具有药理学活性的纳米构建物的制作方法

具有药理学活性的纳米构建物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及在细胞胞质溶胶中转运活性物质的方法和工具。具体地，本发明涉及的工具，其能够在细胞胞质溶胶中直接转运与蛋白质系统相互作用的物质，如位于胞质溶胶内的核酸或活化T细胞的核因子(NFATs)家族。具体地，本发明涉及用于治疗炎性疾病的纳米构建物，它们的制备方法，以及含有它们的组合物。
【专利说明】具有药理学活性的纳米构建物
[0001] 设姐
[0002] 本发明涉及在细胞胞质溶胶中转运活性物质的方法和工具。具体地，本发明涉及 的工具，其能够在细胞胞质溶胶中直接转运与蛋白质系统相互作用的物质，如位于胞质溶 胶内的核酸或活化T细胞的核因子（NFAT)家族。具体地，本发明涉及用于治疗炎性疾病的 纳米构建物，它们的制备方法，以及含有它们的组合物。 现有技术
[0003] 胞质溶胶
[0004] 胞质溶胶是细胞器的胞质中，由矿物盐，有机分子，大分子和蛋白质的溶液形成的 可溶部分。对于细胞和生命体的生理学特性至关重要的生物化学反应一般发生在该细胞隔 室内。发生在此细胞胞质溶胶中的反应包括来自Ca 2+/钙调蛋白依赖性磷酸酶钙依赖磷酸 酶（Cn)蛋白质的NFAT蛋白的去磷酸化反应。
[0005] NFAT
[0006] NFAT 蛋白是指由成员 NFATl (NFATc2)、NFAT2 (NFATcl)、NFAT3(NFATc4)和 NFAT4(NFATc3)，以及它们的各种同种型构成的转录因子家族的成员。NFAT家族的蛋白在进 化学上与转录因子的REL-NF- κ B家族相连。NFAT蛋白最初鉴定为能够调节T细胞的IL-2 产生的转录因子，虽然此后鉴定到NFAT关于适应性免疫的各种功能，包括B和T-细胞的分 化和活化。
[0007] NFAT是在嗜中性粒细胞、巨噬细胞和树突细胞（DC)中对凝乳聚糖（Curdian)起反 应而被激活，但也在DC中对LPS起反应而被激活和在巨噬细胞中由TNF α调节。
[0008] 同种型1-4的活性受钙依赖磷酸酶（Cn)控制，其是Ca2+/钙调蛋白依赖性磷酸酶， 一旦被激活，会增加细胞内Ca 2+浓度并使得存在于NFAT的N-末端的磷酸化基序脱磷酸化， 表达用于确定NFAT的核输入的核序列。NFAT蛋白与统称为NFATn的伴侣蛋白相互作用以 产生活性NFAT转录因子复合物和在随后的分析中，控制细胞因子的产生。
[0009] 慢性和炎性自身免疫性疾病以及与移植排斥相关的问题通常使用免疫抑制药物 治疗，包括环孢菌素 A(CSA)和FK506,它们是活化的免疫细胞内细胞因子基因转录的强效 抑制剂。环孢素 A和FK506抑制Cn的活性。然而，它们有很明显的副作用。环孢素导致小 血管的血管病变，尤其是肾脏内，并因高血压和高血脂导致大血管的血管病变，而FK506可 导致肾毒性，神经毒性，糖尿病和高血压。这些药物的高水平毒性的原因在于Cn的普遍表 达，并且Cn不仅控制NFAT，还控制其它转录因子的活化。
[0010]因此需要新的，毒性较低的免疫抑制药物，能同时特异性抑制NFAT前体，抑制免 疫反应激活所需的关键炎性分子的表达。
[0011] VIVIT
[0012] 具有序列为Pro-X-Ile-X-Ile-Thr(PxIxIT)的肽，从在NFAT蛋白质中发现的隐 藏的Cn-结合基序衍生而来，与NFAT竞争结合Cn，从而在酶的测定中显示破坏NFAT的结 合和脱磷酸化。特别是，已经证明16聚体形式的寡肽缬氨酸-异亮氨酸-缬氨酸-异亮 氨酸-苏氨酸（VIVIT)对Cn的亲和力增加并能有效抑制NFAT和其活性，但不抑制NF- K B 转录因子的活性，由各自的报道基因的激活所指示（Aramburu等，Science，1999)。因此， VIVIT肽比CsA和FK506更具选择性，其同时抑制这两种转录因子的活化。实际上，专利申 请W02008156363描述了包含VIVIT序列的各种构建物以便用于炎症的一般治疗。
[0013] 但是，众所周知的是，肽材料无法独立通过细胞膜，来直接转移进胞质溶胶，并且 在任何情况下，有众所周知的体内稳定性问题，这限制了这类材料的使用。在本申请的 实验部分报道的结果已证实，包含VIVIT序列的肽不能到达目标Cn蛋白所位于的细胞 胞质溶胶，其量足以有效地作为炎性过程的抑制剂（塞伯等，细胞通讯和信号传导（Cell communication and signaling) ：CCS,2009)〇
[0014] 纳米粒子。具有纳米级尺寸范围的固体粒子构成一个有效的载体系统用于活性分 子的运输是已知的。一旦结合到纳米粒子，这类分子被保护免受体内降解，可在细胞内运输 和释放。
[0015] 治疗/诊断领域中使用的多数纳米粒子可分为两大类：即含有有机分子作为主要 成分的粒子，和那些使用无机元素，通常是金属，作为核的粒子。属于后一组的粒子具有许 多优点，包括：1)利用所述晶核，以便获得相关物理性质的可能性，2)所述无机核能够有效 控制最终纳米构建物的尺寸和形态特征。
[0016] 大多数无机商业纳米粒子共享相同的基本结构：球形，立方体或各向异性形态的 中心核，这决定了物理特性（包括粒子的荧光，光学，磁性电子性质），以及它们表面上的保 护性有机涂层。这种涂层保护核免于体内生理降解，并允许与具有用于结合的官能团的有 机（生物）分子形成静电或共价键。
[0017] 由可以用作生物活性物质的载体的纳米粒子所造成的问题在于以下事实：这种纳 米构建物经由内体途径内在化进入细胞和引导至脂质体降解途径。在这个意义上，生物活 性物质被降解，因此无法以药理活性量达到胞质溶胶。
[0018] 国际专利申请W02005065081描述了也可用作活性分子载体的、包含两性涂层的 磁性纳米粒子的制备。该文件描述了在肿瘤的诊断方法或治疗性治疗中使用这种纳米粒 子。然而，该文作者未对此类粒子的靶细胞作任何评估。
[0019] 本发明的目的是避免现有技术系统中的上述缺点。


【发明内容】

[0020] 本发明是基于此意外发现：包含两性聚合物基涂层的纳米粒子能够在细胞胞质溶 胶中直接运输和释放活性分子。该分子然后还可从胞质溶胶扩散到细胞核中。不希望将 本发明的范围限制到具体的科学理论，但该结果可能至少部分是因纳米构建物（下文称为 MYTS)直接通过细胞膜的能力和部分是因避开传统内涵体系统以及由此的溶酶体降解途径 的能力而现的。
[0021] 因此，本发明涉及一种将分子输送到细胞胞质溶胶内的方法，包括下列步骤：
[0022] a)预先准备一纳米构建物（MYTS)，其包含无机纳米粒子，所述无机纳米粒子具有 两性聚合物基涂层和通过所述两性涂层结合到所述粒子的活性分子；
[0023] b)使得所述细胞接触所述纳米构建物。
[0024] 本发明的第二个目的是纳米构建物，其包括无机纳米粒子，所述无机纳米粒子具 有两性聚合物基涂层和通过所述两性涂层结合到所述粒子的药理学活性分子，用于与定位 于细胞胞质溶胶中的分子事件和/或过程相关的疾病的治疗。
[0025] 本发明的第三个目的是一种药物组合物，其包含上述纳米构建物和/或一种或多 种药学上可接受赋形剂，用于疾病或炎性状态的治疗。
[0026] 本发明的第四个目的是纳米构建物的制备方法，包括以下步骤：
[0027] a)预先准备具有连接体活化的两性聚合物外涂层的无机纳米粒子的溶液/悬浮 液；
[0028] b)将一种或多种活性分子加入所述溶液/悬浮液，使其与所述连接体反应。
[0029] 在方法、纳米构建物和药物组合物的具体实施例中，活性分子是含有VIVIT肽或 由VIVIT肽组成的肽。

【专利附图】

【附图说明】
[0030] 图1显示了暴露于所述MTYS纳米构建物后的DC的TEM分析。源自小鼠骨髓的DC 与纳米构建物共培养五小时，并然后通过TEM进行分析。黑色箭头表示核内体内的MYTS，灰 色箭头表示从内涵体逃脱和进入细胞质的MYTS。
[0031] 图2显示了源自骨髓的DC中MYTS-VIVIT纳米构建物对NFAT信号转导的抑制。DC 细胞用所示量的MYTS-VIVIT预处理2小时，或不处理，然后用LPS活化18小时。上清液中 IL-2和TNF α的量分别用ELISA法测定。
[0032] 图3显示了 NFAT途径在中性粒细胞中活跃。通过IL-2/GFP作遗传学修饰的小鼠 用MYTS-VIVIT处理，或不处理，两小时后静脉内注射LPS。条形代表LPS处理后三小时的 GFP+Ly6G+脾嗜中性粒细胞的百分比。在该小鼠模型中，GFP插入到IL-2的第二外显子，因 此与IL-2具有相同的调节作用。
[0033] 图4显示了在对LPS起反应的爪水肿形成中该NFAT途径的抑制。将动物用纳米 构建物（MYTS-VIVIT)或FK-506作预处理（约2小时），或者不处理，并然后用LPS作局部 处理。水肿测定在图中表示的时间点测定。
[0034] 图5显不了关节炎发展的抑制。图5A :小鼠在_1，0,+1，+3,+6,+9,和+12天静脉 注射纳米构建物（MYTS-VIVIT)或纳米偶联物MYTS-VEET(类似于VIVIT的肽，其中序列已 被修饰，从而失去对Cn的特异性），或者不注射。第0天表示诱导关节炎的过程的开始。表 明关节炎严重性的临床点（clinical point)在标明的天数进行评估。在图5B中，照片显 示了第七天，处理过的小鼠和未处理小鼠的关节炎。
[0035] 图6显示了皮肤移植排斥的抑制。雄性小鼠的皮肤移植到雌性小鼠。然后小鼠 在-1，0, +1，+3, +6, +9,和+15天静脉注射纳米构建物（MYTS-VIVIT或MYTS-VEET)，或不注 射。此外，在接下来的20天小鼠不作处理。雄到雄的方框表示未处理对照，显示从雄性小鼠 到雄性小鼠的皮肤移植。可以看到，移植物被明确接受。雄到雌的方框表示从雄性小鼠到雌 性小鼠的皮肤移植，没有使用纳米构建物处理。排异的瘢痕在第30天清晰可见。排异也可 在MYTS-VEET纳米构建物对照处理的雄到雌（雄性到雌性）方框中看到。反之亦然，在代 表用MYTS-VIVIT处理的（雄到雌+MYTS-VIVIT M)从雄性到雌性移植的方框中，移植物的 接受清晰可见。下方的条形图表示实验的定量结果。概括地说，用MYTS-VIVIT纳米构建物 处理的80%的情况接受了该移植物，而在未处理的情况下为100%排异以及用MYTS-VEET 纳米构建物对照处理是80 %排异。
[0036] 图7显示了根据实施例中详细描述的【具体实施方式】，制备MYTS-VIVIT纳米构建 物的方法的示意图。
[0037] 图8显示了对LPS起反应，用具有序列SEQ ID NO :1的肽转导或未转导的树突细 胞的细胞因子产生情况。与GFP蛋白融合的具有序列SEQ ID NO :1的肽转导的DC和未转 导的DC用LPS刺激（100毫微克/毫升）18小时。然后通过ELISA测定评估IL-2 (NFAT依 赖性，顶部方框）和TNF- α (不依赖NFAT，底部方框）的产生。应该注意的是具有序列SEQ ID NO :1的肽的表达降低了 IL-2的产生。
[0038] 图9显示了具有序列SEQ ID NO :1的未修饰的肽或与含11-精氨酸尾的相同肽无 法渗透入DC的胞质溶胶和阻断NFAT的活性。源自骨髓的DC先用具有序列SEQ ID NO :1 的肽（25UM)或用缀合有11-精氨酸尾的肽（25UM)进行预处理，或者不处理，然后用IOOng/ ml的LPS刺激18小时。通过ELISA测定法评估上清液里IL-2 (顶部方框）和TNF- α (底 部方框）的释放。应该注意的是，无论是未修饰的肽，还是用11-精氨酸尾修饰的肽都不能 抑制NFAT的活性。
[0039] 图10显示了包含在脂质体中具有序列SEQ ID NO :1的肽不能渗透到DC的胞质溶 胶和抑制NFAT的活性。源自骨髓的DC用包含在脂质体中的基于磷脂的肽进行预处理，或者 不处理，然后用l〇〇ng/ml的LPS刺激18小时。通过ELISA测定法评估上清液里IL-2 (顶部 方框）和TNF-α (底部方框）的释放。应该注意的是，包含在脂质体中的肽不能抑制NFAT 的活性。
[0040] 图11.⑷由测量直径约为8纳米的磁性结晶磁铁矿核心形成纳米粒子。N-磷酰 基甲基亚氨基二乙酸（PMIDA)用于在氧化铁引入有机化合物的固定的位点，利用膦酸基对 纳米粒子上表面FeOH的亲和力。两个羧酸基团通过与N-羟基琥珀酰亚胺酯（NHS)激活来 与双官能二氨基连接体2, 2-(亚乙二氧基）二（乙胺）（EDBE)缩合转化成氨基。然后，两 个氨基通过加入N-琥珀酰亚胺-3-[2-吡啶基硫]丙酸酯（SPDP试剂）转化为对硫醇有反 应活性的吡啶基硫代丙酸酯（PDP)的基团。最后，通过纳米偶联物与MYTS-VIVIT纳米构建 物中所用相同的肽（序列SEQ ID NO :1)反应，得到最终纳米构建物。（B)源自骨髓的DC 用直接结合于磁性纳米粒子的肽（对应于使得肽为25 μ M的使用浓度）进行预处理，或者 不处理，然后用100纳克/毫升的LPS刺激18小时。然后通过ELISA测定评估上清液里 IL_2(顶部方框）和TNF-α (底部方框）的释放。应该注意的是，直接结合于纳米粒子的肽 不能抑制NFAT的活性。
[0041] 图12显示了 MYTS-恩夫韦地（enfuvirtide)纳米构建物的胞衆内化和定位。在 此处示出的图像中，可以清楚地看到标记有荧光探针的抗逆转录病毒药物的定位在神经元 的胞液中，所述神经元从MYTS-恩夫韦地处理的小鼠脑提取物冷冻切片得到。对应于神经 元的荧光斑点只有在偶联到MYTS的恩夫韦地存在（第3行的底部，荧光信道）的情况下可 以清楚地看到，而荧光的痕迹不能在对照和从用未与纳米粒子偶联的标记药物处理的小鼠 中提取的样品中看到（分别为第1和2行）
[0042] 图13显示了暴露于MTYS -聚乙二醇纳米构建物后DC的TEM分析。实验证明了 MYTS聚乙二醇（PMpk= 2000道尔顿）在胞质溶胶中的定位。在图像中，可以看出偶联于 PEG2cicici的纳米构建物从核内体泄漏，而核内体本身是完整的。
[0043] 图14显示了根据本发明的一优选实施例，借助EDBE-PDP连接体将纳米构建物偶 联缀合到具有序列SEQ ID NO :1的狀的方法的不意图。
[0044] 图15显示了高浓度的标记有荧光基团的纳米粒子和未标记纳米粒子（分别是 MYTS-FITC和MYTS)的分散体以基质乳膏的约两倍量掺入，然后以连续稀释度加入剩余基 质乳膏，混合直至完全均匀化。上述制剂然后连续三天用于C57BL/6小鼠预先剃毛（面积 测量1平方厘米）的皮肤上。处死老鼠并从处理皮肤区域制备单细胞悬液。然后通过FACS 方法分析细胞，以确定在造血来源（CD45+)，或非造血来源（CD45-)的细胞中摄取。从图中 可以看出，纳米粒子是由这两组细胞吸收。
[0045] 发明详沐
[0046] 本发明基于以下几个方面，在下面详细描述。
[0047] 无机纳米粒子
[0048] 在无机基质上形成的纳米粒子共享相同的基本结构：决定物理性质（包括粒子的 荧光和光学，磁学和电学特性）的中心核和任选的表面上的保护性有机涂层。所述有机涂 层，例如增加纳米粒子在悬浮液中的溶解度的疏水表面活性剂，优选是长链形式，选自例如 油酸，油胺和三辛基膦。
[0049] 本发明的无机纳米粒子通常具有结晶或非结晶型的金属或金属氧化物核。合适的 金属包括，例如，金，银，铁，猛，铜，镍，钼和钮。与此相反，金属氧化物的例子包括Y -Fe2O3， Fe3O4, MnFe2O4, CoFe2O4, ΜηΟ,量子点（例如 CdSe, CdS，CdSe/ZnS 等），TiO2, SiO2，和 CeO20
[0050] 通常使用5和50纳米之间的纳米粒子。
[0051 ] 可以在本发明中使用的纳米粒子实例描述于，例如，在J. Park等.（Nat. Mater. 2004, 3, 891-895)，L. Polito 等·（J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 12712-12724)， Μ· Brust 等·（J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1994,801-802)，C. Β· Murray 等·（J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1994, 801-802)，或者是市售的，例如，从：美国亚利桑那州菲替维尔的AC 诊断公司（AC Diagnostics);美国德克萨斯州休斯顿的SS纳米材料公司（SkySpring Nanomaterials, Inc.);美国密苏里州圣路易斯的S-A公司（Sigma-Aldrich);英国佩斯利 的生命科技有限公司（Life Technologies Ltd);和加拿大安大略省密西沙加的mk纳米公 司（mkNANO)〇
[0052] 涂覆有两件聚合物的纳米粒子
[0053] 本发明的方法设想使用包含无机纳米粒子或如上述形成的纳米粒子的纳米构建 物，具有由两性聚合物形成的外涂层。
[0054] 用于制备具有两性聚合物的外涂层的无机纳米粒子的方法的例子在专利申请 W02005065081中有详细的描述，该申请通过引用的方式整体并入本文。这种方法设想通过 使用封盖配体和两性嵌段共聚物形成两性涂层。两性涂层通常通过嵌段共聚物形成。
[0055] 示例性的，但非限制性的，在专利申请W02005065081第10页第21-30行和第11 页1-3行提供了封盖配体列表。
[0056] 示例性的，但非限制性的，专利申请W02005065081的第11-23页提供了两性嵌段 共聚物列表。
[0057] 在一个实施例中，两性涂层是由聚（异丁烯-马来酸酐）和十二烷基胺（PM)缩 合得到的，如在C. -A. J. Lin等的Small 2008, 3, 334-341中的描述。
[0058] 通讨所沭两件涂层结合到纳米粒子的分子
[0059] 本发明的纳米构建物还包括通过两性涂层结合到纳米粒子的活性分子。
[0060] 所述分子可以是对定位于胞质溶胶的一种或多种目标分子具有亲和力的任何分 子。"对一种或多种目标分子具有亲和力的任何分子"的表述是指分子能够与胞质环境中的 革巴分子相互作用。
[0061] 该分子选自，但不限于：肽，蛋白质（例如单克隆或多克隆抗体），糖，合成聚合物， 多核苷酸，脂肪酸，有机小分子，或其组合。
[0062] 单词"多核苷酸"包括DNA，RNA，siRNA和miRNA，无论是病毒，细菌，植物或动物 (例如哺乳动物）来源的，是否是合成的，单链或双链，包括天然或非天然或化学修饰的核 苷酸。此外，该分子还可包括标记分子，例如标记有放射性或荧光基团的分子。
[0063] 该活性分子可以是选自下组的肽，但不仅限于：4^71-1111-561-1^11-116-!^8-Ser-Leu-Ile-Glu-Glu-Ser-Gln-Asn-Gln-Gln-Glu-Lys-Asn-Glu-Gln-Glu-Leu-Leu-Glu-Leu-Asp-Lys-Trp-Ala-Ser-Leu-Trp-Asn-Trp-Phe-NH2(SEQ ID NO:6 的恩夫韦地），促进 核内物质渗透的肽（核定位序列），或包含序列Val-Ile-Val-Ile-Thr (V-I-V-I-T，SEQ ID NO:5)的肽。
[0064] 包含共有氨基酸序列Val-Ile-Val-Ile-Thr，从NFAT蛋白质中发现的Cn-结合基 序衍生的肽适合于选择性抑制属于NFAT家族的蛋白的转导信号途径。这些肽的例子是具 有SEQ ID N0:l，2,3,4,5的序列的肽。
[0065] 选择性抑制属于NFAT家族的蛋白的转导信号通路的其它肽可以由本领域技术人 员通过使用酶测定进行选择，如J. Aramburu等Science 1999, 285, 2129-1133描述的。
[0066] 活性分子可以通过本领域中已知的任何类型的化学键，直接结合到两性涂层，例 如通过存在于两性聚合物的羧基，或间接地结合，例如通过连接体。
[0067] 连接体可与所述活性分子具有可逆键，如二硫键，或不可逆键。
[0068] 合适的连接体的实例是2, 2-(亚乙二氧基）二（乙胺）（EDBE)，聚乙二醇，异双功 能PEG，二氨基PEG，乙二胺，以及固相合成通用的其他同双功能或异双功能间隔件。
[0069] 图14显示通过EDBE-PDP连接体将肽偶联到纳米构建物的一般反应方案。
[0070] 牛物相容件化合物
[0071] 在本发明的一个实施例中，除了上述的分子，设计用以调节本发明构建物的生物 利用度和/或生物相容性的生物相容性化合物也可存在于纳米构建物的两性涂层的表面。 这样的化合物通过所述两性涂层结合到纳米粒子。
[0072] 该化合物使用合适的连接体优选偶联于两性涂层，如以上段落中描述。生物相容 性化合物的一个例子是聚乙二醇，而偶联的一个例子是通过根据图14所示相同的反应方 案和试剂，利用EDBE连接体。
[0073] 所沭方法的步骤b)
[0074] 上述纳米构建物可在有待用于所述方法的步骤b)的溶液或悬浮液中以所需浓度 制备。
[0075] 这样的步骤包括使得上述纳米构建物，例如，在溶液中或悬浮液中，与动物（例如 哺乳动物，优选人）的真核细胞接触。所述真核细胞可以选自免疫系统的细胞，例如DC，嗜 中性粒细胞或巨噬细胞，淋巴细胞，神经系统的细胞，例如神经元，肿瘤细胞，和内皮细胞。
[0076] 在用于治疗宙位于朐质溶胶内的蛋白功能改夺相关疾病的纳米构律物
[0077] 本发明还涉及上述纳米构建物，其中所述分子是具有药理学活性的分子，用于治 疗定位于细胞胞质溶胶的分子事件或过程相关疾病的治疗。
[0078] 所述分子可以是具有药理学活性的、连接到与它相互作用的定位于细胞胞质溶胶 的治疗靶点的任何分子。示范性的，而不是限制性的列表，包括具有抗病毒活性的分子，如 恩夫韦地，具有抗炎活性的分子，如能选择性抑制属于NFAT家族的蛋白质的转导信号通路 的肽，姜黄素，抗体，抗肿瘤药物，用于基因治疗的寡核苷酸，和具有抗炎活性的其它分子。
[0079] 在本发明的一个具体实施例中，所述具有药理学活性的分子是包含氨基酸序列 Val lie Val lie Thr(VIVIT)或由氨基酸序列 Val lie Val lie Thr(VIVIT)构成的肽。
[0080] 特别地，所述纳米构建物能够用于治疗与属于NFAT家族的蛋白的功能障碍和/或 失调相关的疾病，如炎性疾病。这些疾病包括但不限于：类风湿性关节炎，抗炎性肠病，同 种异体或异种移植排斥反应，败血病，再生障碍性贫血，银肩病，水肿，红斑性狼疮，I型糖尿 病，哮喘，肺纤维化，硬皮病，皮肌炎，干燥综合征，川崎病，桥本氏甲状腺炎，自身免疫性溶 血性贫血，特发性血小板减少症，慢性肾小球肾炎，多发性硬化症，囊肿性纤维化，慢性复发 性肝炎，原发性胆汁性肝硬化，过敏性鼻炎，过敏性结膜炎，特应性皮炎，克罗恩病，溃疡性 结肠炎，结肠炎/炎症性肠综合征，自身免疫性甲状腺炎，获得性免疫缺陷性疾病，阿尔茨 海默氏病，帕金森氏病，肿瘤。
[0081] 药物组合物
[0082] 本发明还涉及一种药物组合物，其包含上述的纳米构建物和/或一种或多种药学 上可接受的赋形剂，用于炎性状态的治疗。
[0083] 术语"药学上可接受的赋形剂"是指适合在药物组合物中使用的赋形剂，佐剂，载 体，溶剂，稀释剂，活性剂，等渗剂，增稠剂或乳化剂，防腐剂，固体粘合剂，润滑剂等。《雷明 顿的药物科学》（Remington' s Pharmaceutical Sciences)，第十六版，E.W. Martin(宾夕 法尼亚州伊斯顿马克出版公司-Mack Publishing Co. ,Easton, Pa.，1980)，描述了可用于 药学上可接受的组合物的制剂中的各种赋形剂和用于制备它们的技术。
[0084] 可以用作药学上可接受的赋形剂的材料的一些例子包括，但不限于，离子交换剂， 铝，硬脂酸铝，卵磷脂，血清蛋白，如人血清白蛋白，缓冲物质（磷酸盐，山梨酸或山梨酸 钾），植物的饱和脂肪酸，水，盐或电解质，如硫酸鱼精蛋白，磷酸氢二钠，氯化钠，锌盐，胶 体二氧化硅，三硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，聚丙烯酸酯，蜡，脂肪组织，糖甘油酯的局部混合 物如乳糖，葡萄糖和蔗糖；酰胺，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，例如羧甲 基纤维素钠，乙基纤维素和醋酸纤维素；黄蓍粉；麦芽；明胶；滑石粉；赋形剂，例如可可脂 和蜡为栓剂，油，例如花生油，棉籽油，吉拉索尔油，芝麻油，橄榄油，玉米油和大豆油；二醇， 如丙二醇或聚乙二醇；酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯，缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝，海藻 酸，无热原水，等渗盐溶液，林格氏溶液；含磷酸盐和其它非毒性相容的润滑剂的乙醇和生 理盐水缓冲溶液，如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁，如着色剂，放松剂，包衣剂，甜味剂，调味剂 和芳香剂，防腐剂和抗氧化剂也可以存在于根据制备制剂的人的判断的组合物中。
[0085] 此处描述的药物组合物还可以包含至少一种不同于纳米粒子的活性成分并已知 可用于炎性疾病的治疗，如皮质类固醇药物，例如强的松和地塞米松，细胞毒性药物，如硫 唑嘌呤和环磷酰胺，及其衍生物从用于治疗细菌或真菌，如雷帕霉素，FK506,和环孢素。
[0086] 组合物中其它一种或多种活性成分的浓度可以由在本领域技术人员在通常使用 的浓度的基础上，很容易地确定。
[0087] 该组合物可以口服，肠胃外，静脉内，通过气雾剂，直肠，经皮，皮下，脑池内，肌内， 阴道，腹膜内，局部，舌下和鼻内给予和适合本发明目的的本领域技术人员已知的所有给药 方法给予。
[0088] 用于口服给药的组合物可采取液体溶液或悬浮液或粉末的形式。该组合物可以以 单剂量的形式呈现，以方便给药。
[0089] 用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂，片剂，丸剂，粉剂和粒子剂。在这样的固体 形式中，将一种或多种活性成分与至少一种药学上可接受的惰性赋形剂或载体混合，例如 柠檬酸钠或磷酸钙和/或填充剂或增量剂（如酰胺，乳糖，蔗糖，葡萄糖，甘露醇和硅酸）； 粘合剂（如羧甲基纤维素，藻酸盐，明胶，聚乙烯吡咯烷酮，蔗糖）；湿润剂（例如甘油）； 崩解剂（如琼脂，碳酸钙，马铃薯淀粉或木薯淀粉，海藻酸，某些硅酸盐和碳酸钠）；阻燃剂 (例如石蜡）；吸光度加速器（如季铵化合物）；加湿剂（如二十六烷酸和甘油单硬脂酸 酯）；吸收剂（如高岭土和膨润土ARGILE);润滑剂（如滑石，硬脂酸妈，硬脂酸镁，固体聚乙 二醇，十二烷基硫酸钠）和其混合物。
[0090] 在胶囊，片剂和丸剂的情况下，该剂型还可以包含缓冲剂。
[0091] 上面指出的固体组合物也可使用赋形剂如乳糖或奶糖以及高分子量聚乙二醇等 用于填充硬或软明胶的胶囊中。片剂，锭剂，胶囊，丸剂和颗粒剂的固体剂型可以用包衣，例 如肠溶包衣和具有在药物制剂领域中公知的其它包衣剂制备。它们可任选地配制以只在或 优选在肠道的某些部分释放一种或多种活性成分，任选地以延迟方式。
[0092] 适于口服给药的液体形式包括，但不限于，药学上可接受的乳剂，凝胶剂，微乳剂， 溶液，悬浮液，糖浆和酏剂，并且可含有在本领域中常用的稀释剂。口服的液体形式可以包 括有缓冲剂，悬浮剂和分散剂，乳化剂，溶剂，着色剂，芳香剂等的合适的水性或非水性载 体。
[0093] 例如，它们可包括水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例如乙醇，异丙醇，碳酸乙酯， 乙酸乙酯，苄醇，苯甲酸苄酯，丙二醇，1，3-丁二醇，二甲替甲酰胺，油（特别是棉籽油，花生 油，玉米油，胚芽油，橄榄油，蓖麻油和芝麻油），甘油，四氢糠醇，聚乙二醇和脱水山梨醇的 脂肪酸酯及其混合物。除惰性稀释剂外，口服组合物还可以包括佐剂，如湿润剂，乳化剂和 悬浮剂，甜味剂，调味剂和芳香剂。
[0094] 液体形式还可以是可注射的溶液，例如无菌可注射水或油性悬浮液，并且可以根 据已知技术使用合适的分散剂，润湿剂和悬浮剂进行配制。所述无菌可注射制剂还可以是 无菌可注射溶液，悬浮液或乳液中的无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂，例如1，3- 丁二 醇配制的溶液。可以使用的可接受的媒介物和溶剂，包括水，林格氏溶液，U.S.P.和等渗氯 化钠溶液。此外，无菌不挥发油通常用作溶剂或悬浮介质。此外，脂肪酸如油酸用于可注射 的溶液。
[0095] 防腐剂和其他添加剂，例如抗微生物添加剂，抗氧化剂，螯合剂和惰性气体也可以 有（Mack (1982)雷明顿药物科学，第16版）。
[0096] 所述可注射制剂可以这样进行灭菌，例如通过过滤器过滤捕获细菌，或通过掺入 无菌固体组合物形式的灭菌剂，该灭菌剂在使用前可溶解或分散于无菌水或其它无菌可注 射介质中。
[0097] 本发明的组合物还可以以软膏剂，糊剂，洗剂，凝胶，粉剂，溶液，喷雾剂，吸入剂， 眼或滴耳剂或贴剂的形式配制用于局部给药。所述活性成分（或组分）在无菌条件下与药 学上可接受的载体和任何防腐剂或视需要而定混合缓冲必要的。经皮贴剂可以用来提供这 里所描述的组合物的控制释放。吸收增强剂也可以用于通过皮肤以增加化合物的流动。释 放的速率可以通过提供用于控制速度的膜或通过将化合物在聚合物基质或凝胶分散进行 控制。
[0098] 剂量可以根据年龄和患者的病理学或疾病的性质和严重程度，以及该方法和给药 类型的一般条件而变化。剂量因此必须考虑到待治疗病症的特定情况。待治疗病症的严重 程度，患者的年龄，体重和具体患者的一般身体状况，以及患者正在使用的其它药物，这是 本领域技术人员众所周知的。此外，很显然，所说的有效量可根据需要按照所治疗的患者和 /或根据开出本发明化合物的处方的医生评估来降低或增加。
[0099] 术语"单位剂型"是指用于人类受试者的含有单一剂量的离散物理单元，每个单次 剂量含有计算的预定量的活性物质以产生所希望的治疗效果，与合适的药物赋形剂混合。 单次剂量的典型形式包括管形瓶，注射器，液体组合物的单剂量瓶，或丸剂，片剂，胶囊或类 似的固体组合物的情况。
[0100] 该纳米构建物可以以药物形式以传统的或修饰的（延长，延迟或重复）释放，胃肠 外大体积释放，胃肠外小体积释放，单剂量释放或多剂量释放来给予。
[0101] 含有纳米构建物的药物产品还可以通过口服、乳房内，和皮肤给药为兽医使用。
[0102] 最后，各种制剂的纳米构建物也可用于研宄目的。
[0103] 典型地，固体形式的组合物每单位剂量可含有的纳米构建物的量为50至1000毫 克，优选从200至500毫克，液体形式的组合物中可含有的纳米构建物的量为每毫升10至 200毫克组合物，优选每毫升40-100毫克组合物。
[0104] 制各方法
[0105] 本发明还涉及一种制备本文所述的纳米构建物的方法，包含以下步骤：
[0106] a)预先准备具有由连接体活化的两性聚合物的外涂层的无机纳米粒子的溶液/ 悬浮液；
[0107] b)将一种或多种活性分子加入所述溶液/悬浮液，使这些分子与所述连接体反 应。
[0108] 该方法的不同步骤详细描述如下：
[0109] 在步骤a)中，预先准备无机纳米粒子或复合物（带有第一有机涂层的无机核）的 溶液/悬浮液，如上所述。
[0110] 随后的两性涂层优选地由聚（异丁烯-交替-马来酸酐）和十二烷基胺的缩合获 得。
[0111] 由此得到的构建物与偶联连接体活化，如2, 2-(亚乙二氧基）二（乙胺）（EDBE)。
[0112] 在步骤b)中，一种或多种活性分子加入所述活化的溶液/悬浮液，使其按照在图 14中详细示出的反应方案反应。
[0113] 偶联的该活性分子优选是能够选择性抑制属于NFAT家族的蛋白的转导信号通路 的肽。
[0114] 在该方法的各步骤之间还设置有一个或多个洗涤和/或浓缩的步骤。进行洗涤和 浓缩的步骤对本领域技术人员是熟知的。
[0115] 本发明已经在此参照其某些实施例描述。据了解，基于相同的发明构思的其他实 施方式也可能存在，而不偏离权利要求书所规定的保护范围。 实施例
[0116] L 1制各与VIVIT肽偶联的纳米构律物的方法
[0117] 市售的无机纳米粒子（例如AC诊断公司）涂覆有长链疏水性表面活性剂（例如 涂布有油酸或油胺的磁铁矿），其具有在3至50纳米之间的均匀尺寸，给所述无机纳米粒子 涂覆两性聚合物，如在C.-A J. Lin等在Small 2008, 3, 334-341，中所述，由聚（异丁烯-马 来酸酐）和十二烷胺的缩合获得。PM以0.5M的浓度溶于氯仿，并添加（110 μ 1)至纳米粒 子的分散体中，也在氯仿中（在1. 〇毫升中10毫克的初始浓度），然后将混合物均质化，溶 剂然后减压蒸发。将所得固体再悬浮于PH 12的硼酸钠缓冲液，以得到稳定和均匀的纳米 粒子（MYTS)分散体，必要时使用超声（超声波仪）。所述MYTS被浓缩并用蒸馏水洗涤两 次，本领域技术人员所熟知的。含MYTS的溶液与0. 05Μ(3 μ 1)的2, 2-(亚乙二氧基）-双 (乙胺）（EDBE)在0· IM (8 μ 1)的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基）碳化二亚胺盐酸盐（EDC) 的存在下反应至少1. 5小时。多次洗涤之后，所述纳米粒子在N-琥珀酰亚胺基-3-[2-吡 啶二硫]丙酸酯（STOP)的存在（300 μ1，10π^/πι1的浓度）下搅拌4小时，然后将混合物浓 缩并洗涤两次，得到 MFN1。最后，具有序列 NH2-CGGGKMAGPVIVITGPHEE-COOH(SEQ ID ΝΟ:1) 的肽（13 μ 1，lmg/ml的浓度）和PEG-SH(具有约500Da分子量，10 μ 1，浓度为10mg/ml)加 入到该混合物中。该混合物在环境温度下搅拌2小时后，然后浓缩纳米粒子（MYTS)的悬浮 液。肽的偶联过程示于图1中。
[0118] 为确定布置在MYTS纳米粒子上的肽/PEG的量，上清液经过紫外分析，并且在 343nm读取的吸光度来确定释放的吡啶-2-硫酮浓度。被肽和PEG官能化的纳米粒子然后 用水洗涤两次，通过UV测量值与校准线进行比较来确定最终浓度。
[0119] L 2制各与抗病毒剂恩夫韦地偶联的纳米构律物的方法
[0120] 市售的无机纳米粒子（例如AC诊断公司）涂覆有一个长链疏水性表面活性剂（例 如涂布有油酸或油胺的磁铁矿），其具有在3至50纳米之间的均匀的尺寸，给所述无机纳米 粒子涂覆两性聚合物，如在C. -A J. Lin等在Smal 12008, 3, 334-341，C-A中所述的，由聚（异 丁烯-马来酸酐）和十二烷胺的缩合获得。PM以0.5M的浓度溶于氯仿，并添加（110 μ 1) 至纳米粒子的分散体中，也在氯仿中（在1. 0毫升中10毫克的初始浓度），然后将混合物 均质化，溶剂然后减压蒸发。将所得固体再悬浮于ΡΗ12的硼酸钠缓冲液，以得到稳定和均 匀的纳米粒子（MYTS)分散体，必要时使用超声（超声波仪）。所述MYTS被浓缩并用蒸馏 水洗涤两次，本领域技术人员所熟知的。含MYTS的溶液与0. 05Μ(3 μ 1)的2, 2-(亚乙二氧 基）-双（乙胺）（EDBE)在0· IM (8 μ 1)的1-乙基-3- (3-二甲氨基丙基）碳化二亚胺盐酸 盐（EDC)的存在下反应至少1.5小时。多次洗涤后，所述纳米构建物用恩夫韦地（SEQ ID NO:6) (5 μ g溶解在水中，浓度为lmg/ml)处理2小时，然后混合物浓缩并用水洗绦两次。
[0121] L 3制各与有机荧光闭偶联的纳米构律物的方法
[0122] 将I. OM的荧光胺溶液（DMSO中0. 5ml)加入到0. 5M的PMA的CHCl3 (5ml)溶液中。 混合物在搅拌下反应一夜，得到MYTS的溶液。该溶液（63 μ 1)加入MYTS的溶液（CHCl3中， 4.6mg)，然后将混合物均质化，溶剂减压蒸发。加入硼酸钠缓冲溶液（SBB，pH12，10ml)以及 通过在3500rpm离心（1小时），在Amicon管中浓缩纳米粒子悬浮液（截止IOOkDa)。荧光 纳米粒子洗涤两次，用SBB稀释，并浓缩（在3500rpm下每个离心循环持续约20分钟）至 达到200 μ 1的终体积。
[0123] L 4制各含有与有机荧光闭偶联，或未偶联的纳米构律物的Α/0乳霜的方法
[0124] 120 μ I MYTS或MYTS-FITC的纳米粒子（40微克/毫升，H2O)的悬浮液与大约60 毫克的连续亲脂相的商业基质乳霜（例如埃塞克斯，先灵葆雅S.p.A)混合，然后通过渐进 方案评估最多总计600毫克乳霜。
[0125] 2.牛物樽塑实骀
[0126] 2. 1验证纳米构建物扩散入DC的胞质空间的能力的实验
[0127] 为了评估本发明的纳米构建物是否能够到达细胞胞质溶胶，用DC进行了测试。特 别是，源自小鼠骨髓的DC与如实施例1中所述的制备的纳米构建物在体外温育5小时，通 过TEM(代表透射电子显微镜）方法测量它们扩散到胞质空间的能力。观察到的是，部分 直接穿透细胞膜，部分逃避核内体所致的逃逸隔室化作用，所述纳米构建物能扩散入胞质 空间（图1)。目标Cn蛋白基本上定位在胞质溶胶，因此到达胞质溶胶的能力是具有序列 VIVIT到靶蛋白的肽的主动转运所必需的。
[0128] 2. 2抑制NFAT的体外转导信号通路
[0129] 制备如实施例1中所述的纳米构建物，抑制NFAT的体外转导信号通路。
[0130] 为了评估纳米构建物是否能够抑制NFAT的转导信号通路，进行了下面的体外实 验。暴露于LPS之后，源自骨髓的DC能产生各种炎性细胞因子，包括IL-2和TNFa。IL-2 严格依赖于即41'，而了即€[的产生依赖于即-108而不依赖于即41'。因此11^-2和了即€[分 别是NFAT和NF- κ B活化途径的有效标记物。与如实施例1中所述获得的纳米构建物预处 理2小时后，来源于骨髓的DC用LPS刺激以及释放的细胞因子量用ELISA法在18小时后 测定。如图2所示，纳米构建物完全阻断IL-2,但不阻断TNFa的产生，这表明这些纳米粒 子能够在体外选择性地有效抑制先天免疫系统的细胞内的NFAT转导信号通路。
[0131] 2. 3抑制NFAT的体内转导通路
[0132] 突变小鼠（从罗纳德Η.施瓦茨的实验室获得，美国国立卫生研宄院，贝塞斯达） 用于本实验。在该小鼠模型中，将GFP蛋白插入基因 IL-2的第二外显子，并因此具有与IL-2 相同的调节作用。如前所述，IL-2是NFAT活化的标志物。如果用LPS处理针对IL-2/GFP 作遗传学修饰的小鼠，处理后两小时可在脾脏转检测到显著百分比的GFP+嗜中性粒细胞 (Ly6G+细胞）。为了验证本发明的纳米构建物是否能够抑制NFAT在体内的信号通路，在注 射LPSl前两小时对突变体小鼠静脉注射如实施例1制备的纳米构建物。如图3所示，纳米 构建物的预处理对嗜中性粒细胞以NFAT依赖性方式产生GFP的能力有很大影响，这表明该 纳米构建物能够在体内抑制NFAT的传导信号通路。
[0133] 2. 4在体内抑制LPS诱导的炎症模型中NFAT依赖性的水肿形成
[0134] 水肿形成是炎症过程产生的第一步骤之一，并且是炎症介质的局部积累的必需过 程。局部肿胀也与引流淋巴结处的游离抗原转运相关。存在于炎症组织中的抗原在两个连 续阶段被运送到淋巴结。在到达的第一阶段，游离形式的抗原进入传入淋巴管，并到达引流 淋巴结。在之后发生的第二阶段，抗原被运送附着于DC。水肿形成引起的间质压力增加促 使部分细胞间液进入传入淋巴管并促进游离抗原进入传入淋巴管本身和游离抗原到达引 流淋巴结。
[0135] 在以前的研宄中，已经表明暴露于LPS后由DC表达的基因 Ptgesl是由NFAT调节。 Ptgesl是一种被称为微粒体前列腺素 IE合酶I (mPGES-1)的蛋白质。mPGES-1连同环氧合 酶-2 (COX-2)和磷脂酶A2 (cPLA2)合力调整导致PGE2产生的生物合成过程，PGE2是参与 许多生理和病理生理反应调节的更加灵活的前列腺素之一，包括通过血管扩张在炎症过程 中形成局部水肿。本发明人观察到LPS诱导的水肿形成是DC-和NFAT依赖性。因此，由于 对暴露于LPS后经NFAT的水形成具有调节作用以及PGE 2的产生，DS调节游离抗原到达 引流淋巴结。因此，NFAT/mPGES-1通路代表了抗炎治疗的可能靶点。
[0136] 为了评估本发明的纳米粒子是否能在体内抑制LPS诱导的水肿形成，在对小鼠爪 子注射LPS前2小时，用实施例1的纳米构建物或FK506作为对照作皮下预处理，或者不处 理。如图4所示，由LPS诱导的NFAT依赖性的水肿形成被本发明的纳米构建物显著抑制， 确认这些纳米粒子可以在体内有效地抑制Cn介导的NFAT活化。
[0137] 2. 5在IL/LPS类型的抗胶原抗体诱导的小鼠关节炎模型中抑制炎性关节炎的发 展
[0138] 类风湿关节炎（AR)是一种慢性，令人衰弱的全身性自身免疫疾病，其特征是伴有 多关节滑膜炎的滑液和间叶组织的免疫炎症反应。随着时间的推移，这会导致关节和关节 周围结构的进行性破坏。NFAT在发炎关节的造血和间充质细胞中实质性活跃，最近已表明， NFATc2和c3同种型在关节炎小鼠模型中滑膜炎的对称性和强度调节中发挥作用，其中所 述炎性过程不依赖于淋巴细胞（适应性免疫）。这表明NFAT分子在和类风湿关节炎的发病 机理相关的先天免疫中是一个全新的角色。为了验证本发明的纳米构建物是否能够抑制炎 性关节炎的发展，使用IL/LPS类型的抗胶原抗体诱导的关节炎模型。特别是，6只C57BL6 小鼠用实施例1的纳米构建物在第 _1，〇，+1，3,6,9,+12天进彳丁处理。如图5所不，纳米构 建物非常有效地抑制关节炎发展。
[0139] 2. 6皮肤移植排斥反应的抑制作用
[0140] 为了验证本发明的纳米构建物是否能够抑制移植排斥，使用了皮肤移植模型。通 常情况下，雌性小鼠中的雄性小鼠皮肤移植物在大约三周内在90-100 %的小鼠中发生排 斥。因此对雌性小鼠进行雄性皮肤条的移植，并在移植的前一天开始，每三天用实施例1的 纳米构建物处理。每天检查移植物状态。四周后，用承载了 VIVIT肽的纳米构建物处理的 90%的雌性小鼠接受了皮肤移植物，用对照纳米构建物处理的小鼠80%排斥了移植物（图 6)。该实验表明，VIVIT纳米构建物能有效地抑制体内针对次要组织相容性抗原的免疫应 答。
[0141] 2. 7抑制体外NFAT转导信号通路的对比实验
[0142] 如果用LPS刺激，DC以NFAT依赖性方式产生IL-2。为了评估VIVIT肽的功效， 通过使用逆转录病毒载体，用编码与绿色荧光蛋白融合的VIVIT肽的序列转导源自骨髓的 DC0
[0143] 如图8所示，在细胞内表达的VIVIT肽能够完全阻断IL-2的表达，而它无法阻断 TNF- α的表达，一种由树突状细胞对LPS起反应以不依赖于NFAT的方式产生的细胞因子。
[0144] 为通过可以在体内使用并且不需要细胞感染或转染的方式而药理学阻断先天免 疫细胞中的NFAT功能，我们分析了各种可能的递送系统，以便确定能够将VIVIT肽传送到 细胞胞质溶胶中的系统，其中NFAT的活性必须被阻断。
[0145] 由于DC是吞噬细胞，我们首先使用非修饰的肽，假设它一旦进入核内体隔室，可 能达到细胞胞质溶胶。然后我们将DC与VIVIT肽共培养，通过测定LPS刺激后的IL-2产 生来分析NFAT的抑制情况。如图9所示，游离、未修饰的VIVIT肽不能干扰NFAT的活性。 然后评估修饰的VIVIT肽，其附着疏水性11-精氨酸尾。事实上，在文献中已描述，这种修 饰可以允许进入细胞。然而，此修饰也没有产生期望的结果，也没能观察到对LPS在DC内 诱导的NFAT通路有任何抑制作用（图9)。
[0146] 使用从包含有VIVIT序列的脂质体制品得到的磷脂基脂质体。这样的制品在LPS 刺激之前与DC孵育。但是，即使是这样的系统也没有被证明能有效抑制细胞内NFAT的功 能（图10)。此外，还有不可能确定活性成分负载的进一步缺点，这将会导致每个制品的结 果不一致。
[0147] 由于脂质体的制剂没有在DC中的VIVIT肽转运中表现出任何功效水平，我们分析 了作为新传递系统的磁性纳米粒子。然后如图IlA所示，用连接体将VIVIT肽偶联至纳米 粒子，以形成测量直径约8nm结晶磁铁矿的磁性核。如之前脂质体制剂所描述的，直接与 VIVIT肽偶联的纳米粒子先与DC -起温育，再用LPS刺激。在这种情况下，也没能观察到 DCS中由LPS诱导的NFAT途径有任何抑制作用（图11B)。
[0148] 2. 8验证偶联到PEG的纳米构建物扩散到树突状细胞的胞质空间能力的实验
[0149] 5000000个来源于骨髓的DC铺在100毫米平板中的完全培养基中，并与MYTS纳米 粒子（25微克/毫升）孵育5小时。然后分离DC，用PBS洗绦，并用2. 5%戊二醛固定。然 后在1. 5%的四氧化锇中后固定细胞，然后以升序规模的酒精脱水并浸入环氧树脂。
[0150] 该样品通过切片机切割并用乙酸双氧铀和柠檬酸铅染色。然后将切片用TEM(图 13)进行测定。
[0151] 2. 9验证偶联到抗病毒剂恩夫韦地的纳米构建物扩散到神经元细胞的胞质空间能 力的实验
[0152] Balb/c裸鼠静脉注射只含有荧光染料AlexaFlu〇r660 (AF660)标记的抗逆转录病 毒药物恩夫韦地（已知通过血脑屏障渗透性很差）的溶液，或偶联至纳米粒子（MYTS)的 恩夫韦地（仍标记AF660)。1小时后，在此期间，小鼠保持仰卧睡眠并在头骨放有磁铁，将 从MYTS/恩夫韦地或游离恩夫韦地处理的小鼠分离的脑样品冰冻切片。然后，用荧光探针 NeuroTrace(染色Nissi物质，其含有丰富的神经元细胞，并由与内质网相关的核糖体RNA 形成）染色神经元。神经细胞的细胞核也用DAPI标记，通过共聚焦显微镜观察与纳米粒子 偶联或不偶联的药物相关AF660信号。结果显示仅在药物偶联于MYTS纳米粒子的情况下， 荧光药物在神经元中积累（图12)。
[0153] 2. 10验证体内含有偶联到荧光分子的纳米构建物的乳霜通过皮肤扩散能力的实 验
[0154] 将含有高浓度的标记或未标记荧光团的纳米粒子的分散体（分别为MYTS-FITC和 MYTS)以基质乳霜约两倍的量掺入和然后以连续稀释加入基质乳霜的其余部分，混合直至 完全同质化。然后连续三天将上述制剂施加在C57BL/6小鼠预先剃毛的皮肤上（面积为1 平方厘米）。处死小鼠，从治疗的皮肤区域制得单细胞悬液。然后用FACS分析细胞，以确定 在造血来源（CD45+)的细胞，而非（CD45-)的细胞中的摄取。从图中可以看出，纳米粒子被 这两组细胞吸收。
[0155] 序列详沐
[0156] 序列表
[0157]

【权利要求】
1. 在细胞胞质溶胶中转运活性分子的方法，包括如下步骤： a) 预先准备一包含无机纳米粒子的纳米构建物（MYTS)，所述无机纳米粒子具有两性 聚合物基涂层和通过所述两性涂层结合到所述粒子的活性分子； b) 将所述细胞接触所述纳米构建物。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述无机纳米粒子是金属或金属氧化物。
3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述纳米构建物由Au、Ag、Fe、Mn组成，或由 γ -Fe203、Fe304、MnFe20 4、CoFe204、MnO、Ti02、Si02、CeO 2或选自 CdSe、CdS、CdSe/ZnS 的量子 点组成。
4. 如权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述两性聚合物由嵌段共聚物组成。
5. 如权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，所述两性聚合物由聚（异丁烯-交 替-马来酸酐）和十二烷基胺（PM)缩合得到。
6. 如权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于，所述活性分子还通过连接体，经由可 逆或不可逆的键结合到两性涂层。
7. 如权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于，所述连接体是可逆的，并且包括二硫 键。
8. 如权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于，所述活性分子选自下组：寡肽或多 肽、糖、寡糖或多糖、DNA、RNA、siRNA、miRNA序列、合成聚合物或药理学活性分子。
9. 如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述活性分子是选自下组的肽：SEQ ID NO: 6 (恩夫韦地），有利于物质进入细胞核的肽（核定位序列），或包含序列SEQ ID NO :5的肽。
10. 如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述活性物质是具有序列SEQ ID NO: 1、2、 3、4、5的肽。
11. 一种包含无机纳米粒子的纳米构建物，所述无机纳米粒子具有两性聚合物基的外 涂层和通过所述两性涂层结合到所述纳米粒子的具有药理学活性的分子，用于治疗与定位 于细胞胞质溶胶中的分子事件或过程的相关疾病。
12. 如权利要求11所述的纳米构建物，其特征在于，所述的无机纳米粒子是金属或金 属氧化物。
13. 如权利要求11或12所述的纳米构建物，其特征在于，所述纳米粒子由Au、Ag、Fe、 皿11组成，或由丫-卩620 3、卩6304、]\^^204、&^6 204、]\1110、1102、5102、〇60 2或选自〇(156、〇(15、〇(156/ ZnS的量子点组成。
14. 如权利要求11-13所述的纳米构建物，其特征在于，所述两性聚合物由嵌段共聚物 组成。
15. 如权利要求14所述的纳米构建物，其特征在于，所述两性聚合物由聚（异丁烯-交 替-马来酸酐）和十二烷基胺（PM)缩合得到。
16. 如权利要求11-15任一所述的纳米构建物，其特征在于，所述活性分子还通过连接 体，经由可逆或不可逆的键结合到两性涂层。
17. 如权利要求11-16任一所述的纳米构建物，其特征在于，所述连接体是可逆的，并 且包括^硫键。
18. 如权利要求11-17任一所述的纳米构建物，其特征在于，所述活性分子选自下组： 寡肽或多肽、糖、寡糖或多糖、DNA、RNA、siRNA、miRNA序列、或合成聚合物或药理学活性分 子。
19. 如权利要求11-18任一所述的纳米构建物，其特征在于，所述活性分子是选自下组 的肽：SEQ ID NO :6 (恩夫韦地），有利于物质进入细胞核的肽（核定位序列），或包含序列 SEQ ID NO : 5 的肽。
20. 如权利要求19所述的纳米构建物，其特征在于，所述活性物质是具有序列SEQ ID N0:l、2、3、4、5 的肽。
21. 如权利要求11-20任一所述的纳米构建物，包含第二生物相容性化合物，通过所述 两性聚合物结合到所述纳米粒子。
22. 如权利要求11-21任一所述的纳米构建物，其特征在于，所述纳米粒子的尺寸包括 在5至100纳米之间。
23. 如权利要求11-22任一所述的纳米构建物，用于治疗定位于细胞胞质溶胶或细胞 核的蛋白功能改变的相关疾病。
24. 如权利要求19或20所述的纳米构建物，用于治疗以便选择性抑制属于NFAT家族 的蛋白质的信号转导通路。
25. 如权利要求24所述的纳米构建物，其特征在于，所述的疾病是炎性状态。
26. 如权利要求25所述的纳米构建物，其特征在于，所述的疾病选自下组：类风湿关 节炎，炎性肠病，同种异体或异种移植排斥反应，败血病，再生障碍性贫血，银肩病，水肿，红 斑性狼疮，I型糖尿病，哮喘，肺纤维化，硬皮病，皮肌炎，干燥综合征，川崎病，桥本氏甲状 腺炎，自身免疫性溶血性贫血，特发性血小板减少，慢性肾小球肾炎，多发性硬化，囊性纤维 化，慢性复发性肝炎，原发性胆汁性肝硬化，过敏性鼻炎，过敏性结膜炎，特应性皮炎，克罗 恩病，溃疡性结肠炎，结肠炎/炎症性肠综合征，自身免疫性甲状腺炎，获得性免疫缺陷性 疾病，阿尔茨海默氏病，帕金森病，肿瘤。
27. -种药物组合物，含有如权利要求11至25任一项所述的纳米构建物和一种或多种 赋形剂，用于治疗疾病或炎性状态。
28. 如权利要求27所述的组合物，其特征在于，所述疾病选自下组：类风湿关节炎，炎 性肠病，同种异体或异种移植排斥反应，败血病，再生障碍性贫血，银肩病，水肿，红斑性狼 疮，I型糖尿病，哮喘，肺纤维化，硬皮病，皮肌炎，干燥综合征，川崎病，桥本氏甲状腺炎，自 身免疫性溶血性贫血，特发性血小板减少，慢性肾小球肾炎，多发性硬化，囊性纤维化，慢性 复发性肝炎，原发性胆汁性肝硬化，过敏性鼻炎，过敏性结膜炎，特应性皮炎，克罗恩病，溃 疡性结肠炎，结肠炎/炎症性肠综合征，自身免疫性甲状腺炎，获得性免疫缺陷性疾病，阿 尔茨海默氏病，帕金森病，肿瘤。
29. 如权利要求27或28任一所述的药物组合物，适合于口服，静脉内，肌内，皮下，经 皮，鼻，阴道，直肠或腹膜内给药。
30. -种制备如权利要求19至26任一所述的纳米构建物的方法，包括以下步骤： a) 预先准备具有由连接体活化的两性聚合物的外涂层的无机纳米粒子的溶液/悬浮 液； b) 将一种或多种活性分子加入所述溶液/悬浮液，使其与所述连接体反应。
31. 如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述的两性聚合物由连接体激活，从而产 生可逆或不可逆的键。
32.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述可逆键是根据图14的方案获得的。
【文档编号】A61K49/18GK104519914SQ201380038523
【公开日】2015年4月15日 申请日期:2013年7月19日 优先权日:2012年7月19日
【发明者】F·格兰驰, D·普罗斯佩里, I·扎诺尼, F·R·M·科西, M·科隆博 申请人:米兰比可卡大学, 米兰大学