的产生，并且其中大部分基因引起肿瘤的发作和进展。这些基因的扩增和/或超表达几乎总是与肿瘤相关，儿科类型的(例如，成神经细胞瘤、成神经管细胞瘤和横纹肌肉瘤)和成人类型的(例如，小细胞肺癌或成胶质细胞瘤)(Pess1n A, Cur Cancer Drug Target, 2005, 5 (4):273-83)。实际上，它们通过对肿瘤生长是基础的机制来起作用，如诱导细胞增殖、抵抗凋亡、形成转移和抵抗化疗药物。
[0020]许多具有抗肿瘤作用的寡核苷酸是文献中已知的。
[0021 ] 例如，在反义策略中存在针对MYC、MYCN、BCL2、BIRC5基因的寡核苷酸(EVProchownik, Exp Rev Antic Ther2004,16(6):370-4 ;CF Bennet, Exp Opin InvestigDrugs, 1999,8 (3):237-53)或具有反义作用的针对MYCN和MYC的寡核苷酸(LC Boffa,01igonucleotides2005,15(2):85-93)。
[0022]为了抑制MYCN基因翻译至成神经细胞瘤细胞中，还已经产生了基于DNA的硫逐磷酸酯反义寡核苷酸(Burkhart CA，JNCI，2003，95 (18): 1394-403)，并且通过“小干扰RNA(SiRNA) ”产生了反义寡核苷酸，以抑制MYCN基因翻译至成神经细胞瘤细胞中(KangJH, B1ch B1ph Res Com,2006,351 (I):192-197)。
[0023]然而，仍然强烈地感觉到需要鉴定更多的能够以提高的特异性和选择性方式调节基因表达的寡核苷酸，使得能够具有有效的治疗和/或抗肿瘤作用。
[0024]为了获得可用作治疗和/或诊断方法的寡核苷酸，需要鉴定靶标基因，或靶标信使RNA的序列和/或其各自的调控序列，所述调控序列就转录和翻译而言，能够确定对基因自身表达的显著和选择性的调节作用。
[0025]因此，还感觉到需要限定控制鉴定过程的一般规则-在基因的序列，或信使RNA的序列或其调控序列内-对于调苄基因自身转录/翻译的目的最有前景的寡核苷酸序列。
[0026]通过本发明满足了刚才所述的这部分中的需求，根据第一个方面，本发明涉及一种用于调苄基因表达的寡核苷酸，其包含6-30个核苷酸(单体)，优选12-24个核苷酸，所述寡核苷酸的特征在于包含至少一组的至少两个连续鸟嘌呤的序列。理解具有序列SEQ IDNO:1的寡核苷酸从刚才给出的限定中排除。
[0027]在天然核酸(DNA和RNA)的情况中，每个单体(核苷酸)由含氮碱基、糖和三磷酸酯组成。碱基选自由腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶(只有在RNA中)组成的组。糖在DNA的情况中是脱氧核糖，在RNA的情况中是核糖。单体在聚合物中通过磷酸二酯键连接。
[0028]优选，本发明的寡核苷酸包含含有至少一组的至少三个连续鸟嘌呤的序列。理解具有序列SEQ ID NO:1的寡核苷酸从该限定中排除。
[0029]更优选，本发明的寡核苷酸包含含有至少一组的至少四个连续鸟嘌呤的序列。
[0030]再更优选，本发明的寡核苷酸包含含有至少一组的至少五个连续鸟嘌呤的序列。
[0031]在本发明的一些实施方案中，寡核苷酸包含含有至少由两个至六个连续鸟嘌呤组成的一组的序列。
[0032]在进一步的实施方案中，至少一组的鸟嘌呤优选包含至少两组的至少两个连续鸟嘌呤。
[0033]或者，至少一组的鸟嘌呤优选包含至少一组的至少两个连续鸟嘌呤和至少一组的至少三个连续鸟嘌呤。
[0034]在进一步的实施方案中，至少一组的鸟嘌呤优选包含至少三组的至少两个连续鸟嘌呤。
[0035]在进一步的实施方案中，至少一组的鸟嘌呤优选包含至少四、五或六组的至少两个连续鸟嘌呤。
[0036]或者，至少一组的鸟嘌呤优选包含至少一组的至少两个连续鸟嘌呤或至少两组的至少三个连续鸟嘌呤。
[0037]或者，至少一组的鸟嘌呤优选包含至少一组的至少三个连续鸟嘌呤和至少两组的至少两个连续鸟嘌呤。
[0038]或者，至少一组的鸟嘌呤优选包含至少一组的至少两个连续鸟嘌呤、至少一组的至少三个连续鸟嘌呤和/或至少一组的六个连续鸟嘌呤。
[0039]通常，本发明的寡核苷酸优选与靶标序列互补，并且优选，连续鸟嘌呤的组可以是彼此连续的，使得，例如，三组2个连续的鸟嘌呤是一组6个连续的鸟嘌呤。或者，连续鸟嘌呤的组可以由至少一个核苷酸间隔开来。
[0040]通常，根据本发明的至少一组的至少两个连续鸟嘌呤可以位于寡核苷酸5’端附近，或在寡核苷酸3’端附近，或可以位于寡核苷酸序列的中心。
[0041]在本发明的优选实施方案中，优选在其3’和/或5’端使用载体序列结合所述寡核苷酸，所述载体序列优选是短氨基酸序列。
[0042]所述短氨基酸序列(载体)优选由I至30个，优选I至10个，甚至更优选I至7个范围的多个氨基酸组成。氨基酸可以是L或D形式的，优选D形式。
[0043]对于本发明的目的，优选的载体选自由SEQ ID NO: 47 (PKKKRKV) ；SEQID NO: 48 (VKRKKKP) ；SEQ ID NO:49 (KKKKKK) ；SEQ ID NO: 50 (PKRKRKV) ；SEQ IDNO:51(KRKRKRK) ；SEQ ID NO:52(KKKRKV) ；SEQ ID NO:53(PKKKRK) ；SEQ ID NO:54(KKKRK)；SEQ ID NO:55 (RRRR)和 SEQ ID NO: 56 (PKKKRKVHHHHH)组成的组。
[0044]对于本发明的目的，特别优选的载体是具有SEQ ID NO:47的肽。
[0045]在本发明的内容中，“载体”意思是能够有利地改变寡核苷酸的药物动力学/药效谱和/或细胞和/或核渗透的肽。
[0046]在本发明的内容中，“调苄基因的表达”意思是抑制或激活(提闻)基因的表达。所述基因表达的抑制或激活(提高)可以在转录或翻译水平上发生。
[0047]可以通过以反基因机制起作用的寡核苷酸(或反基因寡核苷酸，即，针对基因的反义链，也就是说，反基因策略)，在转录水平上实现基因表达的抑制或激活。
[0048]或者，可以使用通过反基因机制作用的寡核苷酸(或反基因寡核苷酸，即，针对信使，也就是说，反义策略)，在翻译水平上实现基因表达的抑制，同时可以通过抑制降解信使RNA的微RNA来实现翻译水平上的表达提高。
[0049] 申请人:鉴定的并且在以上描述的，为了有效调苄基因的表达，寡核苷酸必须满足的参数或规则或必要条件适用于任何基因，并且因此可以例如用于鉴定能够调苄基因表达的寡核苷酸序列的目的，所述基因负责遗传和/或病毒来源的疾病或涉及肿瘤病况发作的基因。
[0050]由此鉴定的寡核苷酸可以用于治疗方法中，用于特定的遗传、病毒或肿瘤疾病，优选用作药物。
[0051 ] 或者，寡核苷酸可以用于诊断目的。
[0052]实际上，本发明的主题进一步涉及本发明的寡核苷酸用于治疗和/或诊断目的的用途，所述寡核苷酸可能是化学修饰的。
[0053]本发明的寡核苷酸是6-30，优选12-24个残基(核苷酸或单体)的短寡核苷酸。寡核苷酸可以由天然核酸碱基组成，例如，DNA或RNA，或由合成的核酸碱基组成，例如，PNA、LNA或吗啉代核苷酸。或者，寡核苷酸可以包含DNA、RNA和/或合成核酸的组合，优选PNA或LNA (杂交或嵌合寡核苷酸)。此外，寡核苷酸可以是单链或双链的。
[0054]在本发明的一些实施方案中，寡核苷酸可以是化学修饰的，例如，用于提高它们的治疗和/或诊断有效性的目的。
[0055]在本发明的优选实施方案中，寡核苷酸可以是具有主链的PNA分子，其中主链中α位置(Calpha(a))的碳结合取代基，而不是结合甘氨酸的典型氢原子。例如，替代甘氨酸的侧链，可以使用天然或合成来源的另一个氨基酸的侧链，所述氨基酸优选选自由精氨酸、赖氨酸、组氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸盐、天冬氨酸盐、脯氨酸、色氨酸和鸟氨酸。所述氨基酸可以是右旋构造(D)或左旋构造(L)组成的组。
[0056]在本发明的其他优选实施方案中，寡核苷酸是:互相互补的单链或双链RNA分子(将互相互补的双链RNA分子限定为siRNA，“小干扰RNA”的首字母缩略词)。
[0057]在一些实施方案中，所述“小干扰RNA”包含RNA单体(核糖核苷酸)和至少一个在核糖2’位置修饰的单体，优选2’ -O-甲氧基乙基、2’ -O-甲基或2’ -氟单体；或所述“小干扰RNA”包含RNA单体(核糖核苷酸)和至少一个合成核酸的单体，所述合成核酸选自由LNA、甲基磷酸酯LNA、BNA (桥接核酸)、UNA (未锁闭核酸)、ENA (乙烯-桥接核酸)、ANA (阿拉伯糖核酸)和F-ANA (氟-阿拉伯糖苷核酸)组成的组。
[0058]在优选的实施方案中，以如下的方式来设计所述“小干扰RNA”:在互补双链的末端，两条链中只有一条具有至少一个，优选两个突出(即，未配对)的天然或合成核酸的单体。在进一步的实施方案中，天然或合成突出核酸优选选自由2’-0_甲氧基乙基、2’-0_甲基或2’-氟单体，或LNA、甲基磷酸酯LNA、BNA、UNA(未锁闭核酸)、ENA(乙烯-桥接核酸)、ANA(阿拉伯糖核酸)和F-ANA(氟-阿拉伯糖苷核酸)的单体组成的组。
[0059]在进一步的实施方案中，将寡核苷酸限定为杂交或嵌合的，并且优选是单链或双链的，包含RNA单体(核糖核苷酸)和LNA单体(将这种寡核苷酸表示为RNA/LNA)。
[0060]或者，杂交寡核苷酸可以包含RNA单体(核糖核苷酸)和至少一个选自2’ -O-甲氧基乙基(MOE)单体、2’ -O-甲基单体或2’ -氟单体的RNA单体；或杂交寡核苷酸可以包含RNA单体(核糖核苷酸)和至少一个优选选自LNA、甲基磷酸酯LNA、UNA (未锁闭核酸)、BNA> ENA (乙烯-桥接核酸)、A NA (阿拉伯糖核酸)和F-ANA (氟-阿拉伯糖苷核酸)的合成核酸的单体。
[0061]在进一步的实施方案中，基于单链或双链RNA的寡核苷酸可以包含传统的核糖核苷酸(即，没有化学修饰)和已经在磷酸二酯键水平被修饰的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸，例如，通过硫逐磷酸酯键或DNG (脱氧核糖核胍)、RNG (核糖核胍)、GNA (甘油核酸)、G-PNA ( Y -PNA)或PMO (吗啉代)进行了修饰。
[0062]在本发明的优选实施方案中，寡核苷酸是包含DNA单体(脱氧核糖核苷酸)和LNA单体的嵌合单链序列。
[0063]对于反基因策略，其表示在转录水平调苄基因的表达，可以优选使用:
[0064]?基于PNA的寡核苷酸，可选与载体(通常由I至30个残基组成)结合，优选在3’端和/或5’ ；或
[0065].基于PNA的寡核苷酸，所述PNA包含至少一个主链的α碳(C- α )，与取代基结合，而不是标准甘氨酸的H原子结合；或
[0066]?包含RNA单体(传统核糖核苷酸)和可选的至少一个修饰的核苷酸(单体)(例如，2’ -O-甲基RNA单体、2’ -氟RNA单体)，或至少一个选自LNA、甲基磷酸酯LNA、ΒΝΑ、UNA、GNA、ANA、FANA, ENA、DNG和RNG的核酸的单体，或在磷酸二酯键水平上修饰的核糖核苷酸的单链寡核苷酸；或
[0067].互相互补的双链的基于RNA的寡核苷酸(siRNA);或
[0068].包含RNA单体(传统核糖核苷酸)和至少一个LNA单体的部分互补的双链嵌合寡核苷酸；或
[0069]?包含RNA单体(传统核糖核苷酸)和至少一个2’ -0-(2-甲氧基甲基)RNA单体的双链嵌合寡核苷酸；或
[0070].包含DNA单体(传统脱氧核糖核苷酸)和至少一个LNA单体的单链嵌合寡核苷酸；或
[0071]?包含DNA单体(传统脱氧核糖核苷酸)和至少一个2’ -氟RNA单体或至少一个选自LNA、甲基膦酸酯LNA、BNA, UNA、GNA、ENA、ANA、FANA, DNG和RNG的核酸的单体的寡核苷酸。
[0072]对于反义策略，其表示在翻译水平上调苄基因的表达，可以优选利用:
[0073].包含RNA单体(传统核糖核苷酸)的互相互补的双链寡核苷酸(siRNA);或
[0074].包含RNA单体(传统核糖核苷酸)和至少一个在核糖水平和/或在磷酸二酯键水平修饰的RNA单体的单链寡核苷酸；
[0075].包含DNA单体(传统脱氧核糖核苷酸)和至少一个硫逐磷酸酯DNA单体的单链嵌合寡核苷酸；或
[0076]?包含RNA单体(传统核糖核苷酸)和至少一个2’ -0-(2-甲氧基乙基)RNA单体的双链嵌合寡核苷酸；或
[0077].包含RNA单体(传统核糖核苷酸)和至少一个2’ O-甲基化RNA单体的双链嵌合寡核苷酸；或
[0078]?包含RNA单体(传统核糖核苷酸)和至少一个2’ -氟RNA单体的双链嵌合寡核苷酸；或
[0079]?包含RNA单体(传统核糖核苷酸)和至少一个LNA单体的双链嵌合寡核苷酸；或
[0080].包含RNA单体(传统核糖核苷酸)和至少一个阿拉伯糖苷RNA单体的双链嵌合寡核苷酸；或
[0081].包含DNA单体(传统脱氧核糖核苷酸)和至少一个LNA单体的单链嵌合寡核苷酸；或
[0082].包含吗啉代单体的单链寡核苷酸；或
[0083].基于PNA的寡核苷酸，所述PNA包含至少一个主链的α碳(C- α )，与取代基结合，而不是标准甘氨酸的H原子结合；优选取代基是精氨酸或赖氨酸的侧链；或
[0084].包含DNA单体(传统脱氧核糖核苷酸)和至少一个选自PNA、LNA、LNA甲基磷酸酯、BNA, UNA、GNA、ENA、DNG和RNG的核酸的单体的寡核苷酸。
[0085]优选，本发明的寡核苷酸针对涉及遗传和/或病毒来源的疾病或肿瘤的产生的基因。所述基因优选选自由MYC家族的基因(优选1^(:、1^0队1^(^1)、存活素基因(BIRC5)、BCL2、PLK4、ALK、ΡΚΜ2、caspase-8 和 RASSFl 组成的组。
[0086]特别地，本发明的寡核苷酸针对MYC家族的基因，优选针对MYCN。
[0087]所述寡核苷酸优选选自由SEQ ID NO: 2_15、66_84，SEQ ID NO: 24、25、31 和 32 组成的组，具有SEQ ID NO: 26和57的互补寡核苷酸对，具有SEQ ID NO: 27和58的互补寡核苷酸对，具有SEQ ID NO:28和59的互补寡核苷酸对，具有SEQ ID NO:29和60的互补寡核苷酸对，具有SEQ ID NO:30和61的互补寡核苷酸对，具有SEQ ID NO:33和62的互补寡核苷酸对，具有SEQ ID NO: 34和63的互补寡核苷酸对，具有SEQ ID NO: 35和64的互补寡核苷酸对以及具有SEQ ID NO:36和65的互补寡核苷酸对。
[0088]在一些实施方案中，所述寡核苷酸是PNA寡核苷酸，优选所述PNA针对MYCN。
[0089]在优选的实施方案中，PNA选自由SEQ ID NO:2-15组成的组。
[0090]在进一步优选的实施方案中，PNA选自由SEQ ID NO:66-84组成的组。
[0091]在进一步优选的实施方案中，PNA选自由SEQ ID NO:2_15、66_84组成的组。
[0092]优选，PNA寡核苷酸选自由SEQ ID NO: 2-13，更优选SEQ ID NO: 2-8，再更优选SEQID NO: 2-6组成的组。对于本发明的目的，特别优选的PNA寡核苷酸是SEQ ID NO: 5。
[0093]优选，SEQID N0:5 在 5’ 或 3’ 端结合 SEQ ID N0:47。更优选，SEQ ID NO:47 由D形式的氨基酸组成。
[0094]PNA SEQ ID NO: 2_15优选针对MYCN，并且更优选，它们以反基因策略调节MYCN的表达。
[0095]PNA SEQ ID NO:66_69也优选针对MYCN，并且更优选，它们以反基因策略调节MYCN的表达。
[0096]PNA SEQ ID NO: 70-74优选针对MYC，并且更优选，它们以反基因策略调节MYC的表达。
[0097]PNA SEQ ID NO: 75、76优选针对BIRC5，并且更优选，它们以反基因策略调节BIRC5
的表达。
[0098]PNA SEQ ID NO: 77_79优选针对ALK，并且更优选，它们以反基因策略调节ALK的表达。
[0099]PNA SEQ ID NO:80-82优选针对BCL2，并且更优选，它们以反基因策略调节BCL2的表达。
[0100]PNA SEQ ID NO:83、 84优选针对PLK4，并且更优选，它们以反基因策略调节PLK4的表达。
[0101]在进一步的实施方案中，所述寡核苷酸是双链的，并且优选包含RNA单体。优选，所述寡核苷酸针对MYCN。
[0102]或者，所述双链RNA寡核苷酸选自:具有SEQ ID NO: 26和57的互补寡核苷酸对，具有SEQ ID NO: 27和58的互补寡核苷酸对，具有SEQ ID NO: 28和59的互补寡核苷酸对，具有SEQ ID NO: 29和60的互补寡核苷酸对，具有SEQ ID NO: 30和61的互补寡核苷酸对。
[0103]所述寡核苷酸优选针对MYCN。更优选，它们通过反义策略调苄基因的表达。
[0104]在进一步的实施方案中，所述寡核苷酸是DNA-LNA嵌合寡核苷酸，优选所述寡核苷酸针对MYCN。
[0105]在优选的实施方案中，所述DNA-LNA嵌合寡核苷酸选自由SEQ ID N0:24和25组成的组。
[0106]SEQ ID NO: 24 和 25 优选针对 MYCN 基因。
[0107]SEQ ID N0:24和25优选通过反基因策略调苄基因的表达。
[0108]在进一步的实施方案中，所述寡核苷酸是包含DNA单体和/或至少一个硫逐磷酸酯DNA单体的单链嵌合寡核苷酸。所述寡核苷酸优选针对MYCN。
[0109]对于本发明的目的，特别优选的是选自由SEQ ID NO:31和32组成的组的嵌合寡核苷酸。SEQ ID NO: 31和32优选针对MYCN基因。SEQ ID NO: 31和32优选通过反义策略调节MYCN的表达。
[0110]在进一步的实施方案中，所述寡核苷酸是包含RNA单体和至少一个优选2’ -0-(2-甲氧基乙基)或2’ -甲基RNA单体的双链嵌合寡核苷酸。
[0111]所述寡核苷酸优选针对MYCN。
[0112]对于本发明的目的，特别优选的是具有SEQ ID NO:33和62的互补嵌合寡核苷酸对。所述寡核苷酸对优选通过反义机制调苄基因的表达。
[0113]在进一步的实施方案中，所述寡核苷酸是包含RNA单体和至少一个优选2 ’ -氟RNA单体的双链嵌合寡核苷酸。
[0114]优选，所述寡核苷酸针对MYCN。
[0115]对于本发明的目的，特别优选的是具有SEQ ID NO: 34和63的互补嵌合寡核苷酸对。所述寡核苷酸对优选通过反义机制调苄基因的表达。
[0116]在进一步的实施方案中，所述寡核苷酸是包含RNA单体和至少一个LNA单体的双链嵌合寡核苷酸。
[0117]所述寡核苷酸优选针对MYCN。
[0118]对于本发明的目的，特别优选的是具有SEQ ID NO:35和64的互补嵌合寡核苷酸对。所述寡核苷酸对优选通过反义机制调苄基因的表达。
[0119]在进一步的实施方案中，所述寡核苷酸是双链嵌合寡核苷酸，包含RNA和至少一个阿拉伯糖苷RNA单体。
[0120]优选，所述寡核苷酸针对MYCN。
[0121]对于本发明的目的，特别优选的是具有SEQ ID NO:36和65的互补嵌合寡核苷酸对。所述寡核苷酸对优选通过反义机制调苄基因的表达。
[0122]本发明的再一个方面涉及上述寡核苷酸用于治疗和/或诊断目的的用途。
[0123]特别地，寡核苷酸可以单独地或结合在一起用于遗传和/或病毒来源的疾病的治疗，特别是用于由基因的超表达或抑制引起的遗传疾病的治疗，即，需要调节超表达或抑制的基因的表达的遗传疾病。
[0124]本发明的寡核苷酸用于遗传疾病的治疗性处理，所述疾病优选选自由Gorlin综合症、唐氏综合症、Feingold综合症、Hirschsprung’ s病、L1-Fraumeni综合症、Turcot综合症、家族性肿瘤和帕金森病组成的组。
[0125]此外，本发明的寡核苷酸用于儿童或成人的肿瘤病况的治疗性处理。特别地，所述肿瘤优选由基因或致癌基因的超表达引起，所述基因选自由MYC、MYCN、MYCL1、存活素(BIRC5)、BCL2、PLK4、ALK和PKM2组成的组。或者，肿瘤优选是由致癌抑制剂或抗肿瘤基因的抑制(失活)引起的并且优选选自由caspase-8和RASSFl组成的组。
[0126]所述肿瘤优选选自由成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤、成神经管细胞瘤、室鼓膜瘤、嗜铬细胞瘤、胚胎癌、生殖细胞肿瘤、腺泡状横纹肌肉瘤、胚胎横纹肌肉瘤、Wilms’肿瘤、肾脏的透明细胞肉瘤、滑膜肉瘤、肝胚细胞瘤、急性淋巴性白细胞、慢性淋巴性白血病、急性淋巴母细胞白血病、慢性淋巴母细胞白血病、Burkitt’ s淋巴瘤、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性原巨核细胞白血病、B慢性淋巴性白血病、T-细胞白血病、淋巴瘤、小细胞肺癌(肺微小细胞瘤)、肺腺癌、鳞状上皮细胞肺癌、典型和非典型原发性肺癌、大细胞肺癌、大细胞神经内分泌性肺癌、成胶质细胞瘤、肝癌、基细胞癌、卵巢肿瘤、乳房肿瘤和结肠癌组成的组。
[0127]对于本发明的目的，特别优选的是选自由成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、Wilms’肿瘤、成神经管细胞瘤、小细胞肺癌和基细胞癌组成的组。
[0128]本发明的主题进一步涉及包含至少一种根据本发明的寡核苷酸和至少一种药物学上接受的赋形剂的组合物。优选，所述至少一种寡核苷酸是PNA，优选选自由SEQ IDN0:2-15、66-84，优选 SEQ ID NO: 2-13，更优选 SEQ ID NO: 2-8，再更优选 SEQ ID NO: 2-6 组成的组。特别优选的寡核苷酸是SEQ ID N0:5。优选，SEQ ID N0:5在5’或3’端结合SEQID N0:47。更优选，SEQ ID NO:47由D型氨基酸组成。
[0129]所述PNA优选在5’或3’端结合载体，所述载体优选选自由SEQ ID N0:47_56组成的组。
[0130]本发明的主题进一步涉及包含至少一种根据本发明的寡核苷酸(包括具有SEQ IDNO:1的寡核苷酸)、至少一种化合物(优选，至少一种具有药物学作用的化合物，更优选化疗剂)和可选至少一种药学上接受的赋形剂的组合物。
[0131]在优选的实施方案中，所述至少一种化合物是至少一种另外的反基因和/或反义寡核苷酸，或至少一种药物学制剂，或至少一种生物或生物技术来源的或源自化学合成或其组合的化合物。
[0132]所述生物或生物技术来源或源自化学合成的化合物优选选自由单克隆抗体、化疗剂、免疫调节剂、生长因子、细胞因子、肽、血管生成抑制剂、肿瘤生长抑制剂、留类激素和/或非留类激素和维生素组成的组。
[0133]对于本发明的目的，特别优选的化合物的实例选自由神经生长因子(NGF)、生长激素抑制素、视磺酸、放线菌素D、天门冬酰胺酶、博来霉素、白消安卡培他滨、卡钼、环磷酰胺、环孢霉素、顺钼、阿糖胞苷、clorambucil、氮烯唑胺、道诺霉素、多西他赛、盐酸阿霉素、盐酸表柔比星、足叶乙苷、磷酸氟达拉滨、氟脲嘧啶、吉西他滨、盐酸伊达比星、羟基脲、ifophosphamide、盐酸伊立替康、美法仑、巯基嘌呤、氨甲喋呤、丝裂霉素、米托蒽醌、nutline、奥沙利钼、紫杉醇、甲基苄肼、雷替曲塞、链脲霉素、替加氟-尿嘧啶、替莫唑胺、巯鸟嘌呤、th1tepe、拓扑替康、长春花碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨,及其组合。
[0134]更优选，所述化合物选自由卡钼、顺钼、足叶乙苷、长春新碱、环磷酰胺，及其组合组成的组。
[0135] 申请人:已经发现了至少一种根据本发明的寡核苷酸结合至少一种化合物(优选至少一种化疗剂，如上所述)的给药使得可以降低待给药的所述化合物的浓度，同时确保治疗有效性的提高和较低的毒性。
[0136] 申请人:已经发现了，在这些条件下，所述化合物浓度的降低取决于特定的病状；特别地，化疗组合物的浓度取决于肿瘤的类型。
[0137]对于一些肿瘤，如:成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤、成神经管细胞瘤、小细胞肺癌、Wilms’肿瘤、腺泡状横纹肌肉瘤和胚胎横纹肌肉瘤，结合至少一种根据本发明的寡核苷酸给药的至少一种化疗剂的浓度可以降低高达10倍，同时确保治疗作用与正常剂量的化疗剂相同。
[0138]作为药物组合(就提高的治疗作用而言)，特别有效的是至少一种根据本发明的PNA (优选，至少一种选自由 SEQ ID N0:l-15、66-84，优选 SEQ ID NO: 1-13，更优选 SEQ IDNO: 1-8，更优选SEQ ID NO: 1_6，甚至更优选SEQ ID NO:1和/或5的PNA)和至少一种化合物的组合组成的组，所述化合物优选是化疗剂，更优选选自由足叶乙苷(VP16)、卡钼、顺钼或长春新碱、环磷酰胺，及其组合组成的组。
[0139]对于本发明的目的，特别优选的是选自以下组成的组的组合:SEQ ID N0:1和卡钼，或足叶乙苷或顺钼或长春新碱；或SEQ ID NO:5和卡钼或足叶乙苷或顺钼或长春新碱。
[0140]所述PNA优选在其3’和/或5’端结合载体，所述载体优选选自由SEQ ID NO:47-56组成的组。
[0141]优选在同时给药组合物时和连续时间给药至少一种化合物时，发现提高的作用，所述连续时间给药优选以一定间隔给药，更优选以3小时、6小时、12小时、24小时、48小时或72小时的规律间隔给药。
[0142]在其他优选实施方案中，本发明的至少一种寡核苷酸，包括具有SEQ ID NO:1的寡核苷酸，可以优选与至少一种载体颗粒、至少一种载体聚合物或至少一种自体装配的载体寡核苷酸(也称为适体)结合或复合给药。
[0143]在进一步优选的实施方案中，本发明的至少一种寡核苷酸，包括具有SEQ ID NO:1的寡核苷酸，可以与至少一种脂质体胶束、至少一种微粒或至少一种纳米颗粒结合或复合并给药，使得促进靶标组织的渗透。
[0144]所述颗粒，通常是球形的，并且用作特定传送的工具，可以与许多不同的化合物一起配制。例如，所述颗粒可以是聚合化合物的配方或共同-配方，所述聚合化合物如:壳聚糖、透明质酸、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯亚胺(PEI)、聚乳酸(PLA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、羟磷灰石(HAP)、多不饱和脂肪酸、饱和脂肪酸、阳离子脂质、HAP-PLA、HAP-PLA/PGA及其衍生物。在进一步优选的实施方案中，至少一种本发明的寡核苷酸可以优选与至少一种之前所述类型的颗粒和至少一种配体或至少一部分的配体结合或复合，所述配体针对靶标细胞的特定受体(如， 例如，GD2、叶酸、TRAIL、NGF)，化学或生物技术来源的，可以作为佐剂存在于聚合膜中，用于促进所述本发明的寡核苷酸在靶标细胞中的内在化。
[0145]在进一步优选的实施方案中，至少一种本发明的寡核苷酸可以结合至少一种配体或配体(如，例如，⑶2 (神经节苷脂⑶2)、叶酸、TRAIL (TNF-相关凋亡诱导配体)、NGF (神经生长因子))的一部分，所述配体对于靶标细胞的受体是特异性的。
[0146]在进一步优选的实施方案中，至少一种本发明的寡核苷酸，包括具有SEQ ID NO:1的寡核苷酸，可以自身单独给药，或在组合中，结合至少一种另外的医学应用来给药，以增强其有效性，优选还通过促进靶标细胞和/或组织的渗透来增强其有效性。
[0147]所述医学应用优选选自由氧疗法、磁疗法、热疗法、电刺激、超声波、放疗、化疗和光线疗法组成的组。
[0148]实施例1
[0149]寡核苷酸的化学合成。
[0150]寡核苷酸的化学合成是基于在5’_0H用保护基团4，4’-二甲氧基三苯甲基(DMTr)和在3’ -磷酸酯基团用β -氰基乙基修饰的DNA核苷酸亚磷酰胺的使用；保护基团还用于伯胺(核碱基杂环)，其另外也是反应性的。
[0151]DNA寡核苷酸的化学合成以3’ -5’方向进行。使用了 CPG(受控孔玻璃的首字母缩略词)树脂或聚苯乙烯支持物，用第一个核苷酸碱基功能化。合成从使用二氯甲烷(DCM)中的3%三氯乙酸(TCA)溶液使5’-二甲氧基三苯甲基基团去保护的步骤开始。这接着是激活，使用对应于序列中待插入的第二个碱基的亚磷酰胺的乙基硫代四唑(ETT)或苄基硫代四唑(ΒΤΤ)Ο.3Μ，然后其将结合之前去保护的5’ 0Η,由此形成磷酸二酯键。
[0152]下一个步骤是“加帽”，其用于使未反应的5’ OH基团乙酰化。使用2种溶液来进行加帽，一种含有四氢呋喃(THF)/卢剔啶/乙酸酐(8:1:1)，而另一种含有THF中的10%甲基咪唑溶液。通过THF/吡啶溶液中的碘稳定亚磷酸三酯不稳定的三价键，碘将其氧化成五价磷酸二酯。
[0153]氧化后，重复该循环，从第二个引入的单体的脱三苯甲基开始等等。将该循环重复需要的次数，这取决于希望多少碱基插入序列中。最后，通过在室温下用酸处理来除去最后的5’ -DMTr基团。
[0154]根据碱基上存在的保护基团(其随后取决于选定的碱基的化学性质，PT0、2’ OMe等)，可以与氢氧化铵在55°C下持续16小时，或与氢氧化铵/甲胺(AMA)溶液在55°C下持续35分钟，使得通过氰基乙基基团的β -消除使磷去保护，并且除去核碱基杂环上的保护基团。
[0155]或者，可以在整个分析(HPLC、MS)和制备性色谱期间保持5’ -DMTr基团，以更好地从副产物中纯化出终产物，并且最终通过用乙酸处理来除去。
[0156]由于核糖上存在的2’ OH基团，并且因此用于每个亚磷酰胺的另外的保护基团的存在，RNA寡核苷酸的化学合成不同于DNA寡核苷酸。
[0157]因此，RNA寡核苷酸的合成需要较长的耦合时间和更多的步骤，来使基团去保护。
[0158]将如上所述的相同方案用于寡核苷酸的合成，使用化学修饰的单体，如硫逐磷酸酯(PTO)、2’ O-甲基(2’ OMe)、2’氟(2’ -F)、阿拉伯糖苷核酸(AM)和锁核酸(LNA)。
[0159]通过购买公司(Link Technologies Ltd.)的单体分子来提供用于每种修饰碱基的特定技术的详细内容。
[0160]吗啉代核酸购自制造商(Gene Tools, LLC)。
[0161]以10微摩尔规模来进行PNA寡核苷酸的合成，并且包括纯化和表征步骤。
[0162]分子的合成在固相进行,使用Rink Amide-Chemmatrix?.树脂和Syro自动化合成仪(MultiSynTech)。将合成的第一个单体手动结合树脂。每个自动化合成循环分成三个步骤。第一个步骤是去保护，使用DMF(二甲基甲酰胺)中的20%哌啶溶液来进行。
[0163]第二个步骤是进入的单体和生长中的链之间的耦合反应。通过加入NMP(N_甲基吡咯烷酮)中的 5 0.22Μ 当量(eq)的单体(FMOC-PNA-G(Bhoc)-OH、FM0C_PNA-A(Bhoc)-OH、FMOC-PNA-C(Bhoc)-OH、FMOC-PNA-T-OH)和碱性环境中的 DMF 中的 4.50.32M eq 的激活剂(在这种情况中，为HATU)来进行这一反应，所述碱性环境含有DMF中的2，6-卢剔啶和DIPEA(N，N-二异丙基乙胺)的8%溶液。在预先装载树脂上的第一个和第二个单体的连接点，从肽链通过至PNA链，并且最后一个单体上，重复耦合反应，一式两份。
[0164]第三个步骤是“加帽”反应，其通过乙酰化用于阻断耦合步骤过程中未反应的位点。使用DMF中含有6% 2，6-卢剔啶和5%乙酸酐的溶液来实现这一反应。合成完成时，从固体支持物上取下分子。
[0165]使用4:1比例的TFA(三氟乙酸)和间酚紫的溶液来获得这一反应。
[0166]通过在二乙醚中的沉淀来收集由此获得的分子。
[0167]一旦收集在水中，在HPLC中纯化。用于纯化的柱子是C18300A5UJupiter ( ?Phcnomcncx, Inc.)。在 30 分钟内使用从 100 % A (水 95 % ；乙腈 5 % ；0.1 %TFA)-0% B (7jC 60% ;乙腈40% ；0.1% TFA) M 60% A-40% B的线性梯度来进行纯化。所用的完整梯度为 0-5 分钟 O % B ;5-35 分钟 40% B ；35-37100% ；37-42100% B ；42~440% B。
[0168]最后，通过ESI质谱(?.Waters )来分析纯化的产品。
[0169]用于阻断基因转录的反基因寡核苷酸
[0170]为了证明根据本发明中所述的参数选择和设计的本发明的寡核苷酸能够选择性地阻断基因的转录的目的，设计并合成了针对MYCN基因的基于PNA的寡核苷酸；它们显示于表1中。
[0171]表1
【权利要求】
1.一种通过反基因机制调苄基因表达的寡核苷酸，其包含6-30个核苷酸，优选12-24个核苷酸，所述寡核苷酸的特征在于包含至少三组的至少两个连续鸟嘌呤的序列。
2.根据权利要求1所述的寡核苷酸，其中所述至少两个连续鸟嘌呤的组是彼此连续的。
3.根据权利要求1或2所述的寡核苷酸，其中所述至少两个连续鸟嘌呤的组被至少一个核苷酸隔开，所述核苷酸不是鸟嘌呤。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的寡核苷酸，其中所述至少两个连续鸟嘌呤的组的数量至少是四个、五个或六个。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的寡核苷酸,其中所述寡核苷酸在所述寡核苷酸的3’和/或5’端结合载体序列，载体优选是选自由SEQ ID NO:47-56组成的组。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是天然核酸或合成核酸中的至少一种分子，或所述天然核酸和所述合成核酸的组合；所述天然核酸优选是DNA或RNA，可能是化学修饰的，所述合成核酸优选是PNA、LNA或吗啉代，可能是化学修饰的。
7.根据权利要求6所述的寡核苷酸，其中所述天然核酸或合成核酸是单链的或双链的。
8.根据权利要求6或7所述的寡核苷酸，其中所述至少一种DNA分子包含LNA、甲基磷酸酯-LNA、BNA, RNG、DNG、GNA、UNA、ENA、ANA、F-ANA, PNA、G-PNA 和吗啉代核苷酸中的至少一种；或包含2’ O-甲基、2’ O-甲氧基乙基或2’ -氟RNA核苷酸。
9.根据权利要求6或7所述的寡核苷酸，其中所述至少一种RNA分子包含至少一种RNA核苷酸，所述RNA核苷酸选自2’O-甲基核苷酸、2’O-甲氧基乙基核苷酸和2’-氟核苷酸；或包含至少一种核酸的核苷酸，所述核酸选自LNA、甲基磷酸酯LNA、BNA、RNG、DNG、GNA、UNA、ENA、ANA、F-ANA, PNA、G-PNA 和吗啉代。
10.根据权利要求6所述的寡核苷酸，其中所述至少一种DNA分子或所述至少一种RNA分子包含至少一个在磷酸二酯键水平修饰为硫逐磷酸酯键的DNA分子。
11.根据权利要求6所述的寡核苷酸，其中所述PNA具有修饰的主链，其中α碳具有精氨酸或赖氨酸作为取代基的侧链。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸针对至少一种负责遗传或病毒来源的疾病的基因或对抗至少一种肿瘤基因。
13.根据权利要求12所述的寡核苷酸，其特征在于所述基因选自由至少一种属于MYC家族的基因组成的组，所述组优选为MYC、MYCN或MYCL1、BIRC5、BCL2、PLK4、ALK、ΡΚΜ2、CASP8 和 RASSFl。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的寡核苷酸,其中所述寡核苷酸选自:SEQIDNO:2-15 和 SEQ ID NO:24、25 ;优选选自:SEQ ID NO:2、4、5 和 6。
15.根据权利要求1-13中任一项所述的寡核苷酸,其中所述寡核苷酸选自:SEQIDN0:66-84 ;优选选自 SEQ ID NO:68-84?
16.根据权利要求14或15所述的寡核苷酸，其中SEQID NO: 2_15、66_69、24、25，优选SEQ ID NO:2、4、5、6、68 和 69 针对 MYCN 基因。
17.根据权利要求15所述的寡核苷酸，其中SEQID NO:70-74针对基因MYC。
18.根据权利要求15所述的寡核苷酸，其中SEQID N0:75、76针对基因BIRC5。
19.根据权利要求15所述的寡核苷酸，其中SEQID NO:77-79针对基因ALK。
20.根据权利要求15所述的寡核苷酸，其中SEQID NO:80-82针对基因BCL2。
21.根据权利要求15所述的寡核苷酸，其中SEQID NO:83、84针对基因PLK4。
22.根据权利要求14或16所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是选自由SEQIDNO: 2-15，优选 SEQ ID NO: 2-13，更优选 SEQ ID NO: 2-8，甚至更优选 SEQ ID NO: 2-6 组成的组中的PNA。
23.根据权利要求22所述的寡核苷酸，其中所述PNA是SEQID NO:5。
24.根据权利要求14-23中任一项所述的寡核苷酸，在5’和/或3’端结合SEQIDNO:47。
25.一种组合物，其包含至少一种根据权利要求1至24中任一项所述的寡核苷酸和至少一种药物学上可接受的赋形剂。
26.一种组合物，其包含至少一种根据权利要求1至24中任一项所述的寡核苷酸，包括SEQ ID NO:1，结合具有药物作用的选定化合物，所述选定化合物优选选自由NGF、生长激素抑制素、视磺酸、放线菌素D、天门冬酰胺酶、博来霉素、白消安卡培他滨、卡钼、环磷酰胺、环孢霉素、顺钼、阿糖胞苷、clorambucil、氮烯唑胺、道诺霉素、多西他赛、盐酸阿霉素、盐酸表柔比星、足叶乙苷、磷酸氟达拉滨、氟脲嘧啶、吉西他滨、盐酸伊达比星、羟基脲、ifophosphamide、盐酸伊立替康、美法仑、巯基嘌呤、氨甲喋呤、丝裂霉素、米托蒽醌、奥沙利钼、紫杉醇、甲基苄肼、雷替曲塞、链脲霉素、替加氟-尿嘧啶、替莫唑胺、巯鸟嘌呤、th1tepe、拓扑替康、长春花碱、硫酸长春新碱、长春地辛和长春瑞滨组成的组。
27.根据权利要求26所述的组合物，其中所述组合是:SEQID NO:1和卡钼，或足叶乙苷或顺钼或长春新碱；或SEQ ID N0:5和卡钼,或足叶乙苷或顺钼或长春新碱。
28.根据权利要求1至24中任一项所述的寡核苷酸或根据权利要求25-27所述的组合物，用作药物或诊断剂。
29.根据权利要求28所述的寡核苷酸或组合物，用于遗传和/或病毒来源的疾病的治疗中或用于治疗肿瘤，所述遗传和/或病毒来源的疾病和所述肿瘤由基因的超表达和/或抑制引起。
30.根据权利要求28或29所述的寡核苷酸或组合物，其中所述遗传疾病选自由Gorlin 综合症、唐氏综合症、Feingold 综合症、Hirschsprung’ s 病、Von Hippel Lindau综合症、共济失调毛细血管扩张、L1-Fraumeni综合症、Turcot综合症、家族性肿瘤和帕金森病；所述肿瘤是成人或儿科的成人或儿科肿瘤，优选选自:成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤、成神经管细胞瘤、室鼓膜瘤、嗜铬细胞瘤、胚胎癌、生殖细胞肿瘤、腺泡状横纹肌肉瘤、胚胎横纹肌肉瘤、Wilms’肿瘤、肾脏的透明细胞肉瘤、滑膜肉瘤、肝胚细胞瘤、急性淋巴性白细胞、慢性淋巴性白血病、急性淋巴母细胞白血病、慢性淋巴母细胞白血病、Burkitf s淋巴瘤、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性原巨核细胞白血病、B慢性淋巴性白血病、T-细胞白血病、淋巴瘤、小细胞肺癌(肺微小细胞瘤)、肺腺癌、鳞状上皮细胞肺癌、典型和非典型原发性肺癌、大细胞肺癌、大细胞神经内分泌性肺癌、成胶质细胞瘤、肝癌、基细胞癌、 卵巢肿瘤、乳房肿瘤和结肠癌组成的组。
【文档编号】A61P35/00GK104169421SQ201380009360
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2013年2月21日 优先权日:2012年2月24日
【发明者】罗伯特·托内利, 利奥纳多·万徒勒里, 安德里亚·托尔托里, 卢卡·蒙特穆罗 申请人:生物基因有限责任公司