Fuc3S4S取代的低聚糖胺聚糖及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了重均分子量(Mw)约4.5～9kD的Fuc3S4S取代的低聚糖胺聚糖、含所述Fuc3S4S取代的低聚糖胺聚糖的药物组合物、它们的制备方法及其在制备预防或治疗血栓性疾病的药物中的应用。所述低聚糖胺聚糖具有式(I)所示结构，式(I)所含取代基同说明书定义。所述Fuc3S4S取代的低聚糖胺聚糖及其药物组合物具有强效因子Ⅹ酶抑制活性和HC-II依赖的抗凝血酶活性，可用于制备抗血栓药物。
【专利说明】Fuc3S4S取代的低聚糖胺聚糖及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于医药【技术领域】，具体地，涉及重均分子量(Mw) 4.5~9kD的Fuc3S4S取代的低聚糖胺聚糖及其药学上可接受的盐，含所述Fuc3S4S取代的低聚糖胺聚糖及其药学上可接受的盐的药物组合物，Fuc3S4S取代的低聚糖胺聚糖及其药物组合物的制备方法及其在制备预防或治疗血栓性疾病的药物中的应用。
【背景技术】
[0002]岩藻糖化糖胺聚糖(Fucosylated Glycosaminoglycan, FGAG)是一类从棘皮动物体壁中获得的带有硫酸化岩藻糖侧链取代的糖胺聚糖衍生物。不同棘皮动物来源及不用方法制备的FGAG在化学组成上既有共同点也存在差异。
[0003]不同来源的FGAG的共同点主要表现在组成单糖包括D-2-乙酰胺基_2_脱氧半乳糖(D-GalNAc)、D-葡萄糖醛酸(D-GlcUA)和L-岩藻糖(L-Fuc)以及它们的硫酸酯。其中，D-GlcUA和D-GalNAc通过β-(1_3)及β-(1_4)糖苷键交替连接形成糖胺聚糖的主链，而L-Fuc 则以侧链形式连接于主链(Ricardo P.et al.，JBC, 1988，263(34): 18176 ；KenichiroY.et al., Tetrahedron Lett, 1992，33(34):4959)。
[0004]不同来源的FGAG在结构上的不同点主要包括L-Fuc的硫酸化程度及位置不同以及主链硫酸化程度及位置不同。目前见于报道的FGAG的岩藻糖侧链的硫酸根取代大多比较复杂。例如，仿刺参(Stichopus japonicas)来源的FGAG主要含有三种类型的L-Fuc,即2，4- 二硫酸酯(Fuc2S4S)、4_ 二硫酸酯(Fuc4S)及 3，4- 二硫酸酯(Fuc3S4S)，且 Fuc2S4S约占L-Fuc总量的~60%，而其主链上的D-GalNAc主要为4，6- 二硫酸酯(GalNAc4S6S)(Kenichiro Y, et al.TetrahedronLett, 1992, 33:4959);玉足海参(Holothurialeucospilota) FGAG的L-Fuc类型不清楚，其主链上的D-GalNAc含4-硫酸酯基(GalNAc4S)(樊绘曾，等，药学学报，1983, 18(3): 203);巴西产海参Ludwigothurea grisea的FGAG的L-Fuc中，Fuc4S含量最高(~49%)，另含Fuc2S4S (~20%)、-3S4S (~17%)及无硫酸酯基取代的 L-Fuc (FucOS)，其主链 D-GalNAc 类型包括 GalNAc6S (~53%)、-4S6S (~12%)和-4S (31%) (LuborB.et al.J.Biol.Chem.2007, 282:14984);梅花参(Thelenata ananas)FGAG 的 L-Fuc 类型包括 Fuc2S4S (~53%)、-4S (~22%)、-3S (~25%)，所含 D-GalNAc 主要为 GalNAc4S6S (~95%)及-6S (~5%) (WuM.，et al.Carbohydr.Polym.，2012，87 (I): 862)。此外，Isostichopus badionatus 的 FGAG 的 L-Fuc 主要是 Fuc_2S4S(~96%)，Holothuriavagabunda的FGAG的L-Fuc类型类似于巴西产海参，Stichopus tremulus的FGAG包括 Fuc3S4S(~53%)、-2S4S(~22%)和-4S (~25%) (Chen SG, et al.Carbohydr.Polym.，2011，83(2):688)。
[0005]多种海参来源的FGAG具有强效抗凝血活性(张佩文，中国药理学与毒理学杂志，1988，2(2):98 ；Paulo AS.etal.，J.Biol.Chem.1996，271:23973)，但天然来源的 FGAG也具有诱导血小板聚集 的活性(Jiazeng L.et al, Thromb Haemos, 1988，54(3):435 ;单春文，中药药理与临床，1989，5(3):33)和激活因子XII的表面激活活性(Roberto J.etal.Thromb Haemost.2010, 103:994)。对于刺参来源的FGAG，通过解聚所获得的DHG可减弱血小板诱导聚集活性(Hideki N.etal.，Blood, 1995，85 (6): 1527)。
[0006]海参来源的FGAG的抗凝血活性的药理学机制研究显示，FGAG具有不同于肝素、硫酸皮肤素的机制特点，例如，FGAG为强效的F.Xase抑制剂，可抑制内源性因子X酶对因子X的激活；存在依赖ATIII和HCII的抗凝血酶活性；存在抑制凝血酶IIa反馈激活因子XIII的活性(Hideki N., 1995);存在因子XII激活活性(Roberto J.2010)。一般认为广泛的药理学机制与抗凝药物的出血倾向副作用有关(Bauer, Hematology, 2006, (I):450),提高FGAG的药理学作用靶点的选择性有益于降低出血倾向。
[0007]改善天然来源的FGAG的药理学作用靶点的选择性的可选择的途径之一是对其进行化学结构修饰。例如，对天然FGAG进行过氧化解聚(欧洲专利公开EP0408770 ；KenichiroY, 1992)、脱硫酸化或羧基还原(Paulo AS etal., Thrombosis Research, 2001，102:167)、部分酸水解(Yutaka Kariya, Biochem.J., 2002, 132:335; Paulo AS etal., ThrombosisResearch, 2001, 102:167)等。现有资料显示，降低天然FGAG分子量可影响其药理学作用特点，例如降低诱导血小板聚集的活性，减弱依赖ATIII及HC-1I依赖的抗凝血酶活性等(樊绘曾等，生物化学杂志，1993，9(2):146;马西，中华血液学杂志，1990，11(5): 241 ;Paulo AS etal.，J.Biol.Chem.1996，271，23973 ; Hideki Nagaseetal.，Blood, 1995，85(6): 1527)。然而简单解聚尚难获得抗凝效价与靶点选择性均较理想的抗凝活性产物。例如刺参FGAG重均分子量(Mw)低至约9kD时方能有效降低其血小板诱聚活性(樊绘曾等，生物化学杂志，1993，9 (2):146);而具有合适抗凝活性强度的解聚产物的 Mw 约为 12 ~15kDa (Nagase etal., Thromb Haemost, 1997, 77 (2): 399; KazuhisaM etal., Kidney Int.,2003, 63:1548;Sheehan etal., Blood, 2006, 107(10):3876 ;赵金华等.CN1017 24086A)。水解侧链岩藻糖以及部分去硫酸化都可以致FGAG抗凝血活性显著降低乃至消失，羧基还原对抗凝活性影响相对较小，但出血倾向仍然显著且对血小板活性的影响未知(Paulo AS etal., Br J.Haematol., 1998, 101:647; Paulo ASetal., ThrombRes.2001, 102:167)。
[0008]本发明人在海参来源的FGAG的抗凝活性构效关系研究中，对FGAG解聚方法进行了系统研究，例如建立了过渡金属离子催化的过氧化解聚法、β_消除解聚方法、脱酰脱氨基解聚方法等(赵金华等，CN101735336B;CN103145868A;CN103214591A)。前者可以提高解聚反应的效率和反应过程的可控性；后两者可以获得具有特殊的还原性或非还原性末端糖基，显著提高产物质量的可控性。此外，本发明人对FGAG所含结构片段及化学基团(如D-β-GlcUA所含羧基，D-β-GalNAc所含乙酰氨基等)的结构修饰方法及其结构修饰产物的构效关系进行了较为系统研究(刘吉开等，CN102558389A;赵金华等，CN102247401A;Zhao L.et al.CarbohydrPolym.2013, (98):1514;Lian ff.etal.BBA, 2013，1830:4681)。但是，除了非选择性脱除硫酸酯基外，这些结构修饰方法均不能改变FGAG主链及侧链的硫酸酯化程度及位置。也就是说，FGAG主侧链硫酸化形式仍然取决于其天然来源。
[0009]如前文所述，不同物种来源的FGAG的主侧链硫酸化形式可以存在较大区别。本发明人前期工作已发现梅花参FGAG具有较弱的激活血小板活性的优势特点(赵金华等，CN101724086A;Wuet al.Food Chem.2010 (122) 716)。但是，梅花参 FGAG 所含侧链L-Fuc 的硫酸酯基取代形式较复杂(Mingyi W.，2010; Zhao L.，2013; Lian W.，2013)，其解聚产物的结构确证、产物化学结构均一性分析等质量分析相关的技术难度较大。文献报道
1.badionatus 来源的 FGAG 的侧链 L-Fuc 主要是 Fuc2S4S(~96%) (Chen SG, 2011)，此为FGAG类化合物结构研究提供了便利条件，由于Fuc2S4S结构与FGAG的f.XII激活活性相关(Roberto J.2010)，这无疑限制了侧链以Fuc2S4S为主的FGAG的应用价值。
[0010]糙海参(Holothuria scabra)多糖见于报道，但其研究仅限于总多糖制备工艺与活性的初步研究(沈鸣等.中国海洋药物，2003, 91 (I):1)、酸性粘多糖的初步理化性质分析(陈健等.食品与发酵工业，2006, 32 (10): 123)及提取工艺探讨(郑艾初等.现代食品科技，2007，23(5):65)。本发明人在对一系列海参来源的FGAG进行系统研究中发现，糙海参多糖不仅包括FGAG,还包括几种结构和聚合度不同的酸性岩藻聚糖(Fucan sulfate)以及类似糖原结构的中性多糖。由于数种酸性岩藻聚糖及中性多糖具有与FGAG近似的分子量，因此，现有文献方法获得的多糖类成分应当并非纯净的糙海参FGAG。
[0011]多糖类化学结构分析具有较高的技术难度，本发明人在综合采用糖化学分析、酶法分析、特殊衍生物制备及其波谱解析技术研究糙海参FGAG的化学结构过程中发现，糙海参FGAG具有非常特殊的化学结构特征，即其所含侧链L-Fuc主要是a -L_Fuc3S4S (占其全部侧链取代基的75%以上)。NMR谱图及精细化学结构分析显示，糙海参FGAG的重复结构单元较刺参、巴西产海参L.grisea、梅花参等前文所述多种海参来源的FGAG的重复结构单元更为规则。显然，这种化学结构的规则性有利于实现其潜在的应用价值。
[0012]另一方面，多种类型的聚阴离子物质具有f.XII激活(表面激活)活性，如聚磷酸、RNA片段、细菌内毒素、过硫酸软骨素等(Mackmanet al., J ThrombHaemost.2010, 8(5):865)。鉴于资料显示,侧链岩藻糖硫酸酯化程度较高的Fuc2S4S结构与FGAG激活f.XII的活性相关(Roberto J.，2010)，侧链L-Fuc上的硫酸酯基的负电荷载量自然成为关注FGAG激活f.XII活性的关键性结构特征。然而，本发明人在大量的比较试验研究中进一步惊奇发现，尽管糙海参FGAG主侧链均具有较高的负电荷载量(其主链中的β -D-GalNAc主要为4，6- 二硫酸酯基取代，75%以上的侧链a -L-Fuc存在3，4- 二硫酸酯基取代)，但其原型和解聚产物的f.XII激活活性却在所见海参来源的FGAG中最弱。
[0013]采用本发明人已建立的技术(赵金华等，CN101735336A;CN103145868A;CN103214591A)制备糙海参FGAG解聚衍生物，本发明人进一步惊奇发现，相对于其他多种海参来源的FGAG解聚产物，糙海参FGAG解聚产物可在更低分子量(Mw约4.5~9kD)时保持强效抗凝活性，例如，可在Mw约5_8kD时呈现最强的f.Xase抑制活性，在Mw约5kD时呈现最强的HCII依赖的抗凝血酶活性。随后，本发明人从格皮氏海参(P.graeffei)提取纯化了侧链主要为L-Fuc3S4S的结构近似的FGAG类化合物。采用前文所述本发明人建立的技术方法获得解聚产物后，其解聚产物具有近似糙海参FGAG解聚产物的抗凝活性以及不影响f.XII及血小板的活性特征。
[0014]侧链L-Fuc的硫酸酯化方式而非简单的电荷负载量显著影响着FGAG及其衍生物的药理药效学活性特征。侧链主要为L-Fuc3S4S的FGAG解聚产物具有更为规则的重复结构单元，并且具有更为优势的抗凝药理学作用特征。
[0015]血栓性疾病目前仍然是人类主要的致死性病因，抗凝血药物在血栓性疾病的预防和临床治疗中具有重要作用。肝素类药物是主要的临床用药，但存在严重出血倾向的缺陷，一般认为其出血倾向与其较广泛的凝血因子影响以及共同途径凝血抑制相关，而f.Xase抑制和HCII依赖的抗f.1Ia活性机制可能有利于降低抗凝活性成分的出血倾向。
[0016]糙海参和格皮氏海参等海参来源的侧链主要为L-Fuc3S4S的低聚糖胺聚糖可具有强效抗凝活性，其抗凝机制主要为f.Xase抑制和HCII依赖的抗f.1Ia活性；而侧链主要为L-Fuc3S4S的低聚糖胺聚糖具有更为规则的重复结构单元和具有更为优势的抗凝药理学作用特征，因此具有重要的预防和临床治疗血栓性疾病的应用潜力。
【发明内容】
[0017]本发明首先提供一种Fuc3S4S取代的低聚糖胺聚糖混合物及其药学上可接受的盐，所述Fuc3S4S取代的低聚糖胺聚糖混合物是具有式(I)所示结构的低聚同系糖胺聚糖类化合物的混合物，
[0018]
【权利要求】
1.一种Fuc3S4S取代的低聚糖胺聚糖混合物及其药学上可接受的盐,所述Fuc3S4S是指3，4-二硫酸酯化-L-岩藻糖-1-基，所述取代的低聚糖胺聚糖混合物是具有式(I)所示结构的低聚同系糖胺聚糖类化合物的混合物，
2.如权利要求1所述的Fuc3S4S取代的低聚糖胺聚糖混合物及其药学上可接受的盐，其特征在于所述混合物是具有式(VII)所示结构的低聚同系糖胺聚糖化合物的混合物，
3.如权利要求1所述的Fuc3S4S取代的低聚糖胺聚糖混合物及其药学上可接受的盐，其特征在于所述混合物是具有式(VIII)所示结构的低聚同系糖胺聚糖化合物的混合物，
4.如权利要求1所述Fuc3S4S取代的低聚糖胺聚糖混合物及其药学上可接受的盐，其特征在于所述混合物是具有式(IX)所示结构的低聚同系糖胺聚糖化合物的混合物，
5.如权利要求1~4之任一项所述的Fuc3S4S取代的低聚糖胺聚糖混合物及其药学上可接受的盐，其特征在于所述低聚糖胺聚糖混合物由海参来源的Fuc3S4S取代的糖胺聚糖经化学解聚制备而得，其中，所述Fuc3S4S取代的糖胺聚糖具有如下特征:单糖组成包括摩尔比在1: (1±0.3): (I±0.3)范围内的D-葡萄糖醛酸、D-乙酰氨基半乳糖和L-岩藻糖；以摩尔比计，其所含a -L-岩藻糖基中，3，4- 二硫酸酯化-a -L-岩藻糖基所占比例不低于.75%。
6.如权利要求5所述的Fuc3S4S取代的低聚糖胺聚糖混合物及其药学上可接受的盐，其特征在于所述海参来源的Fuc3S4S取代的糖胺聚糖从新鲜或干燥的糙海参Holothuriascabra或格皮氏海参Pearsonothuriagraeffei体壁和或内脏经提取纯化获得。
7.如权利要求1~6之任一项所述的Fuc3S4S取代的低聚糖胺聚糖混合物及其药学上可接受的盐，其特征在于所述的药学上可接受的盐是Fuc3S4S取代的低聚糖胺聚糖混合物的钠盐、钾盐或钙盐。
8.权利要求1~7之任一项所述的Fuc3S4S取代的低聚糖胺聚糖混合物及其药学上可接受的盐的制备方法，包括如下步骤: 步骤一:从新鲜或干燥的糙海参H.scabra或格皮氏海参P.graeffei中提取、纯化获得含Fuc3S4S取代的糖胺聚糖的多糖组分； 所述含Fuc3S4S取代的糖胺聚糖的多糖组分是指多糖组分具有均一性分子量，即主要组分在凝胶色谱柱上呈单一多糖色谱峰，且多分散系数(roi)在I~1.5之间；以质量百分比计，Fuc3S4S取代的糖胺聚糖在多糖组分中的含量不低于80% ； 所述Fuc3S4S取代的糖胺聚糖是指一种岩藻糖化糖胺聚糖，其组成单糖包括摩尔比在1: (1±0.3): (1±0.3)范围内的D-葡萄糖醛酸、D-乙酰氨基半乳糖和L-岩藻糖；并且，以摩尔比计，其所含a -L-岩藻糖基中，3，4- 二硫酸酯化-α -L-岩藻糖基所占比例不低于75% ； 步骤二:将“步骤一”所得多糖组分中的Fuc3S4S取代的糖胺聚糖解聚至重均分子量(Mw) 4.5kD~9kD的低聚同系糖胺聚糖混合物,所述解聚方法任选自: 方法1、β -消除解聚法，所述方法包括通过季铵盐化和酯化反应将“步骤一”所得多糖组分中的糖胺聚糖中的10%~50%己糖醛酸转化为己糖醛酸羧酸酯；继而在非水溶剂中，碱处理所得糖胺聚糖羧酸酯，使之发生β_消除反应，由此获得目标分子量范围内的、非还原端为4-脱氧-threo-己-4-烯吡喃糖醛酸基的解聚产物； 方法2、脱酰脱氨基解聚法，所述方法包括在有或无硫酸肼存在下，肼处理“步骤一”所得多糖组分，使其所含Fuc3S4S取代的糖胺聚糖中的10%~35%的D-乙酰氨基半乳糖发生脱乙酰化反应，继而以亚硝酸处理所得部分脱乙酰化产物，使发生脱氨基反应并解聚，获得目标分子量范围内的、还原性末端为2，5-脱水塔罗糖基的低聚同系糖胺聚糖混合物； 方法3、过氧化解聚法，所述方法包括在铜离子存在下，采用终浓度3%~10%的H2O2处理“步骤一”所得多糖组分，获得目标分子量范围内的低聚同系糖胺聚糖混合物； 通过方法I~3之任一方法制备的解聚产物均任选进行羧基还原反应和/或末端还原处理，将己糖醛酸还原成相应的己糖和/或将其还原性末端的D-2-乙酰氨基-2-脱氧-半乳糖基和/或2，5-脱水塔罗糖基转化为其相应的糖醇、糖胺或N取代的糖胺。所述解聚产物及羧基和/或末端还原的解聚产物均任选采用沉淀法、离子交换层析、凝胶过滤层析、透析法和/或超滤法纯化，并通过减压干燥和/或冷冻干燥法获得Fuc3S4S取代的低聚同系糖胺聚糖混合物的固形物。
9.权利要求8所述Fuc3S4S取代的低聚糖胺聚糖混合物及其药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于，所述制备方法中，采用“步骤二”所述“方法I”的β -消除法解聚“步骤一”所得含Fuc3S4S取代的糖胺聚糖的多糖组分，其所述酯化反应步骤是将“步骤一”所得多糖组分中的Fuc3S4S取代的糖胺聚糖转化为其季铵盐后，在非质子化溶剂系统中与卤代烃或卤代芳烃反应获得酯化程度约10%~50%的所述糖胺聚糖的羧酸酯化产物；其“ β -消除反应”步骤中，所述非水溶剂任选自乙醇、甲醇、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、CH2C12、CHCl3或者它们的混合溶剂，所述碱性试剂任选自Na0H、K0H、Cl-C4醇钠、乙二胺、三正丁胺、4- 二甲氨基吡啶或者它们的混合物。
10.权利要求8所述FUC3S4S取代的低聚糖胺聚糖混合物及其药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于，所述制备方法中，采用“步骤二”所述“方法2”的脱酰脱氨基法解聚“步骤一”所得含Fuc3S4S取代的糖胺聚糖的多糖组分，“方法2”所述肼处理步骤是将所述糖胺聚糖混合物溶解于无水肼或水合肼溶液中，在有或无硫酸肼存在下反应；所述亚硝酸处理是在冰浴至室温条件下将部分脱乙酰化产物加入pH2~5亚硝酸溶液中反应5min~60min,调溶液至碱性终止反应。
11.一种含有权利要求1至7之任一项所述的Fuc3S4S取代的低聚糖胺聚糖混合物或其药学上可接受的盐的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有有效抗凝血剂量的所述低聚糖胺聚糖混合物或其药学上可接受的盐以及药用赋形剂。
12.权利要求11所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型为注射用水溶液或注射用冻干粉针剂。
13.权利要求11和12所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物所含的药用辅料为药学上可接受的氯化钠、磷酸缓冲盐。
14.权利要求1至7之任一项所述的低聚糖胺聚糖混合物或其药学上可接受的盐在制备血栓性疾病的治疗或预防药物中的应用，所述血栓性疾病为静脉血栓形成、动脉血栓形成、缺血性心脏病、缺血性脑血管病。
15.权利要求11 至13之任一项所述的药物组合物在制备血栓性疾病的治疗或预防药物中的应用，所述血栓性疾病为静脉血栓形成、动脉血栓形成、缺血性心脏病、缺血性脑血管病。
【文档编号】A61K31/726GK103788222SQ201410007855
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年1月8日 优先权日:2014年1月8日
【发明者】赵金华, 何金星, 吴明一, 刘峙汶, 高娜, 赵龙岩, 李姿, 卢锋, 徐丽, 肖创, 杨莲, 陈钧, 周路坦, 彭文烈, 刘吉开 申请人:中国科学院昆明植物研究所, 云南恩典科技产业发展有限公司