用于治疗细菌感染的包含抗细菌噬菌体的混合物的组合物及其使用方法
【专利摘要】本发明涉及用于治疗和控制细菌感染(特别是糖尿病足感染)的噬菌体治疗领域。更具体而言，本发明涉及噬菌体菌株F44/10、F125/10、F770/05、F510/08、F1245/05、和/或其变体的新型混合物；以及使用该混合物来治疗和预防细菌感染的方法，包括由例如金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌和/或鲍曼不动杆菌引起的与糖尿病足感染有关的皮肤溃疡。所述的混合物可以单独用作药物组合物，或者与其他疗法(例如抗生素、生长因子或者糖尿病足感染的其他标准及非标准的疗法)进一步结合来用作药物组合物。NCIMB4186520110916NCIMB4186620110916NCIMB4186720110916NCIMB4186420110916NCIMB4186320110916NCIMB4186220110916NCIMB4186120110916NCIMB4186820110916
【专利说明】用于治疗细菌感染的包含抗细菌噬菌体的混合物的组合物 及其使用方法
[0001] 序列表
[0002] 本发明包含序列表，该序列表通过EFS-Web以ASCII形式提交，并以引用方式全文 并入本文。在2012年3月14日创建的所述ASCII拷贝命名为16395105. txt，并且大小为 574, 104 字节。
【技术领域】
[0003] 本发明涉及用于治疗和控制细菌感染（具体为慢性溃疡，例如糖尿病足感染）的 噬菌体疗法领域。更具体而言，本发明涉及噬菌体菌株F44/10、F125/10、F770/05、F510/08、 F1245/05、其他噬菌体和/或其变体的新型混合物；以及使用该混合物在治疗和预防细 菌感染中的方法，包括由例如金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)、绿脓假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa)和/或鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii)引起的与糖 尿病足感染有关的皮肤溃疡。所述的混合物可以单独地用作药物组合物，或者与其他疗法 (例如抗生素、生长因子或用于慢性溃疡的其他标准或非标准的疗法）进一步组合使用。
【背景技术】
[0004] 糖尿病足感染（DFI)是糖尿病（DM)的频繁且严重的并发症，并且是全世界非创伤 性下肢截肢的主要因素 （Jeffcoate WJ，et al. 2003. Lancet 361:1545-1551)。在目前的 临床实践中，DFI的治疗包括清创术和系统性抗生素（例如参见Lipsky BA，et al. 2004. Clin Infect Dis. 39:885-910)。然而，由于血管化缺陷及局部微环境，所以抗生素浓度为 多次低治疗浓度（Lipsky BA, et al. 2009. Clin Infect Dis. 49:1541-1549)。此外，随着 社区和医院患者数量的逐渐增多，多重耐药有机体（例如甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌 以及泛耐药非发酵阴性杆菌）的发生率的增加威胁着上述结果（Mendes JJ，et al. 2012. Diabetes Res Clin Pract. 95(I):153-161 ;Tascini C,et al. 2011. Diabetes Res Clin Pract 94(1): 133-139)。因此，仍需要鉴定用于治疗、控制和处理DFI的新方案。
[0005] 局部治疗提供了避免系统性不利作用、提供增加的靶位点浓度并允许使用不可 用于系统性疗法的试剂的优点。由于机械清创术降低了细菌存在的生物负担并且还为局 部抗微生物疗法（TAT)开放了时间依赖的治疗窗口，其改善了局部治疗（Wolcott RD，et al. 2010. J Wound Care 19:320-328)。然而，到目前为止，没有TAT试剂被证明可以有效用 于治疗 DFI (Nelson EA, et al. 2006. Diabet Med23:348-359) 〇
[0006] 噬菌体为特异性地感染并溶解细菌的病毒。噬菌体疗法由Felixd' Herelle在 二十世纪20年代引入，其为使用整个噬菌体病毒来治疗细菌感染疾病的方法。但是随着抗 生素在二十世纪40年代的发展，西方世界对基于噬菌体的疗法的兴趣下降。导致这种下降 的最重要的因素之一是缺乏标准的测试方案和生产方法。就噬菌体疗法的价值而言，不能 研发出用于测试噬菌体疗法的工业规模的标准干扰了研宄结果的记录，导致可觉察的效力 缺乏及可靠性问题。噬菌体生产的另一个问题涉及噬菌体的商业化制备物的纯度级别，其 中制备物包含不需要的细菌成分，例如内毒素。因此，不良事件通常与制备物有关，特别是 在静脉接受它们的患者中。
[0007] 然而，在东欧和前苏联（接受抗生素受到限制的地方），噬菌体疗法的发展和使用 与抗生素相关联地继续着，或者替代了抗生素。此外，随着许多细菌的抗生素抗性菌株的出 现，对噬菌体基疗法的兴趣重返西方世界。换言之，即使可以研发新种类的抗生素，但是细 菌将逐渐发展出对新药品的抗性的前景加剧了对用于控制、预防和治疗细菌感染的非化学 疗法手段的探索。
[0008] 溶菌性噬菌体，特别是在补充有充分的机械清创术时，提供治疗DFI的溶液， 例如用作新型TAT试剂。溶菌性细菌可以在溶解病原体细菌（特别是与多重抗药性有 关的那些）中提供特异性和有效性的优点（Rossney AS，et al. 1994. J Hosp Infect 26:219-234)。其他的优点可以包括缺乏对人和动物的致病性（Burrowes B，et al. 2011. Expert Rev Anti Infect Ther 9:775-785)，在生物膜中针对细菌的抗细菌活性，在微需氧 环境（甚至具有高的细菌负荷）中的活性（Azeredo J，et al. 2008. Curr Pharm Biotechnol 9:261-266)，以及在世界上某些地方噬菌体疗法通常可接受的安全性（Sulakvelidze A，et al·，2001，Antimicrob Agents Chemother. 45 (3): 649-659)。近期·菌体疗法的动物试验 证明了其在内部（McVay CS, et al. 2007. Antimicrob Agents Chemother 51:1934-1938) 和外部应用（Soothill JS. 1994.Burns20:209-211;Wills QF, et al.2005.Antimicrob Agents Chem〇ther49:1220-1221)中治愈或改善皮肤细菌疾病的潜力。但是，支持使用 B莖菌体来治疗形成超过几个小时的感染的公开证据较少（Ryan EM, et al.2011J Pharm Pharmacol 63:1253-1264)。
[0009] 具体而言，例如在增加针对具体细菌菌株的溶菌活性以及降低对单一噬菌体具有 抗性的细菌出现的可能性方面，噬菌体混合物可以提供强于使用单一噬菌体的优点。换言 之，不同的噬菌体可以混合成混合物，从而拓宽它们的性质，由此优选地得到整体更广的抗 细菌活性谱系，例如扩大的宿主范围，对于该范围的宿主，发展出抗性的可能性较低。但是， 到目前为止，很少有噬菌体混合物具有针对不同细菌的抗微生物活性，可能是因为在将不 同特异性的噬菌体结合起来同时保持储存稳定性中存在困难。
[0010] 因此，需要研发出作为用于体内针对致病性细菌的治疗性试剂和/或预防性试剂 的新型噬菌体产物。此外，还需要更好的DFI治疗，特别是局部治疗。具体而言，需要能够 溶解导致DFI的细菌的噬菌体混合物，包括金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌和/或鲍曼不动 杆菌。本申请解决了这种及其他的需要。
[0011] 发明概述
[0012] 在一个方面中，本发明涉及包括噬菌体混合物的组合物。在一些实施方案中，本 发明提供了包含至少2种不同的分离的噬菌体菌株的组合物，每种噬菌体菌株都具有包 含选自如下核酸序列的基因组：SEQ ID N0:1(F44/10)，SEQ ID N0:2(F125/10)，SEQ ID N0:3(F770/05)，SEQ ID N0:4(F510/08)，SEQ ID N0:5(F1245/05)，或其变体，所述的变体与 相应的核酸序列具有至少95%的序列一致性并且显示出针对金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞 菌和/或鲍曼不动杆菌中的至少一种的抗细菌活性。在一些实施方案中，所述的至少2种 噬菌体菌株中的一种为具有如下基因组的菌株，所述的基因组包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:2或者其变体的核酸序列。在一些实施方案中，所述的至少2种噬菌体菌株为具有如下 基因组的菌株，所述的基因组包含SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2或者其变体的核酸序列。 在一些实施方案中，所述的组合物进一步包含至少第三噬菌体菌株，所述第三噬菌体菌株 具有包含选自下述核酸序列的基因组：SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO: 5或者其 变体。在一些实施方案中，所述的组合物进一步包含至少第三和第四噬菌体菌株，该第三和 第四噬菌体菌株各自具有包含选自如下核酸序列的基因组：SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4和 SEQ ID N0:5或者其变体。在一些实施方案中，所述的至少2种噬菌体菌株中的一种为具 有如下基因组的菌株，所述的基因组包含SEQ IDNO: 3或EQ ID NO:4或者其变体的核酸序 列。在一些实施方案中，所述的至少2种噬菌体菌株为具有如下基因组的菌株，所述的基因 组包含SEQ ID NO: 3和EQ ID NO:4或者其变体的核酸序列。在一些实施方案中，所述的组 合物进一步包含至少第三噬菌体菌株，所述第三噬菌体菌株具有包含选自如下核酸序列的 基因组：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:5或者其变体。在一些实施方案中，所述 的组合物进一步包含至少第三和第四噬菌体菌株，该第三和第四噬菌体菌株各自具有包含 选自如下核酸序列的基因组：SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:5或者其变体。在 一些实施方案中，所述的至少2种噬菌体菌株中的一种为具有如下基因组的菌株，所述的 基因组包含SEQ ID N0:5或者其变体的核酸序列。在一些实施方案中，所述的组合物进一 步包含至少第三噬菌体菌株，该噬菌体菌株具有包含选自如下核酸序列的基因组：SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4或者其变体。在一些实施方案中，所述的 组合物进一步包含至少第三和第四噬菌体菌株，该第三和第四噬菌体菌株各自具有包含选 自如下核酸序列的基因组：SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4或者 其变体。
[0013] 在一些优选的实施方案中，本发明涉及包含至少5种分离的噬菌体菌株的组合 物，其中所述的菌株具有如下基因组，所述的基因组包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4和SEQ ID N0:5或者其变体的核酸序列，其中所述的变体与相应的核酸 序列具有至少95%的序列一致性并且显示出针对金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌和/或鲍 曼不动杆菌中的至少一种的抗细菌活性。在一些实施方案中，具有包含SEQ ID NO: 1，2, 4和 5或者其变体的核酸序列的基因组的噬菌体菌株各自以相当于具有包含SEQ ID N0:3或者 其变体的核酸序列的基因组的噬菌体菌株大约10倍的量存在于所述的组合物中。在一些 实施方案中，所述的组合物包含具有如下基因组的噬菌体菌株，所述的基因组包含SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4 和 SEQ ID N0:5 的核酸序列。
[0014] 在另一个方面中，本发明涉及包含噬菌体混合物的药物组合物，特别是包含上述 任一种组合物和药物可接受的载体的药物组合物。在一些实施方案中，所述的药物组合物 被配制用于局部应用。在一些实施方案中，所述的药物组合物包括无菌缓冲剂，例如包含大 约0. 05MTris-HCl、大约0. IM NaCl和大约IOmM MgSO4. 7H20的缓冲剂。在一些实施方案中， 所述的药物组合物装在安瓿瓶中。
[0015] 在一些实施方案中，所述的药物组合物进一步包含其他试剂，例如选自抗生素试 剂、抗炎症试剂、抗病毒试剂、局部麻醉剂、生长因子和皮质类固醇中的试剂。在一些实施方 案中，其他试剂为抗生素试剂，例如具有针对鲍曼不动杆菌、绿脓假单胞菌和/或金黄色葡 萄球菌的抗细菌活性的抗生素试剂；或者具有针对除了鲍曼不动杆菌、绿脓假单胞菌和金 黄色葡萄球菌以外的细菌的抗细菌活性的抗生素试剂。更具体而言，在一些实施方案中，其 他试剂为具有针对金黄色葡萄球菌的抗细菌活性的抗生素试剂或具有针对除了金黄色葡 萄球菌以外的细菌的抗细菌活性的抗生素试剂。在一些实施方案中，其他试剂为具有针对 绿脓假单胞菌的抗细菌活性的抗生素试剂或具有针对除了绿脓假单胞菌以外的细菌的抗 细菌活性的抗生素试剂。在一些实施方案中，其他试剂为具有针对鲍曼不动杆菌的抗细菌 活性的抗生素试剂或具有针对除了鲍曼不动杆菌以外的细菌的抗细菌活性的抗生素试剂。 在一些实施方案中，抗生素试剂的施用包括系统施用。
[0016] 在一些实施方案中，所述的组合物用于治疗与不完整皮肤的区域有关的细菌感 染，并且各种噬菌体菌株以相当于IO 3至10 13噬菌体颗粒/cm 2所述区域的量存在于所述的 组合物中。在一些实施方案中，各种噬菌体菌株以相当于IO7至IO 9噬菌体颗粒/cm2所述 区域的量存在于所述的组合物中。
[0017] 本发明的另一个方面涉及治疗或预防有需要的受试对象中的细菌感染的方法，该 方法包括向受试对象施用治疗有效量的根据本发明的药物组合物。在一些实施方案中，细 菌感染为由鲍曼不动杆菌、绿脓假单胞菌和金黄色葡萄球菌中的一种或多种引起的感染。 在一些实施方案中，所述的药物组合物为局部施用。在一些实施方案中，受试对象为哺乳动 物，例如人。在一些实施方案中，细菌感染为糖尿病足感染。在一些实施方案中，糖尿病足 感染包括皮肤溃疡。在一些实施方案中，细菌感染与不完整皮肤的区域有关，其中所述的不 完整皮肤的区域选自与蜂窝组织炎、丹毒病变、烧伤、慢性溃疡、褥疮性溃疡和压疮有关的 伤处。在一些实施方案中，治疗包括向与糖尿病足感染有关的皮肤溃疡局部施用所述的药 物组合物。在一些优选的实施方案中，在溃疡的机械清创术后进行所述的施用。在一些实 施方案中，所述的施用包括使用敷料、滴注装置和负压伤口治疗装置中的至少一种。
[0018] 在一些实施方案中，在最初的24小时内，每4小时或每6小时施用所述的药物组 合物。在一些实施方案中，在最初的24小时后，在至少其他3天中，每12小时或每24小时 施用所述的药物组合物。在一些实施方案中，在至少其他4天中，每12小时或每24小时施 用所述的药物组合物。
[0019] 在一些实施方案中，所述的方法与糖尿病足感染的标准疗法组合使用，例如选自 细胞外基质替代疗法、湿性伤口疗法、负压伤口疗法、动脉血管再形成疗法、高压氧疗、施用 抗生素试剂和施用生长因子中的标准疗法。在一些实施方案中，湿性伤口疗法包括使用粘 合性底膜、涂敷有机硅（Silicone)的泡沫、水凝胶和/或水状胶体。在一些实施方案中，细 胞外基质替代疗法包括使用生物改造的组织。在一些实施方案中，施用抗生素试剂包括系 统性施用。在一些实施方案中，生长因子为选自血小板衍生的生长因子、粒细胞集落刺激因 子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子和血管内皮细胞生长因子中的至少 一种。在一些实施方案中，施用生长因子包括局部施用。在一些实施方案中，所述的方法与 糖尿病足感染的非标准疗法组合使用，例如其中糖尿病足感染难以用标准疗法治疗。
[0020] 定义
[0021] 如本文所用，术语"分离的"就核酸分子而言，是指第一核酸分子，其与第一核酸分 子的天然来源中存在的其他核酸分子相分离。此外，"分离的"核酸分子（例如cDNA分子） 基本上不含其他细胞物质，或者在通过重组技术生产时基本上不含培养基，或者当以化学 方式合成时基本上不含化学前体或其他化学品，并且可以不含其他cDNA或其他基因组DNA 分子，例如在这种情况下，所述的核酸已经与核酸文库中其他的克隆分离。此外，"分离的" 基因组DNA基本上不含其他病毒细胞物质，或者在通过重组技术生产时基本上不含培养 基，或者当以化学方式合成时基本上不含化学前体或其他化学品，并且可以不含其他cDNA 或其他基因组DNA分子，例如在这种情况下，所述的核酸已经与包含多于一种的噬菌体和/ 或细菌菌株的制备物分离。
[0022] 就噬菌体而言，术语"纯化的"是指通过任何纯化工艺将噬菌体的浓度可测量地增 加，其中所述的工艺包括但不限于由环境或培养基中分离，例如在繁殖和/或扩增之后与 培养物分离、离心等，由此部分地、基本上、几乎完全地或完全地除去杂质，例如宿主细胞或 宿主细胞成分。本领域技术人员将理解的是用于给定用途所需要的纯化的量。例如根据管 理标准和良好的生产规范，打算用于旨在施用给人类的治疗组合物的分离的噬菌体通常必 须是高纯度的。
[0023] 术语"纯化的"是指通过任何纯化工艺，肽、多肽、融合蛋白质或核酸分子的浓度已 经可测量地增加，所述纯化工艺包括但不限于柱色谱、HPLC、沉淀、电泳等，从而部分地、基 本上、基本完全地或完全地除去杂质，例如与制备肽、多肽、融合蛋白质或核酸分子有关的 前体或其他化学品。本领域的技术人员将理解的是用于给定用途所需要的纯化的量。例如 根据管理标准和良好的生产规范，打算用于治疗组合物（将施用人类）的分离的基因组DNA 通常必须是高纯度的。
[0024] 如本文所用，术语"变体"就核酸序列而言是指这样的核酸序列，其中包含或者 由与参照核酸序列具有至少80%、85%、90%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或者至少 99%的序列一致性的核酸序列组成。可以选择保持参照核酸序列的一种或多种功能的变 体。例如变体噬菌体可以表现出与衍生出该变体噬菌体的噬菌体的至少一种生物学活性， 例如抗微生物或抗细菌活性（例如溶菌性杀伤活性）。
[0025] 如本文所用，术语"宿主细胞"是指使用核酸分子转染的特定的受试对象细胞，以 及包含核酸分子或染色体整合的核酸分子的此类细胞的后代或潜在后代。此类细胞的后代 可以与核酸分子转染的亲代细胞不同，这是由于突变或环境影响，这种突变或环境影响可 以在随后的传代或核酸分子整合到宿主细胞基因组中发生。对于噬菌体传代而言，宿主细 胞可以与分离或培养出噬菌体的物种或菌株相同或不同。
[0026] 如本文所用，术语"组合"、"其他的组合"或"进一步组合"是指使用其他的预防性 试剂和/或治疗性试剂、以及本发明的噬菌体混合物。术语"组合"的使用不限定预防性试 剂和/或治疗性试剂被施用给受试对象的顺序。第一预防性试剂或治疗性试剂可以在将第 二预防性试剂或治疗性试剂（不同于第一预防性试剂或治疗性试剂）施用给受试对象之前 (例如之前的5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24 小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周）、同时或随后 (例如之后的5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24 小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周）施用。
[0027] 如本文所用，术语"治疗性试剂"和"预防性试剂"是指诸如本发明的噬菌体混合 物之类的试剂，其可以用于预防、处理或控制疾病或紊乱的一种或多种症状，特别是与细菌 感染有关的疾病或紊乱，例如糖尿病足感染。
[0028] 如本文所用，术语"治疗性试剂"是指可以用于治疗、处理或控制一种或多种疾病 或紊乱的症状的试剂（例如本发明的噬菌体混合物），特别是与细菌感染（例如糖尿病足感 染）有关的疾病或紊乱。
[0029] 如本文所用，术语动词性"治疗"、名词性"治疗"和动名词性"治疗"是指在接受药 物组合物的受试对象中获得治疗性益处。就取得治疗性益处而言，目的是消除、减轻、降低 与致病状况或紊乱有关的症状或根本原因（例如细菌感染）的严重性，缓解或减慢与致病 状况或紊乱有关的症状或根本原因（例如细菌感染）的进程。"治疗有效量"是指治疗性试 剂（例如本发明的噬菌体混合药物组合物）在接受药物组合物的受试对象中足以取得至少 一种治疗性益处的量。
[0030] 如本文所用，术语动词性"预防"、名词性"预防"和动名词性"预防"是指在接受 药物组合物的受试对象中获得预防性益处。就取得预防性益处而言，目的是延迟或阻止与 致病状况或紊乱有关的症状或根本原因（例如细菌感染）。"预防有效量"是指预防性试剂 (例如本发明的噬菌体混合药物组合物）在接受药物组合物的受试对象中足以取得至少一 种预防性益处的量。
[0031] 如本文所用，就噬菌体（或者其变体或片段）或噬菌体产物而言，术语"抗细菌活 性"和"抗微生物活性"可以交换使用，其是指杀灭和/或抑制微生物有机体（特别是噬菌 体感染的细菌物种或菌株）的生长或繁殖的能力。在某些实施方案中，抗细菌或抗微生物 活性通过以下评估：根据标准的技术（例如在液体培养物中或在琼脂平板上）培养细菌，例 如革兰氏阳性细菌（例如金黄色葡萄球菌）、革兰氏阴性细菌（例如鲍曼不动杆菌、大肠杆 菌、和/或绿脓假单胞菌）、或者未分类为革兰氏阳性或革兰氏阴性的细菌；使所述的培养 物与本发明的噬菌体或其变体接触；以及在所述的接触后监测细胞的生长。例如在液体培 养物中，可以使细菌生长至代表了培养物指数生长的中点的光密度（"OD"）；使培养物暴 露于本发明的一种或多种噬菌体或其变体的一种或多种浓度，并监测相对于对照培养物的 OD。OD相对于对照培养物降低代表了噬菌体展现出抗细菌活性（例如表现出溶菌性杀灭活 性）。类似地，可以允许在琼脂平板上形成细菌菌落，将该平板暴露于本发明的一种或多种 噬菌体或其变体；以及随后评价菌落相对于对照平板的生长情况。菌落大小的减小或菌落 总数的减少表明噬菌体具有抗细菌活性。
【专利附图】
【附图说明】
[0032] 图1示出了根据本发明的示例性噬菌体混合组合物的制备。
[0033] 图2示出了在根据本发明的示例性噬菌体混合组合物的大鼠模型中，用于证明体 内效力的研宄方案。
[0034] 图3示出了在根据本发明的示例性噬菌体混合组合物的猪模型中，用于证明体内 效力的研宄方案。
[0035] 图4示出了针对金黄色葡萄球菌743/06评价的溶菌性研宄结果，其证明根据本发 明的示例性噬菌体混合组合物的体外效力。
[0036] 图5示出了针对绿脓假单胞菌433/07评价的溶菌性研宄结果，其证明根据本发明 的示例性噬菌体混合组合物的体外效力。
[0037] 图6示出了针对鲍曼不动杆菌1305/05评价的溶菌性研宄结果，其证明根据本发 明的示例性噬菌体混合组合物的体外效力。
[0038] 图7示出了接种有金黄色葡萄球菌、接种有绿脓假单胞菌和接种有鲍曼不动杆菌 的动物的对照组（C)和测试组（T)的微生物负荷分析结果，其证明根据本发明的示例性噬 菌体混合组合物在大鼠模型中的体内效力。
[0039] 图8示出了接种有金黄色葡萄球菌、接种有绿脓假单胞菌和接种有鲍曼不动杆菌 的动物的阴性组、对照组（C)和测试组（T)的伤口闭合分析结果，其证明根据本发明的示例 性噬菌体混合组合物在大鼠模型中的体内效力。
[0040] 图9示出了接种有金黄色葡萄球菌、接种有绿脓假单胞菌和接种有鲍曼不动杆菌 的动物的阴性组、对照组（C)和测试组（T)的组织学分析结果，其证明根据本发明的示例性 噬菌体混合组合物在大鼠模型中的体内效力。
[0041] 图10示出了接种有金黄色葡萄球菌、接种有绿脓假单胞菌和接种有鲍曼不动杆 菌的动物的对照组（C)和测试组（T)的微生物负荷分析结果，其证明根据本发明的示例性 噬菌体混合组合物在猪模型中的体内效力。
[0042] 图11示出了接种有金黄色葡萄球菌、接种有绿脓假单胞菌和接种有鲍曼不动杆 菌的动物的阴性组、对照组（C)和测试组（T)的伤口闭合分析结果，其证明根据本发明的示 例性噬菌体混合组合物在猪模型中的体内效力。
[0043] 图12示出了接种有金黄色葡萄球菌、接种有绿脓假单胞菌和接种有鲍曼不动杆 菌的动物的阴性组、对照组（C)和测试组（T)的组织学分析结果，其证明根据本发明的示例 性噬菌体混合组合物在猪模型中的体内效力。
[0044] 图13示出了糖尿病足感染的分类以及使用根据本发明的示例性噬菌体混合组合 物对其实施噬菌体疗法的应用。
[0045] 图14示出了根据本发明的示例性噬菌体混合组合物用于糖尿病足部溃疡疗法中 的临床研宄设计。
[0046] 发明详述
[0047] 本发明涉及用于治疗和控制细菌感染（特别是糖尿病足感染）的噬菌体疗法。在 一个方面中，本发明涉及不同噬菌体菌株的新型混合组合物。"混合物"可以包括至少2种 不同的分离的噬菌体菌株，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多不同的分离的噬菌体菌株。混 合物可以单独使用，或者与其他疗法（例如抗生素试剂和/或生长因子）进一步组合使用。
[0048] 噬菌体混合物提供了强于使用单独的噬菌体的益处，例如增加针对具体细菌菌株 的溶菌活性和/或降低对单独噬菌体具有抗性的细菌出现的可能性。不同的噬菌体可以混 合成混合物，从而拓宽它们的性质，由此优选地得到整体更广的抗细菌活性谱系。但是，很 少有噬菌体混合物具有针对不同细菌的抗微生物活性，可能是因为在将不同特异性的噬菌 体菌株组合同时在截然不同的噬菌体菌株存在下保持单独噬菌体的感染能力和/或溶菌 活性存在困难。
[0049] 在一些特别优选的实施方案中，本发明提供了包含5种分离的菌体菌株 F44/10、F125/10、F770/05、F510/08和F1245/05的混合组合物，其中所述的混合组合物被 配制成局部配制物，并且在治疗和/或预防糖尿病足感染中发挥作用。
[0050] 在一些实施方案中，本发明提供了混合组合物，其包含至少2种不同的分离的噬 菌体菌株，具有针对相同或不同细菌物种或菌株的抗细菌活性。在优选的实施方案中，所述 的混合物的治疗性成分靶向2种或更多种细菌物种或菌株。在一些实施方案中，噬菌体混 合物包含至少2种噬菌体菌株、至少3种噬菌体菌株、至少4种噬菌体菌株、至少5种噬菌 体菌株、至少6种噬菌体菌株、至少7种噬菌体菌株、至少8种噬菌体菌株、至少9种噬菌体 菌株、至少10种噬菌体菌株或更多。在一些实施方案中，噬菌体混合物包含2-20种噬菌体 菌株、2-15种噬菌体菌株、2-10种噬菌体菌株、3-8种噬菌体菌株、或者4-6种噬菌体菌株。 在更优选的实施方案中，在截然不同的噬菌体菌株存在下，所述的组合不损害或降低（或 者不基本上或显著地损害或降低）单一噬菌体的感染能力和/或溶菌活性。
[0051] 在一些实施方案中，所述的混合物的至少一种噬菌体菌株为具有针对至少一种革 兰氏阴性细菌的抗细菌活性的菌株，所述革兰氏阴性细菌包括但不限于鲍曼不动杆菌和绿 脓假单胞菌；和/或具有针对至少一种革兰氏阳性细菌的抗细菌活性的菌株，所述革兰氏 阳性细菌包括但不限于金黄色葡萄球菌。在一些实施方案中，所述的混合组合物包含至少 2种不同的分离的噬菌体菌株，其中所述的菌株表现出针对金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌 和/或鲍曼不动杆菌中的至少1种的抗细菌活性。在一些更优选的实施方案中，所述的混 合组合物表现出针对金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌和/或鲍曼不动杆菌中的至少1种的 抗细菌活性。在一些甚至更优选的实施方案中，所述的混合组合物表现出针对金黄色葡萄 球菌、绿脓假单胞菌和/或鲍曼不动杆菌中的每一种的抗细菌活性
[0052] 在一些实施方案中，所述的混合组合物包含至少一种表现出针对金黄色葡萄球菌 的抗细菌活性的噬菌体菌株。金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球形兼性厌氧生物，其生长成 葡萄状簇，具有特征性的金色，并且为葡萄球菌感染的最常见的因素。金黄色葡萄球菌是 人类皮肤菌丛的最常见的部分，并且造成广泛的感染，包括丘瘆、痈、烫伤样皮肤综合征、肺 炎、肠胃炎、脑膜炎、骨髓炎、心内膜炎、中毒性休克综合征、菌血症和脓毒病。此外，金黄色 葡萄球菌通常与糖尿病足感染有关，包括但不限于皮肤溃疡。此类皮肤溃疡在本文中还称 为"糖尿病足部溃疡"。
[0053] 特别受到关注的是甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌菌株（MRSA)。直到二十世纪 90年代，MRSA在医院环境中才开始出现，那时医院爆发了 MRSA流行病。MRSA目前被认 为是医院特有的，特别是在 UK(Johnson AP et al.2001J. Antimicrobial Chemotherapy 48(1):143-144)。此外，MRSA在糖尿病足感染中呈现出新的威胁（Retrieved January 17, 2009, from CDC:Centers for Disease Control and Prevention Web site)。在糖尿 病患者足部形成的溃疡和开放性伤口将该患者置于感染MRSA的风险中，并且近期研宄显 示出当糖尿病患者伤口处存在MRSA时其会损害健康的证据（Bowling FL，et al.2009Curr Diab Rep 9 (6) :440-444)。此外，参见 Kosinski, MA, et al. 2010. Expert Rev AntiInfect Ther.8(11):1293-1305。
[0054] 在一些实施方案中，本发明提供了包含具有如下基因组的噬菌体的混合组合物， 其中所述的基因组包含或由SEQ ID NO: 1的核酸序列组成。根据该实施方案的具体的实 例为分离的噬菌体F44/10,其靶向多种葡萄菌属物种的菌株，包括金黄色葡萄球菌。根 据布达佩斯条约，菌株F44/10于2011年9月16日保藏在NCIMB Limited(Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, AB219YA, Scotland UK)，并且登录 号为41867。在一些实施方案中，本发明提供了包含具有如下基因组的噬菌体的混合组合 物，其中所述的基因组包含或由SEQ ID N0:2的核酸序列组成。根据该实施方案的具体的 实例为分离的噬菌体F125/10,其也靶向多种葡萄菌属物种的菌株，包括金黄色葡萄球菌。 根据布达佩斯条约，菌株F125/10于2011年9月16日保藏在NCMB LimitecKFerguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, AB219YA, Scotland UK)，并且登录号 为41866。在一些实施方案中，混合组合物包含至少F44/10和F125/10噬菌体菌株。在某 些实施方案中，噬菌体混合物包含至少一种表现出针对一种或多种金黄色葡萄球菌菌株的 抗细菌活性的噬菌体菌株（例如F44/10和F125/10)，和至少一种表现出针对不同细菌的抗 细菌活性的噬菌体菌株。例如在一些实施方案中，噬菌体混合物包含具有如下基因组的噬 菌体菌株，所述基因组包含或由SEQ ID NO: 1或2、或者其变体组成，以及至少一种具有如下 基因组的其他噬菌体菌株，所述基因组包含或由SEQ ID N0:3、4或5、或者其变体组成）。
[0055] 在一些实施方案中，所述的混合组合物包含至少一种表现出针对绿脓假单胞菌 的抗细菌活性的噬菌体菌株。绿脓假单胞菌是在土壤、水、皮肤菌丛以及大多数的人造环 境中发现的普通的革兰氏阴性杆状细菌。绿脓假单胞菌不仅在正常气氛中生长旺盛，而且 在很少的氧气下作为兼性厌氧生物生长，并且可以影响损坏的组织或免疫系统损伤的个 体，包括糖尿病患者。事实上，绿脓假单胞菌在糖尿病足部溃疡中通常导致严重的组织损 坏，并且绿脓假单胞菌感染的主要问题在于这种病原体对广谱抗生素表现出高度的抗性 (Murugan，S.et al.2010Intl J of Microbiol Res 1 (3): 123-128)。例如在 Murugan 等人 的研宄中，发现由糖尿病足部溃疡得到的100 %的绿脓假单胞菌分离物对美罗培南具有抗 性，并且发现超过71 %的绿脓假单胞菌分离物对亚胺培南具有抗性。
[0056] 在一些实施方案中，本发明提供了包含具有如下基因组的噬菌体，其中所述的基 因组包含或由SEQ ID N0:3的核酸序列构成。根据本实施方案的具体实例为分离的噬菌体 F770/05,其靶向多种假单胞菌物种的菌株，包括绿脓假单胞菌。此外，参见国际申请公开 W02010/090542,其中公开了所述的噬菌体菌株。根据布达佩斯条约，菌株F770/05于2011 年 9 月 16 日保藏在 NCIMB Limited (Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, AB219YA，Scotland UK)，并且登录号为41864。在一些实施方案中，本发明提供 了包含噬菌体的混合组合物，其中所述的噬菌体具有如下基因组，所述基因组包含或由SEQ ID N0:4的核酸序列构成。根据本实施方案的具体实例为分离的噬菌体F510/08,其也靶向 多种假单胞菌物种的菌株，包括绿脓假单胞菌。根据布达佩斯条约，菌株F510/08于2011 年9 月 16 日保藏在NCIMB Limited(Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, A berdeen，AB219YA，Scotland UK)，并且登录号为41868。在一些实施方案中，所述的混合组 合物包括至少F770/05和F510/08噬菌体菌株两者。在某些实施方案中，所述的噬菌体混 合物包含至少一种表现出针对一种或多种金黄色葡萄球菌菌株的抗细菌活性的噬菌体菌 株（例如F770/05和F510/08)，和至少一种表现出针对不同细菌的抗细菌活性的噬菌体菌 株。例如在一些实施方案中，噬菌体混合物包含具有如下基因组的噬菌体菌株，所述基因组 包含或由SEQ ID NO: 3或4、或者其变体组成，以及至少一种具有如下基因组的其他噬菌体 菌株，所述基因组包含或由SEQ ID NO: 1、2或5、或者其变体组成。
[0057] 在一些实施方案中，所述的混合组合物包含至少一种表现出针对鲍曼不动杆菌的 抗细菌活性的噬菌体菌株。鲍曼不动杆菌是一种导致多种严重的临床感染的细菌物种， 特别是在具有受损的免疫系统的个体中，包括糖尿病患者。例如已经由患有下肢感染的 糖尿病患者中分离出鲍曼不动杆菌（Colayco，CAS，et al 2002Phil J Microbiol Infect Dis 31(4) :151-106)。鲍曼不动杆菌为多形性需氧革兰氏阴性杆菌，其通常会通过开放性 伤口进入肌体，例如糖尿病足部溃疡。此外，已知鲍曼不动杆菌对多种抗生素具有抗性， 并且由鲍曼不动杆菌引起的医院内感染的数量今年来有所上升。此外参见Browne AC, et al.20010stomy Wound Management 47(10) :44-49(其讨论了金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞 菌和不动杆菌物种在糖尿病足部溃疡中的发生）。鲍曼不动杆菌是通常在伤口感染过程的 后期出现的定植者。因此，在某些实施方案中，重要的是噬菌体混合组合物包含感染鲍曼不 动杆菌的噬菌体。
[0058] 在一些实施方案中，本发明提供了包含具有如下基因组的噬菌体的混合组合物， 所述的基因组包含或由SEQ ID N0:5的核酸序列构成。根据本实施方案的具体实例为分 离的噬菌体F1245/05,其靶向多种不动杆菌物种的菌株，包括鲍曼不动杆菌。此外，参见 国际申请公开WO 2010/090542,其中公开了所述的噬菌体菌株。根据布达佩斯条约，菌株 F1245/05 于 2011 年 9 月 16 日保藏在 NCIMB Limited (Ferguson Building, Craibstone Es tate, Bucksburn, Aberdeen, AB219YA, Scotland UK)，并且登录号为 41865。在某些实施方案 中，所述的噬菌体混合物包含至少一种表现出针对一种或多种鲍曼不动杆菌菌株的抗细菌 活性的噬菌体菌株（例如F1245/05)，和至少一种表现出针对不同细菌的抗细菌活性的噬 菌体菌株。例如在一些实施方案中，噬菌体混合物包含具有如下基因组的噬菌体菌株，所述 基因组包含或由SEQ ID N0:5、或者其变体组成，以及至少一种具有如下基因组的其他噬菌 体菌株所述基因组包含或由SEQ ID NO: 1、2、3或4、或者其变体组成。
[0059] 在某些实施方案中，本发明的混合物包含噬菌体，该噬菌体为核酸序列SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4 和 SEQ ID N0:5 中的任意一种的变体，该变 体噬菌体表现出噬菌体菌株F44/10、F125/10、F770/05、F510/08和F1245/05中的一种或 多种的至少一种生物学活性，例如抗微生物或抗细菌活性（例如溶菌杀灭活性）。在一些 优选的实施方案中，噬菌体菌株F44/10或F125/10的变体保持针对一种或多种葡萄球菌物 种的菌株（更优选的是包括金黄色葡萄球菌）的抗微生物或抗细菌活性（例如溶菌杀灭活 性）。在一些优选的实施方案中，所述的混合物包含噬菌体菌株F770/05或F510/08的变 体，该变体保持针对一种或多种假单胞菌物种的菌株（更优选的是包括绿脓假单胞菌）的 抗微生物或抗细菌活性（例如溶菌杀灭活性）。在一些优选的实施方案中，所述的混合物包 含噬菌体菌株F1245/05的变体，该变体保持针对一种或多种不动杆菌物种的菌株（更优选 的是包括鲍曼不动杆菌）的抗微生物或抗细菌活性（例如溶菌杀灭活性）。
[0060] 变体噬菌体菌株可以包含或由如下基因组构成，所述的基因组具有与SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4 和 / 或 SEQ ID N0:5 的核酸序列至少 80%、 85%、90%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或者至少99%的序列一致性，所述的噬菌体 变体分别表现出噬菌体F44/10、F125/10、F770/05、F510/08和F1245/05的至少一种生物 学活性，例如抗微生物或抗细菌活性（例如溶菌杀灭活性）。在一些优选的实施方案中，噬 菌体菌株F44/10的变体包含或由如下基因组组成，所述的基因组具有与SEQ ID NO: 1的核 酸序列至少80%、85%、90%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或者至少99%的序列一致 性，并且所述的噬菌体菌株F44/10的变体保持针对一种或多种葡萄球菌物种的菌株（更优 选的是包括金黄色葡萄球菌）的抗微生物或抗细菌活性（例如溶菌杀灭活性）。在一些优 选的实施方案中，噬菌体菌株F125/10的变体包含或由如下基因组组成，所述的基因组具 有与 SEQ ID N0:2 的核酸序列至少80%、85%、90%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或者 至少99%的序列一致性，并且所述的噬菌体菌株F125/10的变体保持针对一种或多种葡萄 球菌物种的菌株（更优选的是包括金黄色葡萄球菌）的抗微生物或抗细菌活性（例如溶菌 杀灭活性）。在一些优选的实施方案中，噬菌体菌株F770/05的变体包含或由如下基因组组 成，所述的基因组具有与SEQ ID勵:3的核酸序列至少80%、85%、90%、93%、94%、95%、 96 %、97 %、98 %或者至少99 %的序列一致性，并且所述的噬菌体菌株F770/05的变体保持 针对一种或多种假单胞菌物种的菌株（更优选的是包括绿脓假单胞菌）的抗微生物或抗 细菌活性（例如溶菌杀灭活性）。在一些优选的实施方案中，噬菌体菌株F510/08的变体 包含或由如下基因组组成，所述的基因组具有与SEQ ID N0:4的核酸序列至少80%、85%、 90%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或者至少99%的序列一致性，并且所述的噬菌体菌 株F510/08的变体保持针对一种或多种假单胞菌物种的菌株（更优选的是包括绿脓假单胞 菌）的抗微生物或抗细菌活性（例如溶菌杀灭活性）。在一些优选的实施方案中，噬菌体菌 株P1245/05的变体包含或由如下基因组组成，所述的基因组具有与SEQ ID N0:5的核酸序 列至少80%、85%、90%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或者至少99%的序列一致性， 并且所述的噬菌体菌株P1245/05的变体保持针对一种或多种不动杆菌物种的菌株（更优 选的是包括鲍曼不动杆菌）的抗微生物或抗细菌活性（例如溶菌杀灭活性）。
[0061] 备选地或此外，本发明的混合物包含具有如下基因组的变体，所述的基因组包含 SEQ ID NO:l、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID N0:4 和 / 或 SEQ ID NO:5 的核酸序列 的功能片段，其中所述的变体分别表现出噬菌体F44/10、F125/10、F770/05、F510/08和 F1245/05的至少一种生物学活性，例如抗微生物或抗细菌活性（例如溶菌杀灭活性），优选 如上文所述。
[0062] 在一些实施方案中，本发明提供了混合组合物，该混合组合物包含至少2种不 同的分离的噬菌体菌株，各种菌株各自具有包含选自如下核酸序列的基因组：SEQ ID N0:1(F44/10)、SEQ ID N0:2(F125/10)、SEQ ID N0:3(F770/05)、SEQ ID N0:4(F510/08)和 SEQ ID N0:5(F1245/05)、或其变体，如上文所述。在一些优选的实施方案中，所述的混合组 合物包含至少一种具有如下基因组的噬菌体菌株，所述的基因组包含SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2或者其变体的核酸序列。在一些更优选的实施方案中，所述的混合组合物包含至少 2种具有如下基因组的噬菌体菌株，所述的基因组包含SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2或者其 变体的核酸序列。在一些还要更优选的实施方案中，所述的混合组合物包含至少第三噬菌 体菌株，该第三噬菌体菌株具有如下基因组，所述的基因组包含选自SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4和SEQ ID N0:5,或者其变体的核酸序列。在一些甚至更优选的实施方案中，所述的混 合组合物包含至少第三和第四噬菌体菌株，该第三和第四噬菌体菌株具有如下基因组，所 述的基因组包含选自SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4和SEQ ID NO: 5,或者其变体的核酸序列。
[0063] 在一些优选的实施方案中，所述的混合组合物包含至少一种具有如下基因组的噬 菌体菌株，所述的基因组包含SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4或者其变体的核酸序列。在一 些更优选的实施方案中，所述的混合组合物包含至少2种具有如下基因组的噬菌体菌株， 所述的基因组包含SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4或者其变体的核酸序列。在一些还要更 优选的实施方案中，所述的混合组合物包含至少第三噬菌体菌株，所述第三噬菌体菌株具 有如下基因组，所述的基因组包含选自SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:5,或者其 变体的核酸序列。在一些甚至更优选的实施方案中，所述的混合组合物包含至少第三和第 四噬菌体菌株，该第三和第四噬菌体菌株具有如下基因组，所述的基因组包含选自SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:5,或者其变体的核酸序列。
[0064] 在一些优选的实施方案中，所述的混合组合物包含具有如下基因组的噬菌体菌 株，所述的基因组包含SEQ ID NO: 5或其变体的核酸序列。在一些更优选的实施方案中，所 述的混合组合物包含噬菌体（其具有如下基因组，所述的基因组包含SEQ ID N0:5或其变 体的核酸序列）以及1、2或3种其他的噬菌体菌株（其各自具有如下基因组，所述的基因 组包含选自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4,以及它们的变体中 的核酸序列）。
[0065] 在特别优选的实施方案中，本发明提供了包含至少5种分离的噬菌体菌株的混合 组合物，所述的菌株具有如下基因组，所述的基因组包含SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4和SEQ ID N0:5、或其变体的核酸序列。在一些此类的实施方案中， 选择用于 SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4 或 SEQ ID N0:5 任意一 种的变体与相应的核酸序列具有至少93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列一 致性，并且显示针对金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌和鲍曼不动杆菌中的至少一种的抗细 菌活性。特别优选的实施方案将针对所有3种细菌菌株的抗细菌活性组合起来。在一些实 施方案中，所述的混合组合物进一步包含一种或多种其他的噬菌体菌株，所述其他噬菌体 菌株具有针对金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌和鲍曼不动杆菌中的至少一种和/或针对其 他细菌的抗细菌活性。
[0066] 在特别优选的实施方案中，本发明提供了混合组合物，该混合组合物包含5种分 离的噬菌体菌株，并进一步组合有至少一种其他的噬菌体菌株，其中所述的5种分离的噬 菌体菌株具有如下基因组，所述的基因组包含SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、 SEQ ID NO:4和SEQ ID NO: 5、或其变体的核酸序列。在一些优选的实施方案中，其他的噬 菌体菌株选自：噬菌体菌株F168/08,其具有针对粪肠球菌（E. faecalis)和/或屎肠球菌 (E.faecium)中的一种或多种菌株的抗生素活性（如在WO 2011/065854和美国专利申请
【发明者】J·J·D·阿尔维斯门德斯, C·I·罗德里格斯莱安德罗, S·弗尔克尔科尔特-雷亚尔 申请人:药物技术业制药技术股份有限公司, 抗菌技术, 生物技术研究与发展股份有限公司