一种鱼胶原基双重缓释药膜的制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种鱼胶原基双重缓释药膜及其制备方法。它是以生物素偶联胆甾醇化乙二醇壳聚糖自聚集纳米粒包载抗肿瘤药物，再将该载药纳米粒与废弃鱼皮胶原、壳聚糖复合，经冷冻干燥制成鱼胶原基双重缓释药膜。该药膜具有局部缓释、减少全身毒副作用等优点。
【专利说明】一种鱼胶原基双重缓释药膜的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种鱼胶原基双重缓释药膜的制备方法，属于药物制剂领域。
【背景技术】
[0002]化疗是恶性肿瘤治疗的主要手段之一，但抗肿瘤药物的选择性低，其严重的毒副作用往往给患者造成极大的伤害。因此，急需寻找一种能在体内维持较长时间有效药物浓度的药物剂型，尤其能在肿瘤局部发挥持续效用，从而实现高效低毒的肿瘤治疗。而植入式缓释药膜正是符合这一要求的药物新剂型。将缓释药膜与纳米技术相结合，可改善药物突释现象，实现药物的双重缓释及靶向性，从而增强药物的抗肿瘤作用，减小毒副作用。
[0003]近年来，胶原基生物材料用作植入式药物缓释载体的研究受到了人们的关注，然而该类材料使用的胶原蛋白主要是从陆生动物中提取的(如猪、牛)，随着疯牛病和口蹄疫等疾病的发生，以及宗教和习俗等原因，使它们的应用受到了限制。鱼鳞、鱼皮等水产废弃物含有丰富的胶原蛋白，其氨基酸组成与陆生哺乳动物胶原无明显差异，且其不存在上述人畜共患的传染性疾病，具有开发和利用的价值(Trends in Food Science & Technology,2008，19: 644-656)。然而目前，鱼胶原作为植入式药物缓释载体材料的研究还鲜有报道。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种鱼胶原基双重缓释药膜的制备方法，由本发明制备的药膜，可改善药物突释现象，实现药物的局部缓释及靶向性，减少全身毒副作用，且其制备过程简单、价廉易得。
[0005]为实现上述目的，本发明采用生物素偶联胆留醇化乙二醇壳聚糖自聚集纳米粒包载抗肿瘤药物，再将该载药纳`米粒与废弃鱼皮胶原、壳聚糖复合，经冷冻干燥制成鱼胶原基双重缓释药膜，技术方案如下:
一种鱼胶原基双重缓释药膜的制备方法，采用生物素偶联胆留醇化乙二醇壳聚糖(bio-CHGC)自聚集纳米粒包载抗肿瘤药物，再将其与废弃鱼皮胶原、壳聚糖复合制备，即得鱼胶原基双重缓释药膜。
[0006]具体步骤包括:
1)将胆留醇琥珀酸酯(CHS)溶于体积分数为65-90%的乙醇溶液，在N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与碳二亚胺类活化剂作用下反应4-15 h后，加入乙二醇壳聚糖(GC)水溶液，20-60°C反应24-96 h，即得胆留醇化乙二醇壳聚糖(CHGC);将胆留醇化乙二醇壳聚糖(CHGC)、生物素、N-羟基琥珀酰亚胺与碳二亚胺类活化剂溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，20-60°C反应12-48 h，即得生物素偶联胆留醇化乙二醇壳聚糖，其中，乙二醇壳聚糖(GC)/胆留醇琥珀酸酯(CHS)摩尔比为1:1-20 ;胆甾醇化乙二醇壳聚糖(CHGC)/生物素摩尔比为1:1-20 ；
2)将生物素偶联胆留醇化乙二醇壳聚糖溶于2-25%的乙酸溶液，探头超声、透析12-48h，即得生物素偶联胆留醇化乙二醇壳聚糖自聚集纳米粒；将阿霉素二甲基亚砜溶液缓慢滴至生物素偶联胆留醇化乙二醇壳聚糖纳米粒溶液中，透析6-48h，即得生物素偶联胆甾醇化乙二醇壳聚糖载药纳米粒；所述载药纳米粒中生物素偶联胆留醇化乙二醇壳聚糖与阿霉素的质量比为20-1:1 ；
3)废弃鱼皮去鳞，切碎洗净，于10-30倍原料重的含体积分数为0.1-1% H2O2的NaOH溶液中搅拌浸泡24-48 h，用蒸馏水洗至中性；在异丙醇溶液中搅拌浸泡4 h，蒸馏水洗至中性；在质量分数为2.5%NaCl溶液中搅拌浸泡10 h，过滤，得预处理的碎鱼皮；将碎鱼皮与蒸馏水以料液比为1:5-10混合，加入胃蛋白酶酶解10-30 h，pH 2.0-4.0，过滤、离心，取上清液加入2%乙酸溶液，过滤，蒸馏水中透析24 h，冷冻干燥得鱼皮胶原蛋白；所述NaOH溶液的浓度为0.01-0.1 mol/L，异丙醇溶液的体积分数为5-20% ;胃蛋白酶占鱼皮的质量分数为1_3%，酶解的温度为0-10°C ；
4)将鱼皮胶原蛋白与壳聚糖溶于2%乙酸溶液，蒸馏水透析24h后加入生物素偶联胆甾醇化乙二醇壳聚糖载药纳米粒水溶液，搅拌，冻干后添加交联剂交联，产物经蒸馏水洗至中性，二次冷冻干燥即得鱼胶原基双重缓释药膜；所述药膜胶原蛋白与壳聚糖的质量比为10-1:1 ;胶原/生物素偶联胆留醇化乙二醇壳聚糖的质量比为20-3:1。
所述的胆留醇琥珀酸酯可以用胆酸、脱氧胆酸、5 β-去羟基胆酸、亚油酸、亚麻酸、硬脂酸、十六酸、磺酰脲衍生物中的任一种替换。
[0007]所述的碳二亚胺类活化剂选自:1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC.HCl )、N，N’ -二环己基碳二亚胺(DCC)或N，N’ -二异丙基碳二亚胺(DIC)。
[0008]所述的鱼皮为草鱼、鳙鱼、鲢鱼三种加工鱼皮副产物中一种。
[0009]所述的交联 剂为戊二醛、乙二醛、甲醛、EDC中的任一种，交联时间为2-16 h。
[0010]所述的阿霉素可以用表阿霉素、全反式维甲酸、柔红霉素、紫杉醇、甲氨蝶呤、喜树碱六种抗肿瘤药物中的任一种替换。
[0011]所述透析使用的透析袋的截留分子量为8000-14000 Da。
[0012]所述的制备方法制得的鱼胶原基双重缓释药膜。
[0013]本发明的优点在于:本发明制备的鱼胶原基双重缓释药膜是由具有靶向作用的bio-CHGC载药纳米粒与鱼胶原-壳聚糖复合膜组成，bio-CHGC在水中可自聚集形成纳米粒，并能有效包载疏水性的抗肿瘤药物，对药物具有缓释和靶向作用；胶原-壳聚糖复合膜具有良好的生物相容性、可降解性及一定的缓释作用，因此将bio-CHGC载药纳米粒与胶原复合膜结合制备的鱼胶原基缓释药膜具有双重缓释作用，不仅可减少突释现象，有效杀死肿瘤细胞，降低药物在体内的毒副作用，而且各种原料廉价易得，制备工艺简单方便、条件温和,是一种较好的抗肿瘤药物剂型。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1药膜的场发射扫描电镜图。
【具体实施方式】
[0015]实施例1:一种鱼胶原基双重缓释药膜的制备方法
I)称取GC 130 mg溶于6 mL蒸馏水，72.8 mg CHS溶于65%乙醇溶液20 mL，然后加入38.0 mg EDC与22.9 mg NHS，搅拌10 h，然后缓慢加入到GC溶液中，40°C下搅拌反应24 h后，分别用体积分数80%乙醇溶液、蒸馏水各透析24 h，冷冻干燥即得CHGC ;称取CHGC 0.25g、生物素 0.37 g、EDC 0.20 g、NHS 0.12 g 溶于 30 mL DMSO 溶液，20°C反应 24 h，于蒸馏水中透析48 h，冷冻干燥即得bio-CHGC。
[0016]2)将0.12 g bio-CHGC溶于20%的乙酸溶液，冰浴条件下探头超声2 min，超声功率为80 W，超声5次，于蒸馏水中透析24 h，即得bio-CHGC自聚集纳米粒。将5 mg/mL阿霉素溶液800 μ L缓慢滴加到60 mL纳米粒溶液中(lmg/mL)，避光搅拌，蒸馏水中透析8 h，即得bio-CHGC载药纳米粒。
[0017]3)称取50 g切碎洗净的鲢鱼鱼皮，放于I L 0.01 mol/L NaOH溶液中(含I mLH2O2),4°C搅拌浸泡48 h，用蒸馏水洗至中性；将洗净的碎鱼皮放于300 mL异丙醇(含30 mL异丙醇)溶液中，4°C搅拌浸泡4 h，蒸馏水洗至中性；称取25.6 g NaCl溶于IL水中，将鱼皮浸泡在质量分数为2.5%NaCl溶液中10 h，去除废液(用纱布过滤)，得预处理的碎鱼皮；将上述得到的碎鱼皮与500 mL蒸馏水混合，加入1.5g胃蛋白酶于10°C酶解10 h (pH 2.0)，用纱布过滤，滤液以8000 r/min低温离心20 min，取上清液。在其上清液中加入2%的乙酸溶液，过滤，蒸馏水中透析24 h，冷冻干燥得到鱼皮胶原蛋白。
[0018]4)将0.9 g鱼皮胶原蛋白与0.1g壳聚糖溶于100 mL体积分数为2%的乙酸溶液中，搅拌均匀，蒸馏水中透析24 h后加入上述bio-CHGC载药纳米粒60 mL，搅拌6 h，冷冻干燥后加入100 mL 0.25%戊二醛交联，交联产物反复用蒸馏水冲洗至中性，二次冷冻干燥即得鱼胶原基双重缓释药膜。
[0019]实施例2:—种鱼胶原基双重缓释药膜的制备方法
I)称取GC 130 mg溶于8 mL蒸馏水，72.8 mg CHS溶于75%乙醇溶液20 mL，然后加Λ 38.0 mg EDC与22.9 mg NHS，搅拌10 h，然后缓慢的加入到GC溶液中，40°C搅拌反应72 h后，分别用体积分数80% 乙醇溶液、蒸馏水各透析24 h，冷冻干燥即得CHGC ;称取CHGC
0.25 g、生物素 0.37 g、EDC 0.20 g、NHS 0.12 g 溶于 40 mL DMSO 溶液，40°C反应 24 h，于蒸馏水中透析48 h，冷冻干燥即得bio-CHGC。
[0020]2)将0.12g bio-CHGC溶于20%的乙酸溶液，冰浴条件下探头超声2 min,超声功率为80 W，超声5次，于蒸馏水中透析24 h，即得bio-CHGC自聚集纳米粒。将5 mg/mL阿霉素溶液1.6 mL缓慢滴加到80 mL纳米粒溶液中(lmg/mL)，避光搅拌6 h，于蒸馏水中透析8 h，即得bio-CHGC载药纳米粒。
[0021]3)称取50 g切碎洗净的鲢鱼鱼皮，放于IL 0.01 mol/L NaOH溶液中(含5 mLH202)，4°C搅拌浸泡24 h，用蒸馏水洗至中性；将洗净的碎鱼皮放于300 mL异丙醇(含60mL异丙醇)溶液中，4°C搅拌浸泡4 h，蒸馏水洗至中性；称取25.6 g NaCl溶于I L水中，将鱼皮浸泡在质量分数为2.5%NaCl溶液中10 h，去除废液(用纱布过滤)，得预处理的碎鱼皮；将上述得到的碎鱼皮与500 mL蒸馏水混合，加入1.3 g胃蛋白酶于4°C酶解20 h (pH3.0)，用纱布过滤，滤液以8000 r/min低温离心20 min，取上清液。在其上清液中加入2%的乙酸溶液，过滤，蒸馏水中透析24 h，冷冻干燥得到鱼皮胶原蛋白。
[0022]4)将0.8 g鱼皮胶原蛋白与0.2 g壳聚糖溶于100 mL体积分数为2%的乙酸溶液中，搅拌均匀，蒸馏水中透析24 h后加入上述bio-CHGC载药纳米粒80 mL，搅拌6 h，冷冻干燥后加入100 mL 0.25%戊二醛交联，交联产物反复用蒸馏水冲洗至中性，二次冷冻干燥即得鱼胶原基双重缓释药膜。
[0023]实施例3:鱼胶原基双重缓释药膜的体外释放实验称取一定量的鱼胶原基双重缓释药膜或载药纳米粒放于透析袋中，然后将密封的透析袋完全浸没于10 mL的PBS溶液中(pH 7.4)，在37°〇、110 rpm的条件下避光振荡，于1、3、5 d取出全部的释放介质，并倒入等量体积的新鲜介质，采用紫外-可见分光光度计于480rim处测定其药物的释放量并计算累积释放率(Q%)。其公式如下:
【权利要求】
1.一种鱼胶原基双重缓释药膜的制备方法，其特征在于:采用生物素偶联胆留醇化乙二醇壳聚糖自聚集纳米粒包载抗肿瘤药物，再将其与废弃鱼皮胶原、壳聚糖复合制备，即得鱼胶原基双重缓释药膜。
2.根据权利要求1所述的一种鱼胶原基双重缓释药膜的制备方法，其特征在于:具体步骤包括: 1)将胆留醇琥珀酸酯溶于体积分数为65-90%的乙醇溶液，在N-羟基琥珀酰亚胺与碳二亚胺类活化剂作用下反应4-15 h后，加入乙二醇壳聚糖水溶液，20-60°C反应24-96 h，即得胆留醇化乙二醇壳聚糖；将胆留醇化乙二醇壳聚糖、生物素、N-羟基琥珀酰亚胺与碳二亚胺类活化剂溶解于二甲基亚砜中，20-60°C反应12-48 h，即得生物素偶联胆留醇化乙二醇壳聚糖，其中，乙二醇壳聚糖/胆留醇琥珀酸酯摩尔比为1:1-20 ;胆留醇化乙二醇壳聚糖/生物素摩尔比为I: 1-20 ； 2)将生物素偶联胆留醇化乙二醇壳聚糖溶于2-25%的乙酸溶液，探头超声、透析12-48h，即得生物素偶联胆留醇化乙二醇壳聚糖自聚集纳米粒；将阿霉素二甲基亚砜溶液缓慢滴至生物素偶联胆留醇化乙二醇壳聚糖纳米粒溶液中，透析6-48h，即得生物素偶联胆甾醇化乙二醇壳聚糖载药纳米粒；所述载药纳米粒中生物素偶联胆留醇化乙二醇壳聚糖与阿霉素的质量比为20-1:1 ； 3)废弃鱼皮去鳞，切碎洗净，于10-30倍原料重的含体积分数为0.1-1% H2O2的NaOH溶液中搅拌浸泡24-48 h，用蒸馏水洗至中性；在异丙醇溶液中搅拌浸泡4 h，蒸馏水洗至中性；在质量分数为2.5%NaCl溶液中搅拌浸泡10 h，过滤，得预处理的碎鱼皮；将碎鱼皮与蒸馏水以料液比为1:5-10混合，加入胃蛋白酶酶解10-30 h，pH 2.0-4.0，过滤、离心，取上清液加入2%乙酸溶液，过滤 ，蒸馏水中透析24 h，冷冻干燥得鱼皮胶原蛋白；所述NaOH溶液的浓度为0.01-0.1 mol/L，异丙醇溶液的体积分数为5-20% ;胃蛋白酶占鱼皮的质量分数为1_3%，酶解的温度为0-10°C ； 4)将鱼皮胶原蛋白与壳聚糖溶于2%乙酸溶液，蒸馏水透析24h后加入生物素偶联胆甾醇化乙二醇壳聚糖载药纳米粒水溶液，搅拌，冻干后添加交联剂交联，产物经蒸馏水洗至中性，二次冷冻干燥即得鱼胶原基双重缓释药膜；所述药膜胶原蛋白与壳聚糖的质量比为10-1:1 ;胶原/生物素偶联胆留醇化乙二醇壳聚糖的质量比为20-3:1。
3.根据权利要求1所述的一种鱼胶原基双重缓释药膜的制备方法，其特征在于:所述的胆留醇琥珀酸酯可以用胆酸、脱氧胆酸、5 β-去羟基胆酸、亚油酸、亚麻酸、硬脂酸、十六酸、磺酰脲衍生物中的任一种替换。
4.根据权利要求1所述的一种鱼胶原基双重缓释药膜的制备方法，其特征在于:所述的碳二亚胺类活化剂选自:1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N，N’-二环己基碳二亚胺或N，N’ - 二异丙基碳二亚胺。
5.根据权利要求1所述的一种鱼胶原基双重缓释药膜的制备方法，其特征在于:所述的鱼皮为草鱼、鳙鱼、鲢鱼三种加工鱼皮副产物中一种。
6.根据权利要求1所述的一种鱼胶原基双重缓释药膜的制备方法，其特征在于:所述的交联剂为戊二醛、乙二醛、甲醛、EDC中的任一种，交联时间为2-16 h。
7.根据权利要求1所述的一种鱼胶原基双重缓释药膜的制备方法，其特征在于:所述的阿霉素可以用表阿霉素、全反式维甲酸、柔红霉素、紫杉醇、甲氨蝶呤、喜树碱六种抗肿瘤药物中的任一种替换。
8.根据权利要求1所述的一种鱼胶原基双重缓释药膜的制备方法，其特征在于:所述透析使用的透析袋的截留分子量为8000-14000 Da。
9.一种如权利要求1所述的制备方法制得的鱼胶原基双重缓释药膜。
【文档编号】A61P35/00GK103705936SQ201410019847
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2014年1月17日 优先权日:2014年1月17日
【发明者】张其清, 陈名懋, 郭豪, 黄玉清, 王建华, 方哲翔 申请人:福州大学