包含与crm197载体蛋白偶联的hiv gp41肽的免疫原性化合物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及针对HIV病毒家族的疫苗领域。更特别地涉及一种包含同通式(I)肽的免疫原性化合物NH2-[Nt]y-P-W-N-X1-S-X2-S-N-X3-X4-X5-X6-X7-I-W-[Ct]z-COOH(I)其共价连接到由CRM197蛋白组成的载体蛋白。本发明还涉及包含免疫原性化合物的组合物和这些组合物用于预防和/或治疗HIV病毒感染的个体的病症的用途。
【专利说明】包含与CRM197载体蛋白偶联的HIVGP41肽的免疫原性化 合物
【技术领域】
[0001] 本发明涉及针对HIV病毒家族的疫苗领域。 技术背景
[0002] 约90%的人HIV感染是由HIV-1病毒引起的。1型人类免疫缺陷病毒（HIV-1)的 特点在于它是在病毒复制过程中发生的由基因突变的累积引起的以及还通过重组事件造 成的显著的遗传变异性。HIV-1病毒株的高突变活性可以解释用于治疗HIV的化疗方法的 长期以来的失败。较早结果表明，在抗逆转录病毒疗法的不同疗程后，甚至在多药治疗后 (HAART)，抗性病毒变种在患者体内迅速出现。这些抗性病毒可以具体地改变他们蛋白质的 构象和结构。通常造成HIV-1逃离目前治疗的这种突变被保持连续几代病毒且由于治疗条 件的选择而进行积累。
[0003] 用抗HIV-1药物治疗不能完全阻断病毒的复制，它允许预先存在的抗性突变的选 择和积累，以及新发生突变的选择和积累，从而给该病毒带来新的继续传播的机会。现有的 抗逆转录病毒药物（NRTI，NNRTI，蛋白酶抑制剂，融合抑制剂和其混合物，比如HAART)只能 在或多或少的长时间段上减缓HIV-1病毒的复制，直到抗性病毒株的出现和繁殖。HIV-1抗 性变种的广泛传播引起了严重的忧虑并需要利用其他抗HIV-1治疗手段。
[0004] 此外，尽管HAART有明显的临床益处，但缺点在于：许多副作用（脂肪代谢障碍、乳 酸酸中毒、胰岛素抵抗、慢性肾脏病、高脂血症......），终身性治疗，依从性高，病毒抵抗，HIV 感染的致病作用的持久性，认知和运动障碍，以及免疫激活。此外，随着预期寿命的延长， 患者必须面对出现的副作用、耐药性、代谢紊乱和与HIV-1感染相关的癌症。
[0005] 此外，尽管有病毒抑制但治疗的患者中的20%至30%有时会遭遇免疫失败。也就 是说虽然抑制了病毒复制，但它们的CD4+T细胞计数下降。这表明尽管抑制了病毒复制，但 HIV-1感染CD4+T细胞的致病事件依然存在。因此，需要可以作为抗逆转录病毒治疗补充 的，从而保护CD4+T细胞的安全并可普及的治疗方法，且这是一个未满足的医疗需求。
[0006] 除了那些利用化学抗逆转录病毒物质的方法，各种抗HIV治疗策略均已被考虑， 其中包括（i)抗HIV抗体的使用，（ii)基于破坏HIV颗粒的疫苗，（iii)基于HIV肽的疫苗 和（iv)DNA质粒或基于病毒载体的疫苗，每种都有自己特定的缺点。
[0007]自从1983年HIV病毒被确定为艾滋病的原因，许多预防HIV感染和AIDS的疫苗 的候选物在人体试验中进行测试，但鲜少成功。国际艾滋病疫苗行动组织，IAVI，保有这些 疫苗和试验的数据库（www.IAVI.org)。几乎所有的这些试验都是非常早期（I期）的对疫 苗安全性和初步免疫反应的试验。只有一种疫苗（同一个基本gpl20疫苗的两种制剂）已 在大规模III期临床研究中试验。在美国、加拿大和荷兰于2003年完成的III期临床试验 中发现VaxGen的gpl20亚型B蛋白无效。在之后的2003年，AIDSVAX的第二次试验在泰 国完成。两个试验都发现该候选疫苗均是无效的。过去难以制备可抗HIV的蛋白质疫苗， 这可能是由于包膜蛋白中的高多样性，所用的实验室适应株的包膜和临床分离株之间的差 异，疫苗中gpl20的单体性质和病毒中的三聚体组织之间的差异，以及特别是由于仅诱导 抗体而没有诱导细胞免疫。AIDSVAX蛋白（来自VAXGene)与用于递送到金丝雀痘中的基因 (来自安万特巴斯德的ALVAC)的结合也在III期临床测试中以便得到进一步的信息，并且 期望开始第四次大规模试验以测试默克的腺病毒为基础的候选疫苗。细胞毒性T淋巴细胞 (CTL)被认为是包括HIV-I病毒在内的病毒的免疫控制的关键组分，且相关的CTL免疫原 被考虑用于治疗性疫苗。
[0008] 由于流行的HIV每年持续感染数以百万计的人，因此增加了对有效疫苗的需求。 由于开发能够引发广泛的中和性抗HIV抗体的免疫原性产品的难度，深深阻碍了抗HIV疫 苗的开发。
[0009] 对于针对人类免疫缺陷病毒（HIV)的原发性分离物的广泛中和抗体（NtAb)的诱 导仍然是一个主要的和未满足的AIDS疫苗研究的目标。早期使用基于包膜的疫苗的尝试 已经探索出了仅对于实验室适用的分离物有效的抗体。在这些情况下，保护已经与针对 gpl20的V3高变区的高滴度NtAb相关。然而，产生的中和活动基本上是分离物特异性的且 针对HIV-1的最主要的原发性分离物极少有效。在III期临床试验中亚基gpl20疫苗不能 预防HIV-1收集物就强调了该任务的难度。
[0010] 然而，NtAb往往能够在HIV感染个体中发现。所产生的反应在感染早期通常是窄 特异性的，中和在宿主中传播的病毒，而不是同时期的病毒。在一些能够在没有抗病毒治疗 下控制他们的感染的长期幸存者中的感染过程中这种反应扩大。然而，还尚未了解交叉中 和抗体反应的性质和导致其发生的机理。
[0011]自然情况下，抗Env的NtAb在感染后的几周内产生，但这种早期的反应仅针对特 定的病毒亚型有效；然而，bNtAb(交叉反应性中和抗体）可在HIV的过程中形成。最近，几 个主要的研究表明，大约25%的HIV感染者（感染至少1年）有bNtAb反应，1%"中和"精 英对绝大多数进化支有很强的活性。重要的是，这些结果证明了在疾病的过程中感染者的 免疫系统在体内产生抗HIV-1的NtAb的可能性。他们还提示，在缺乏保护性bNtAb的滴度 的知识的情况下，广谱反应性中和抗体活性似乎随着时间而发展且被慢性抗原暴露加强。
[0012] 持续的低噪音的病毒复制带来的结果是一个持续的Env的逃避NtAb的进化。这 种抗原进化提示可以把新的疫苗策略重点集中在更保守的区域的Env蛋白，提示疫苗免疫 原的设计可以模仿关键的高度保守的抗原表位。
[0013] 一个有效的抗HIV疫苗设计的主要障碍一直是bNtAb目标是病毒包膜蛋白（Env)， 其是高度可变的，而保守的元素似乎是免疫原性很低。这意味着在受体结合和融合的过程 中，动力学和特殊约束阻碍bNtAb接触潜在的脆弱位点。事实上仅仅公开了很少的bNtAb。 例如，第一个被确定的bNtAb是bl2,其阻塞gpl20上的⑶4结合位点并防止病毒对⑶4+T 淋巴细胞⑶4结合。gp41亚基比gpl20更保守，gpl20通常在所有菌株中都涉及构象重排。 很少有引起针对gp41保守结构单元bNtAb的探索活动，其中gp41的保守单元被屏蔽，很难 接触或是很短暂的；这些bNtAb包括2F5和4E10,其针对gp41的近膜胞外结构域（MPER)。 然而，尽管有许多年的研究，由于这些表位是构象表位，能够引发这些bNtAb的NtAb免疫原 仍然是未知的。
[0014] 尽管在设计安全有效的针对HIV病毒感染的预防性和治疗性疫苗的策略遇到很 大困难，但是在设想有前途的抗HIV的疫苗组合物方面已经有很多的进步了。例如，在2012 年初，在美国、加拿大和澳大利亚进行了不少于576例抗HIV疫苗的临床研究。值得一提的 是，有27例临床研究完成了四期临床研究。这些进展表明，随着时间发展，抗HIV疫苗越来 越是预防和/或治疗有感染HIV病毒风险或者已经感染HIV病毒的个体的真实的和可靠的 医疗工具。所有这些在开发中的疫苗的目的都是减少病毒的复制。
[0015] 现有技术中公开的预防和治疗性的抗HIV疫苗策略是培育抗HIVgp41包膜蛋白 高度保守的基序（它被称为"3S"）的抗体。现有技术证明，由与KLH载体蛋白偶联的3S肽 以及不完全弗氏佐剂（IFA) -起组成的免疫原性组合物能够诱导猕猴中的抗3S抗体。它还 表明抗3S抗体对免疫后的⑶4+T细胞下降的猕猴有保护作用。这些结果开辟了其他通过 免疫干预以控制HIV疾病发展的策略途径。（Vieillardetal.，2008，PNAS，V〇1. 105(6): 2100-2104).
[0016] 这一策略的第一个目标是针对HIV-1致病性的病毒的决定族而不是病毒复制。
[0017] 现有技术仍然需要预防或治疗由HIV病毒引起的感染的治疗工具。
[0018]发明概沭
[0019] 本发明涉及一种包含如下通式（I)的肽的免疫原性化合物，
[0020] NH2- [Nt]y-P-ff-N-Xi-S-X2-S-N-X3-X4-X5-X6-X7-I-ff- [Ct]z-C00H(I),
[0021] 其中：
[0022] -y是0或1的整数，
[0023] _z是0或1的整数，
[0024] _Nt由长度为1到100个氨基酸的肽组成，
[0025] -Ct由长度为1到100个氨基酸的肽组成，
[0026] 4是选自A(丙氨酸），T(苏氨酸），S(丝氨酸）和N(天冬酰胺）的氨基酸，
[0027] _X2是选自W(色氨酸）和A(丙氨酸）的氨基酸，
[0028] _X3是选自K(赖氨酸）和R(精氨酸）的氨基酸，
[0029] _X4是选自S(丝氨酸）和T(苏氨酸）的氨基酸，
[0030] _X5是选自L(亮氨酸），Y(酪氨酸）和Q(谷氨酰胺）的氨基酸，
[0031] _X6是选自D(天冬氨酸），N(天冬酰胺），E(谷氨酸），S(丝氨酸）、G(甘氨酸） 和K(赖氨酸）的氨基酸，
[0032] _X7是选自D(天冬氨酸），Q(谷氨酰胺），L(亮氨酸），A(丙氨酸），K(赖氨酸） 和E(谷氨酸）的氨基酸，
[0033] 通式（I)中的肽与由CRM197蛋白组成的载体蛋白共价连接。
[0034] 在一些实施方式中，免疫原性化合物含有SEQID N° 2[NH2-PWNASWSNKSLDDIW-C00H]的肽，其与由CRM197蛋白组成的载体蛋白共价连接。
[0035] 特别是，本发明涉及一种包含如下通式（V)的肽的免疫原性化合物
[0036] NH2-(Al)m-SEQIDN° 2-(A2)n-C00H(V),
[0037] 其中：
[0038] _m是0或1的整数，
[0039] _n是0或1的整数，
[0040] -Al是氨基酸残基，和
[0041] -A2是氨基酸残基，
[0042]通式⑴中的肽与由CRM197蛋白组成的载体蛋白共价连接。
[0043] 在根据本发明的免疫原性化合物的一些实施方案中，通式（I)的肽包含，或者由 SEQIDN° 5的肽组成。
[0044] 在根据本发明的免疫原性化合物的一些其他实施方案中，通式（I)的肽包含，或 者由SEQIDN° 6的肽组成。
[0045] 在一些实施方案中，所述免疫原性化合物直接或通过一个接头部分共价结合到载 体蛋白的N-末端氨基酸残基。
[0046] 因此，在一些实施方案中，所述免疫原性化合物通过接头部分共价结合到载体蛋 白，优选是包含两个反应性琥珀酰亚胺基的接头部分。
[0047] 本发明还涉及一种组合物，包含如上述定义的免疫原性化合物和一种或多种免疫 佐剂物质的组合物。
[0048] 优选地，所述一种或多种免疫佐剂物质包含，或由氢氧化铝（A1 (0H) 3)组成。
[0049] 本发明还涉及包含免疫原性化合物或如上述定义的组合物，和一种或多种药学上 可接受的载体的疫苗组合物。
[0050] 本发明还涉及如上述定义的免疫原性化合物或组合物用于药物，或用于预防和/ 或治疗个体的由HIV病毒感染引起的病症的用途。
[0051] 它还涉及如上述定义的免疫原性化合物或组合物用于制备预防和/或治疗个体 的由HIV病毒感染引起的的病症的疫苗组合物的用途。
[0052] 本发明还涉及用于预防和/或治疗个体的由HIV病毒感染引起的病症的方法，所 述方法包括将有效量的如上所定义的疫苗组合物给药于有需要的个体。
【专利附图】
【附图说明】
[0053] 图1说明当利用与KLH或CRM197偶联的3S16Nter肽免疫时抗-3S-肽抗体的增 力口。每个符号都代表由一个小鼠获得的结果。每一个条代表由相应鼠库获得的结果的几 何平均值。横坐标：所用的组合物种类；纵坐标：以任意单位（AU)表示的抗-3SIgG滴度。 一个任意单位对应终浓度为lng/yL的小鼠单克隆抗-3S抗体15C8f2的溶液产生的信号。 图1A:第一次注射后第21天的结果；图1B:第一次注射后第35天的结果；图1C:第一次注 射后第49天的结果。
[0054] 图2说明最优3S-肽-CRM197免疫偶联物（3S药物物质）在小鼠体内的疫苗剂 量范围。横坐标：免疫偶联物的剂量，表示为抗原等效量（分别为〇( "佐剂"），0.02i!g， 0.21^，11^，21^和41^)。纵坐标：抗-3516财抓1§6滴度，表示为1/中点稀释度）。中 点稀释度是给出最大信号的一半的抗血清的稀释度。X轴表示接种有增加的剂量的表示为 微克（Ug)的3S药物的3S16Nter肽等价物的小鼠的不同组。每个符号代表一个小鼠。来 自接种有CRM197-3S免疫偶联物的小鼠的血清的池用于ELISA分析的标准化。报告由非参 数Mann-Whitney检验计算的统计学意义。
[0055] * :0? 5 >p> 0? 1 ;** :0? 1 >p> 0? 01 ;***:p< 0? 01。
[0056] 图3说明大鼠的最佳3S-肽-CRM197疫苗的剂量范围。横坐标：免疫偶联物的剂 量（3S药物），表示为与载体结合的肽的量，不考虑载体和连接物的重量（肽等价物）（分别 为0("佐剂"），0.021^，0.21^，11^，21^和41^)。纵坐标：抗-33 16财61'186滴度， 表示为1/中点稀释度。中点稀释度是给出最大信号的一半的抗血清的稀释度。X轴表示 接种有增加剂量的以微克（yg)表示的3S药物的肽等价物的大鼠的不同组。每个符号代 表一个大鼠。来自接种有20iig和50iig的用氢氧化铝配制的CRM197-3S免疫偶联物的大 鼠的血清池用于ELISA的标准化。报告由非参数Mann-Whitney检验计算的统计学意义。
[0057] * :0? 5 >p> 0? 1 ;林：0? 1 >p> 0? 01 ;***:p< 0? 01
[0058] 图4和5说明使动物，包括灵长类动物，免疫之后获得的抗_3S16Nter抗体的能 力，其中抗_3S16Nter与在此所述的载体蛋白（KLH或CRM197)偶联。
[0059] 图示4说明对照孔的PE平均荧光。
[0060] 表示在⑶4+T细胞表面上NKp44L密度的所测得的PE荧光平均值已经通过细胞荧 光测量仪对第4到第1号孔的细胞进行测量。Y轴代表X-平均荧光。X轴表示不同的测试 条件。有（3S)或无（_)3S16Nter肽，无（-)或有来自3S16NterIgG阴性（兔neg)或阳性 (兔P〇s)兔1/50稀释度的血清。重复测试对照和报告标准偏差（误差线）。
[0061] 图5说明测试项目孔的X-平均荧光。
[0062] 表示在⑶4+T细胞表面上NKp44L密度的所测得的PE荧光平均值已经通过细胞荧 光测量仪对第16号到第45号孔的细胞进行测量。Y轴代表X-平均荧光。X轴表示不同的测 试条件。所有的孔都在3S16Nter肽存在下进行测试。测试来自接种有含佐剂的CRM197-3S 16Mter免疫偶联物（R122d49)的大鼠的血清。每个稀释度测试三次，报告标准偏差（误差 线）。在1/50稀释度下测试抗-3S16NterIgG阴性血清（阴性对照）。在1/100、1/400、 1/1600和1/6400稀释度下测试抗-3S16NterIgG阳性血清。
[0063] 图6说明当用与CRM197偶联的m3S16Nter肽免疫时产生抗-3S-肽抗体。每个符 号都代表由一个小鼠获得的结果以及对六个小鼠进行了免疫。小鼠分别在第〇、14、28、169 和212天进行注射，如相应的箭头所示。横坐标：在第一次注射免疫偶联物后的时间段，表 示为天数。纵坐标：表示为1/中点的抗-3S抗体滴度。
[0064] 发明详沭
[0065]本发明主要提供用于制备组合物，特别是抗HIV的疫苗组合物的新型免疫原性化 合物。
[0066] 本发明人在设计具有诱导针对3S肽的高的和有效的抗体反应能力的免疫原性化 合物方面进行了深入的研究工作。
[0067] 如在此所使用的，在本说明书中将3S肽总地定义为具有式（I)的肽，描述如下。3S 肽包含SEQIDN° 5(NH2-CPWNASWSNKSLDDIW-C00H)的3S肽，其在本领域是已知的。
[0068] 如在此所使用的，抗-3S抗体由针对式（I)的肽的抗体组成并包含针对SEQID N° 5的3S肽的抗体。
[0069]SEQIDN° 5 的 3S肽在本发明之前已经由Vieillard等（Vieillardetal., 2008，PNAS，V〇1. 105(6) :2100-2104)确定为抗-HIV的候选抗原。需要提醒的是Vieillard 等已经通过利用由与熟知的KLH载体蛋白共价连接的SEQIDN° 5的3S肽构成的免疫偶 联化合物诱导了抗-3S抗体。
[0070] 这里需要提醒的是，KLH几乎是目前唯一的以抗原蛋白载体偶联物的形式用 于包含免疫原性物质的疫苗组合物的载体蛋白。此外，KLH已广泛用于产生抗体（Lee， Huang，Lasanthi，Jayathilaka，LateefandGupta,2010.Productionofantipeptide antibodies,MethodsinMolecularBiology,657 ：93-108,S.D.Schwartzbachand T.Osafune(eds.),Springer；Ragupathi,GathuruandLivington,2005,Antibody inducingpolyvalentcancervaccines,CancerTreatRes,123 :157-150 ;Harris andMarkl,1999,Keyholelimpethemocyanin(KLH)：abiomedicalreview,Micron, 30-597-623)〇
[0071]令人惊奇的是，本发明人已经发现由Vieillard等人使用的KLH常规载体蛋白不 适合用于设计产生有效的抗-3S抗体反应的免疫原性化合物，其目的是诱导针对个体的由 HIV家族病毒，特别是HIV-1病毒感染引起的免疫疾病的保护作用。特别地，本发明人意外 地发现了，3S肽接枝的KLH分子（KLH-3S)形成聚集体，其导致包含不同表观分子量的相关 实体的异质性的最终的免疫原性化合物。因此，本发明人发现了包含KLH-3S偶联物的免疫 原性化合物不能以获得可用作药物的化学定义的产品为目的可重复地制造，特别是用于人 类使用的药物。
[0072] 非常令人惊奇的是，本发明人发现了有效的抗-3S抗体反应可以通过使用特异性 免疫原性化合物获得，所述化合物由抗原载体偶联物组成，其中所述载体分子由CRM197蛋 白组成。特别地，发现了通过使用CRM197载体蛋白，与其中抗原肽共价结合到传统的KLH 载体蛋白的免疫原性化合物相比，抗-3S抗体提高了约100倍。
[0073]CRM197蛋白由熟知的白喉毒素的无毒突变体构成，该突变体是由Uchida等人最 初描述的（1973，J.Biol.Chem.，Vol.248 :3838-3844)。CRM197突变体蛋白最初被描述为突 变tox97基因的转译产物，其中G-A的转变导致野生型白喉毒素的52位上的甘氨酸（G) 残基被谷氨酸残基（E)取代。
[0074] 根据本 申请人:的知识，直到现在CRM197已很难用作制备免疫原性化合物，特别是 肽偶联物的载体分子。根据本 申请人:的知识，CRM197已专门作为寡糖抗原的载体物质，即 用于产生针对本领域熟知具有一种非常特定的免疫学特性的非蛋白结构的抗体。更确切地 说，看来，CRM197已专门作为以下物质的载体分子：（i)来自肺炎链球菌的荚膜抗原的寡糖 (oligoside), (ii)来自脑膜炎奈氏球菌的寡糖和（iii)用于乙型流感嗜血杆菌的荚膜多 糖。
[0075] 本发明涉及包含如下通式（I)的肽的免疫原性化合物
[0076]NH2- [Nt]y-P-ff-N-X1-S-X2-S-N-X3-X4-X5-X6-X7-I-ff- [Ct]z-C00H(I),
[0077]其中：
[0078] _y是0或1的整数，
[0079] _z是0或1的整数，
[0080] _Nt由长度为1到100个氨基酸的肽组成，
[0081] -ct由长度为1到100个氨基酸的肽组成，
[0082]4是选自A(丙氨酸），T(苏氨酸），S(丝氨酸）和N(天冬酰胺）的氨基酸，
[0083] _X2是选自W(色氨酸）和A(丙氨酸）的氨基酸，
[0084] _X3是选自K(赖氨酸）和R(精氨酸）的氨基酸，
[0085] _X4是选自S(丝氨酸）和T(苏氨酸）的氨基酸，
[0086]_X5是选自L(亮氨酸），Y(酪氨酸）和Q(谷氨酰胺）的氨基酸，
[0087] _X6是选自D(天冬氨酸），N(天冬酰胺），E(谷氨酸），S(丝氨酸）、G(甘氨酸） 和K(赖氨酸）的氨基酸，
[0088] _X7是选自D(天冬氨酸），Q(谷氨酰胺），L(亮氨酸），A(丙氨酸），K(赖氨酸） 和E(谷氨酸）的氨基酸，
[0089] 通式（I)中的肽与由CRM197蛋白构成的载体蛋白共价连接。
[0090] 为本描述的目的，通式（I)的免疫原性化合物在此也可称为NH2-[Nt]y-SEQID N。l-[Ct]z-C00H(I)
[0091] 在通式（I)的免疫原性化合物的一些实施方案中，Xi优选为A，
[0092] 在通式⑴的免疫原性化合物的一些实施方案中，X2优选为W，
[0093] 在通式⑴的免疫原性化合物的一些实施方案中，X3优选为K，
[0094] 在通式⑴的免疫原性化合物的一些实施方案中，X4优选为S，
[0095] 在通式⑴的免疫原性化合物的一些实施方案中，X5优选为L，
[0096] 在通式（I)的免疫原性化合物的一些实施方案中，X6优选为D，和
[0097] 在通式⑴的免疫原性化合物的一些实施方案中，X7优选为D，
[0098] 在通式⑴的免疫原性化合物的一些实施方案中，一个或多个选自由XpX2、X3、X4、 X5、&和17组成的组的氨基酸都分别具有优选的上述特定含义。在一些实施方案中，选自 由XpX2、X3、X4、X5、\和X7组成的组的氨基酸的1、2、3、4、5、6或7都分别具有优选的上述 特定含义。
[0099] 在选自由XpX2、X3、X4、X5、\和X7构成的组的七个氨基酸都分别具有优选的上述 特定含义的实施方案中，所述免疫原性肽由通式（Ila)的肽组成：
[0100] NH2-[Nt]y-P-ff-N-A-S-ff-S-N-K-S-L-D-D-I-ff-[Ct]z-C00H(Ila),
[0101] 这也可称为：
[0102] NH2-[Nt]y-SEQIDN° 2-[Ct]z-C00H(Ila)。
[0103] 在选自选自由HHXjPX7组成的组的六个氨基酸都分别具有优选的上述 特定含义以及其中氨基酸X2是指A(丙氨酸）的实施方案中，所述免疫原性肽由通式（lib) 的肽组成：
[0104] NH2- [Nt]y-P-ff-N-A-S-A-S-N-K-S-L-D-D-I-ff- [Ct]z-C00H(Ilb),
[0105] 这也可称为：
[0106]NH2-[Nt]y-SEQIDN° 6-[Ct]z-C00H(lib)。
[0107] 带有从1到100氨基酸残基长度的Nt肽包含具有1，2, 3,4, 5,6, 7,8,9,10,11，12， 13,14,15,16,17,18,19,20, 21，22, 23,24, 25,26,27,28,29, 30,31，32,33,34, 35,36,37， 38, 39,40,41，42,43,44, 45, 46,47, 48,49,50,51，52,53,54, 55,56,57,58,59,60,61，62， 63, 64, 65,66,67,68,69,70, 71，72, 73,74, 75,76,77,78,79, 80,81，82,83,84, 85,86,87， 88,89,90,91，92,93,94,95,96,97,98,99 和 100 的氨基酸残基长度的肽，
[0108] 在一些实施方案中，Nt肽具有10个氨基酸残基的长度或更少，其包含5个氨基酸 残基或更少的氨基酸长度。
[0109] 在一些实施方案中，Nt肽的N-末端残基由C(半胱氨酸）残基组成。
[0110] 在一些实施方案中，Nt肽具有如下通式（III):
[0111] 具有SEQIDN。3 的NHfC-YfT-YfV-ail)，其中：
[0112] 4是选自T(苏氨酸）和P(脯氨酸）的氨基酸，
[0113] _Y2是选自A(丙氨酸），T(苏氨酸）和N(天冬酰胺）的氨基酸，
[0114] 在一些其它实施方案中，Nt肽由半胱氨酸残基（也被称为"C"）组成。
[0115] 带有从1到100氨基酸残基长度的Ct肽包含具有1，2, 3,4, 5,6, 7,8,9,10,11，12， 13,14,15,16,17,18,19,20, 21，22, 23,24, 25,26,27,28,29, 30,31，32,33,34, 35,36,37， 38, 39,40,41，42,43,44, 45, 46,47, 48,49,50,51，52,53,54, 55,56,57,58,59,60,61，62， 63, 64, 65,66,67,68,69,70, 71，72, 73,74, 75,76,77,78,79, 80,81，82,83,84, 85,86,87， 88,89,90,91，92,93,94,95,96,97,98,99 和 100 氨基酸残基长度的肽，
[0116] 在一些实施方案中，Ct肽具有10个氨基酸残基的长度或更少，其包含5个氨基酸 残基或更少的氨基酸长度。
[0117] 在一些实施方案中，Ct肽的C-末端残基由C(半胱氨酸残基）组成。
[0118] 在一些实施方案中，Nt肽具有通式（IV):
[0119]具有SEQIDN° 4 的-Y3-Y4-M-T-W-C00H(III)，其中：
[0120] _Y3是选自D(天冬氨酸），Q(谷氨酰胺），E(谷氨酸）和N(天冬酰胺）的氨基酸，
[0121]-Y4是选自N(天冬酰胺），H(组氨酸），S(丝氨酸）和K(赖氨酸）的氨基酸，
[0122] 在一些其它实施方案中，Ct肽由一个半胱氨酸残基（也被称为"C"）组成。
[0123] 在其它的一些实施方案中，在本发明的免疫原性化合物中缺少Ct肽。
[0124] 在根据本发明的免疫原性化合物的一些【具体实施方式】中，所述肽具有如下通式 (V)。
[0125] 因此，本发明涉及包含通式（V)的肽的免疫原性化合物
[0126]NH2-(Al)m-SEQIDN° l-(A2)n_C00H (V)，
[0127]其中：
[0128] _m是0或1的整数，
[0129] _n是0或1的整数，
[0130] -A1是氨基酸残基，并且
[0131] -A2是氨基酸残基，
[0132] 通式⑴中的肽与由CRM197蛋白组成的载体蛋白共价连接。
[0133] 在通式（V)的肽的一些实施方案中，m等于l，n等于0和A1是半胱氨酸（C)残基。
[0134] 本发明还涉及一种包含如下通式（Via)的肽的免疫原性化合物
[0135]NH2-(Al)m-SEQIDN° 2-(A2)n-C00H(VIa),
[0136]其中：
[0137] _m是0或1的整数，
[0138] _n是0或1的整数，
[0139] -A1是氨基酸残基，并且
[0140] -A2是氨基酸残基，
[0141] 通式（Via)中的肽与由CRM197蛋白组成的载体蛋白共价连接。
[0142] 本发明还涉及一种包含如下通式（VIb)的肽的免疫原性化合物
[0143]NH2-(Al)m-SEQIDN° 6-(A2)n-C00H (VIb),
[0144]其中：
[0145]_m是0或1的整数，
[0146] _n是0或1的整数，
[0147] -A1是氨基酸残基，并且
[0148] -A2是氨基酸残基，
[0149] 通式（VIb)中的肽与由CRM197蛋白组成的载体蛋白共价连接。
[0150] 在通式（Via)或（VIb)的肽的一些实施方案中，m等于l，n等于0和A1是半胱氨 酸（C)残基。
[0151] 显然地，通式（V)、（Via)或（VIb)的肽根据本发明的通式（I)的肽的具体实施方 案。因此，参照通式（I)的肽描述的本发明的免疫原性化合物的每个实施方案包含通式（I) 的肽由通式（V)的肽或通式（Via)或（VIb)的肽构成的相同实施方案，除非另有指明。
[0152] 也显然地，通式（Via)或（VIb)的肽是根据本发明的通式（V)的肽的具体实施方 案。因此，参照通式（I)或（V)的肽描述的本发明的免疫原性化合物的每个实施方案包含 其中通式⑴肽或通式（V)的肽由通式（Via)或（VIb)的肽构成的相同实施方案，除非另 有指明。
[0153] 如在此所使用的，氨基酸残基包括丙氨酸（也被称为"A"或"Ala"），精氨酸（也 被称为（"R"或"Arg"），天冬酰胺（也被称为"N"或"Asn"），天冬氨酸（也被称为"D" 或"Asp"），半胱氨酸（也被称为"C"或"Cys"），谷氨酰胺（也被称为"Q"或"Gin"），谷 氨酸（又称为（"E"或"Glu)，甘氨酸（也被称为"G"或"Gly"），组氨酸（也被称为"H" 或"His"），异亮氨酸（也被称为"I"或" 11e"），亮氨酸（也被称为"L"或"Leu"），赖氨酸 (也被称为"K"或"Lys"），蛋氨酸（又称为"M"或"Met"），苯丙氨酸（也被称为（"F"或 "Phe"），脯氨酸（也被称为"P"或"Pro"），丝氨酸（也被称为"S"或"Ser"），苏氨酸（也 被称为"T"或"Thr"），色氨酸（也被称为"W"或"Trp"），酪氨酸（也被称为"Y"或"Tyr"） 和缬氨酸（也被称为"V"或"Val"）。
[0154] 如上文所述，CRM197是用于向免疫系统细胞提供蛋白抗原的的非常规载体分子。 CRM197对于本领域技术人员是可容易得到的。特别地，CRM197可以商品名CRM197(rDNA) 由CompanyPfenexInc(SanDiego,美国）商购。在此CRM197 定义为具有SEQIDN。8 的蛋白。
[0155] 通式（I)的肽，包括在此描述的通式（V)和通式（Via)或（VIb)的【具体实施方式】， 可以由已知的克隆技术或通过化学合成制备。
[0156] 例如，DNA编码通式（I)的肽是利用克隆技术制备的，并将其插入可自主复制载体 以制备重组DNA。将重组DNA引入适当的宿主，如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、放线菌、酵母菌、 丝状真菌、植物细胞、昆虫细胞和动物细胞，以获得转化子。从转化子的培养产物可获得含 有通式（I)的肽的肽。或者，制备编码通式（I)的肽的DNA，并通过利用小麦胚芽和来自大 肠杆菌的细胞提取物无细胞蛋白合成系统以合成本发明的肽。在通式（I)的肽与载体蛋白 连接的一些实施方案中，可以通过重组DNA技术合成由含有通式（I)的肽和期望的载体蛋 白的融合蛋白组成的免疫原性产品。
[0157] 此外，使用常规的化学合成方法，如"固相法"或"液相法"，通过脱水/缩合依次连 接和扩展氨基酸从而合成通式（I)的肽。
[0158] 为了制备如上述定义的免疫原性化合物，可以使用任何合适的偶联反应，利用必 要时的任何适合的连接部分，这是本领域众所周知的。
[0159] 在通式（V)、（Via)或（VIb)的肽的某些实施方案中，当整数m和/或n(是）等于 〇时，氨基酸残基A1和/或A2是不在的。
[0160] 在通式（V)、（Via)或（VIB)的肽的一些实施方案中，A1存在（即整数m= 1)和 A2不存在（即整数n= 0)。
[0161] 在通式（V)、（Via)或（VIb)的肽的一些实施方案中，A1不在（即整数m= 0)和 A2存在（即整数n= 1)。
[0162] 在通式（V)、（Via)或（VIb)的肽的一些优选的实施方案中，A1和/或A2,当存在 时，由（S)的半胱氨酸残基组成。
[0163] 在通式（V)、（Via)或（VIb)的肽的一些优选的实施方案中，A1存在并由N-末端 的半胱氨酸残基组成以及A2不存在，即整数n等于0。在这些优选的实施方案中，肽或通 式（V)、或（Via)由SEQIDN° 5的肽组成。在这些优选的实施方案中，通式（V)或（VIb) 的肽由SEQIDN° 7的肽组成。
[0164] 从技术的角度来看，通式（I)的肽，包括通式（V)或式（VI)的肽，可直接或通过连 接部分共价连接到CRM197,通过它们的N-末端氨基酸残基或通过它们的C-末端氨基酸残 基。在这些一般实施方案中，共价键可以包括来自通式（I)的肽的所述氨基酸残基的可用 的氨基和羧基。或者，共价键可包括位于来自通式（I)的肽的所述氨基酸残基的 侧链上的可用的氨基、羧基或硫醇基。
[0165] 然而，已经发现如上述定义的其中通式⑴的肽通过其C-末端与CRM197共价连 接的免疫原性化合物并不是最佳的，因为这样的免疫原性肽具有形成聚集体的倾向，这可 能表示其在获得化学定义的和容易复制的药物组合物方面的明显缺点。
[0166] 因此，在上述定义的免疫原性化合物的一些优选的实施方案中，通式（I)的肽通 过其N-末端共价结合CRM197。
[0167] 此外，在上述定义的免疫原性化合物中，通式（I)的肽最优选通过适当的接头 (linker)与CRM197共价连接。在此发现接头桥接通式（I)的肽和CRM197的接头的存在在 分子中引入了一定的柔性，使得通式（I)的肽中包含的与存在于免疫系统的，即主要是T细 胞和B细胞，细胞表面的相应受体相关的表位具有较好的可利用性。
[0168] 因此，在上述定义的免疫原性化合物的一些优选的实施方案中，通式（I)的肽通 过连接部分共价结合到CRM197。
[0169] 在一些优选的实施方案中，通式（I)的肽共价结合到CRM197的N-末端，通过连接 部分。
[0170] 所述连接部分是通过使连接部分同时与CRM197和通式（I)肽接头反应而获得。
[0171] 在优选实施方案中，接头分别具有两种不同的反应性基团，（i)琥珀酰亚胺基和 (ii)马来酰亚胺基团。每个反应性基团可用于分别与⑴CRM197和（ii)通式⑴的肽的 氣基或疏基反应。
[0172] 这种接头种类是本领域众所周知的且易于商购得到。
[0173] 然而，在此发现了这些异双功能接头不是最佳的，特别是当寻求制备一种疫苗 组合物时。具体来说，本发明人发现了异双功能接头如MBS(间-马来酰亚胺基苯甲酰 基-N-轻基玻拍醜亚胺酯（m-MaleimidoBenzoyl-N-hydroxySuccinimidyl酯））的使用导 致最终产品很难溶于水。免疫原性化合物的低水溶性在制造疫苗组合物方面可能是实质上 的技术缺陷，原因在于易于给药的疫苗组合物的最终剂型通常由水基盐水体溶液或悬浮液 组成，其最终可能还包含一种或多种药学上可接受的水溶性溶剂。如在这里的实施例说明 的，其中CRM197通过MBS共价连接到通式（I)的肽的免疫偶联物保持免疫原性，即当被体 内注射时能够产生相关的抗-3S抗体，尽管由于其形成聚集体的倾向而不能够被用作疫苗 组合物的活性成分。
[0174] 令人惊奇的是，本发明人已经确定有限的的接头家族是最适合制造在此定义的免 疫原性化合物的。从适合作为疫苗组合物的免疫原性活性成分的角度看，所述免疫原性化 合物应是完全水溶性的并因此应均匀地分布在液体组合物的整个体积中。所述有限的接头 家族包括，或甚至分别由命名为SMPB和磺基SMPB的接头组成。
[0175] 因此，在上述定义的免疫原性化合物的一些优选的实施方案中，所述接 头选自SMPB(琥拍酰亚胺基4-[对-马来酰亚胺苯基]丁酸酯（succinimidyl 4-[p-maleimidophenyl]butyrate))和磺基-SMPB(磺基琥拍酰亚胺基4-[对-马来酰亚胺 苯基]丁酸酉旨（sulfosuccinimidyl4-[p_maleimidophenyl]butyrate))。
[0176] 将两种蛋白与一般的接头，特别是与选自SMPB和磺基-SMPB的接头偶联的方法是 本领域众所周知。具体来说，这样的方法在由PierceCompany(Illinois，Etats_Unis)公 开在公众可得的印刷品中。
[0177]SMPB和磺基-SMPB由包含N-羟基琥珀酰亚胺（NHS)酯基和马来酰亚胺基的异双 功能接头组成。使用SMPB或磺基-SMPB的偶联通常是由两步过程进行。在第一步骤中，含 胺蛋白（如CRM197)与过量几倍摩尔的交联剂在pH7-9反应形成酰胺键，接着去除过量的 未反应接头，通常通过脱盐或渗析。在第二步骤中，添加含有巯基（例如通式（I)的肽）分 子以与已经连接到第一蛋白的马来酰亚胺基团（例如，已共价连接到CRM197的连接链的自 由马来酰亚胺基团）在pH6. 5-7. 5反应形成稳定的硫醚键。
[0178] 使用SMPB或磺基-SMPB作为将通式⑴的肽的共价连接到CRM197载体蛋白的接 头得到如下通式（VII)的偶联物：
【权利要求】
1. 一种包含如下通式（I)肽的免疫原性化合物， NH2- [Nt] y-P-ff-N-XrS- -X2-S-N-X3-X4-X5-X6-X 7-I-ff- [Ct] z-COOH (I), 其中： -y是〇或1的整数， -z是0或1的整数， -Nt由长度为1到100个氨基酸的肽组成， -Ct由长度为1到100个氨基酸的肽组成， -?是选自A (丙氨酸）、T (苏氨酸）、S (丝氨酸）和N(天冬酰胺）的氨基酸， _X2是选自W(色氨酸）和A (丙氨酸）的氨基酸， _X3是选自K (赖氨酸）和R(精氨酸）的氨基酸， _X4是选自S (丝氨酸）和T (苏氨酸）的氨基酸， _X5是选自L (亮氨酸）、Y (酪氨酸）和Q (谷氨酰胺）的氨基酸， _X6是选自D(天冬氨酸）、N(天冬酰胺）、E(谷氨酸）、S(丝氨酸）、G(甘氨酸）和K(赖 氨酸）的氨基酸， _X7是选自D(天冬氨酸）、Q(谷氨酰胺）、L(亮氨酸）、A(丙氨酸）、K(赖氨酸）和E(谷 氨酸）的氨基酸， 通式⑴中的肽与由CRM197蛋白组成的载体蛋白共价连接。
2. 根据权利要求1所述的免疫原性化合物包含选自以下通式（Via)和（VIb)的肽： NH2-(Al)m-SEQ IDN° 2-(A2)n-COOH(VIa), NH2-(Al)m-SEQ IDN° 6-(A2)n-COOH(VIb), 其中： -m是0或1自的整数， -n是0或1的整数， -A1是氨基酸残基，并且 -A2是氨基酸残基， 通式（Via)或（VIb)中的肽与由CRM197蛋白组成的的载体蛋白共价连接。
3. 根据权利要求1到2的任一项所述的免疫原性化合物，选自SEQ ID N° 5和SEQ ID N° 7。
4. 根据权利要求1到3的任一项所述的免疫原性化合物，其通过其N-末端氨基酸残基 共价结合到CRM197蛋白。
5. 根据权利要求1到4的任一项所述的免疫原性化合物，其通过接头部分共价结合到 CRM197 蛋白。
6. 根据权利要求5所述的免疫原性化合物，其中所述接头部分是具有两个反应性基团 的接头与CRM197和通式⑴肽的反应产物。
7. 根据权利要求6所述的免疫原性化合物，其中所述接头部分由琥珀酰亚胺基 4_ [对-马来酰亚胺基苯基]丁酸酯（SMPB)和磺基-SMPB组成。
8. 含有权利要求1到7的任一项所述的免疫原性化合物和一种或多种免疫佐剂物质的 组合物。
9. 根据权利要求8所述的组合物，其适于形成即用型疫苗组合物，包含表示为抗原性 肽当量的每个剂量单位为0. 01 y g到200 i! g，优选0. 05 i! g到50 i! g，最优选从0. 1 i! g到 20 U g量的所述抗原性化合物。
10. 根据权利要求8到9的任一项所述的组合物，其中所述免疫佐剂物质由氢氧化铝 (Al(OH)3)组成。
11. 根据权利要求10所述的组合物，其适于形成即用型疫苗组合物，包含表示为Al3+离 子含量的终浓度为〇. 1到5mg/ml，优选0. 05到2mg/ml，并且最优选是约lmg/ml的氢氧化 错。
12. 根据权利要求9到11的任一项所述的组合物，其适于形成即用型疫苗组合物，包含 终浓度为〇. 1至50mM的磷酸钠，优选0. 5至15mM的磷酸钠，最优选约ImM的磷酸钠。
13. 根据权利要求9到12的任一项所述的组合物，它是液体形式或固体形式，包括冻干 形式。
14. 包含权利要求1到6的任一项所述的免疫原性化合物，或根据权利要求8到13的 任一项所述的组合物，和一种或多种药学上可接受的载体的疫苗组合物。
15. 根据权利要求1到7的任一项所述化合物，或根据权利要求8到13的任一项所述 的组合物，或根据权利要求14所述的疫苗组合物，用作药物的用途。
16. 根据权利要求1到7的任一项所述的免疫原性化合物，或根据权利要求8到13的 任一项所述的组合物，或根据权利要求14所述的的疫苗组合物，用于预防和/或治疗HIV 病毒感染的个体的病症。
【文档编号】A61P31/18GK104507496SQ201380041048
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2013年5月30日 优先权日:2012年5月31日
【发明者】若埃尔·克鲁泽, 拉斐尔·何崇方, 多米尼克·德方丹 申请人:伊纳维尔瓦克斯公司