全反式维甲酸在视网膜血管生成疾病的药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及制药领域，特别涉及全反式维甲酸在视网膜血管生成疾病的药物中的应用。本发明通过动物实验和临床试验，结果证实全反式维甲酸能调节视网膜血管生成，调节VEGF生成。本发明证实全反式维甲酸具有调节视网膜血管生成的新用途，可用于制备预防和治疗视网膜血管生成的药物中。
【专利说明】全反式维甲酸在视网膜血管生成疾病的药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于制药领域，特别涉及全反式维甲酸在视网膜血管生成疾病的药物中的 应用。
【背景技术】
[0002] 视网膜新生血管是早产儿视网膜病变（retinopathy of prematurity, R0P)、糖尿 病性视网膜病变（diabetic retinopathy)、年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration，AMD)等多种眼部血管性疾病的病理基础，新生血管异常引起的视网膜病变 往往会对视力造成不可逆的损害，甚至致盲。新生血管的生成是很多细胞因子和细胞之间 相互作用、相互调节的结果，血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF)是血管形成过程中最重要的一类细胞因子，能特异性地促进血管内皮细胞分裂、增殖 及迁移，并能增加血管通透性。
[0003] 目前有效的治疗视网膜血管生成的药物还非常少，抑制新生血管的药如：贝伐单 抗（Bevacizumab/Avastin)、兰妮单抗（Ranibizumab/Lucentis)作为玻璃体内注射剂，虽 然有一定疗效，但价格昂贵，并且这些药都是重组抗人VEGF单克隆抗体，会使VEGF的正常 生理功能发生紊乱。目前在抑制血管萎缩、退化方面研究较多的基因疗法、蛋白质疗法(如 VEGF或FGF-1)、细胞疗法，尽管前景很令人着迷但还存在很多亟待解决的问题。所以，眼科 工作者一直在寻找更安全有效的预防和治疗视网膜血管生成的药物和方法。
[0004] 维甲酸（retinoic acid,RA)是脂溶性的维生素 A (retinol)的衍生物，RA包括全 反式维甲酸（all-trans Retinoic Acid , atRA)、9_顺式维甲酸（9_cis Retinoic Acid， 9-cRA)、13-顺式维甲酸等多种异构体。它们主要与核RA受体结合后发挥作用，RA在调节 细胞的生长、发育、增殖、分化、代谢及诱导肿瘤细胞凋亡方面发挥重要的作用。
[0005] 目前，atRA在临床上已广泛用于多种恶性肿瘤如：淋巴瘤、白血病、胃癌、神经母 细胞瘤等的预防和治疗。关于全反式维甲酸在视网膜血管生成疾病的药物中的应用未见报 道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供全反式维甲酸的新用途，特别是全反式维甲酸在视网膜血 管生成疾病的药物中的应用。
[0007] 全反式维甲酸在视网膜血管生成疾病的药物中的应用。
[0008] 所述全反式维甲酸通过调节血管内皮生长因子VEGF的生成，达到在预防、调节、 治疗视网膜血管的生成及抑制视网膜血管通透性增高和视网膜正常血管萎缩、退化的药物 中的应用。
[0009] 全反式维甲酸调节血管内皮生长因子VEGF的生成，测定小鼠视网膜VEGF mRNA的 PCR引物对，由两条单链DNA组成，所述两条单链DNA是序列表中序列1所示的单链DNA和 序列表中序列2所示的单链DNA。
[0010] 本发明应用高氧诱导的视网膜病变小鼠模型即〇IR模型，经过腹腔注射atRA后， 利用real-time PCR检测视网膜中VEGF mRNA的表达变化。应用Western blot分析视网 膜中VEGF蛋白的表达。通过视网膜整铺片观察小鼠视网膜中血管的形态变化，通过小鼠左 心室注射FITC-dextan和Hochest33342实验检测小鼠视网膜血管的渗透性变化。以出生 体重低于2000 g的早产儿和低体重儿为对象，进行眼底病变筛查；符合筛查标准的早产儿 进行口服atRA的干预治疗。
[0011] 本发明的有益效果在于：提供了全反式维甲酸在视网膜血管生成疾病的药物中的 新用途，atRA可以通过调节VEGF的生成影响视网膜血管形成，抑制低氧诱导的视网膜新生 血管形成并抑制视网膜血管通透性增高，atRA可以抑制高氧状态下视网膜正常血管的萎 缩和退化并促进血管的正常生长，atRA可应用于预防、调节和治疗视网膜血管生成的药物 中。
【专利附图】
【附图说明】
[0012] 图1为0IR模型中相对低氧阶段空气对照组小鼠在P17天视网膜血管。
[0013] 图2为0IR模型中相对低氧阶段空气atRA组小鼠在P17天视网膜血管。
[0014] 图3为0IR模型中相对低氧阶段02组小鼠在P17天视网膜血管。
[0015] 图4为0IR模型中相对低氧阶段atRA 02组小鼠在P17天视网膜血管。
[0016] 图5为0IR模型中相对低氧阶段02组小鼠在P17天视网膜血管及中心无血管区。
[0017] 图6为0IR模型中相对低氧阶段atRA 02组小鼠在P17天视网膜血管及中心无血 管区。
[0018] 图7为0IR模型中相对低氧阶段02组小鼠和atRA 02组小鼠在P17天视网膜中心 无血管区V0的面积的百分率，* *表示atRA 02组与02组无血管区相比显著性P〈0. 001。
[0019] 图8为0IR模型中相对低氧阶段02组小鼠在P17天视网膜血管及新生血管NV。
[0020] 图9为0IR模型中相对低氧阶段atRA 02组小鼠在P17天视网膜及新生血管NV。
[0021] 图10为0IR模型中相对低氧阶段02组小鼠和atRA 02组小鼠在P17天视网膜新 生血管NV的面积的百分比，**表示atRA 02组与02组新生血管面积相比显著性P〈0. 001。
[0022] 图11为0IR模型中相对低氧阶段空气对照组小鼠、空气atRA组小鼠、02组小鼠和 atRA 02组小鼠在P17天视网膜VEGF mRNA的表达变化，*表示02组和atRA 02组与空气对 照组相比显著性P〈〇. 05, #表示atRA 02组与02组相比显著性P〈0. 05。
[0023] 图12为Western Blot实验的显色结果。
[0024] 图13为0IR模型中相对低氧阶段空气对照组小鼠、空气atRA组小鼠、02组小鼠和 atRA 02组小鼠在P17天视网膜蛋白的表达变化，*表示02组和atRA 02组与空气对照组相 比显著性P〈〇. 05, #表示atRA 02组与02组相比显著性P〈0. 05。
[0025] 图14为0IR模型中相对低氧阶段空气对照组小鼠在P17天视网膜血管的渗透性。
[0026] 图15为0IR模型中相对低氧阶段空气atRA组小鼠在P17天视网膜血管的渗透性。
[0027] 图16为0IR模型中相对低氧阶段02组小鼠在P17天视网膜血管的渗透性。
[0028] 图17为0IR模型中相对低氧阶段atRA 02组小鼠在P17天视网膜血管的渗透性。
[0029] 图18为0IR模型中相对低氧阶段空气对照组小鼠、空气atRA组小鼠、02组小鼠和 atRA 02组小鼠在P17天视网膜血管渗透性的变化，*表示atRA 02组与空气对照组相比显 著性P〈0. 05, * *表示02组与空气对照组组相比显著性P〈0. 001，##表示atRA 02组与02 组相比显著性P〈〇. 001。
[0030] 图19为0IR模型中相对高氧阶段空气对照组小鼠在P12天视网膜血管。
[0031] 图20为0IR模型中相对高氧阶段空气atRA组小鼠在P12天视网膜血管。
[0032] 图21为0IR模型中相对高氧阶段02组小鼠在P12天视网膜血管。
[0033] 图22为0IR模型中相对高氧阶段atRA 02组小鼠在P12天视网膜血管。
[0034] 图23为0IR模型中相对高氧阶段02组小鼠在P12天视网膜血管中心无血管区V0。
[0035] 图24为0IR模型中相对高氧阶段atRA 02组小鼠在P12天视网膜血管中心无血 管区V0。
[0036] 图25为0IR模型中相对高氧阶段02组小鼠和atRA 02组小鼠在P12天视网膜血 管中心无血管区V0的面积的百分率，*表示atRA 02组与02组相比显著性P〈0. 05。
[0037] 图26为0IR模型中相对高氧阶段空气对照组小鼠、空气atRA组小鼠、02组小鼠 和atRA 02组小鼠在P12天视网膜VEGF mRNA的表达变化，*表示02组和atRA 02组与空气 对照组相比显著性P〈〇. 05, #表示atRA 02组与02组相比显著性P〈0. 05。
[0038] 图27为Western Blot实验的显色结果。
[0039] 图28为0IR模型中相对高氧阶段空气对照组小鼠、空气atRA组小鼠、02组小鼠和 atRA 02组小鼠在P12天视网膜血管蛋白的表达变化，*表示02组和atRA 02组与空气对照 组相比显著性P〈〇. 05, #表示atRA 02组与02组相比显著性P〈0. 05。
【具体实施方式】
[0040] 实施例1 atRA抑制0IR模型中低氧诱导的新生血管的生成。
[0041] 利用高氧诱导的视网膜病变小鼠模型即0IR模型评价atRA对视网膜新生血管生 成的作用。0IR模型是视网膜新生血管研究中应用最广泛的一种动物模型。其生理病理过 程主要包含两个阶段：（1)高氧阶段视网膜中心血管萎缩和退化，正常发育的视网膜血管 停止生长，已形成的视网膜血管闭塞或消失，在视网膜中心向周边延伸形成无血管区（the zone of vaso-obliteration，V0)。（2)低氧阶段的视网膜血管异常增生，出现大量形态和 功能上异常的新生血管（neovascularization，NV)。
[0042] 高氧诱导的视网膜病变小鼠模型在相对低氧阶段形成新生血管NV。
[0043] 将体重约3g的C57BL/6J新生小鼠随机分为4组，每1组8只，各组动物间的体重 均无统计学意义上的差异。以下为4组动物的处理方案。
[0044] (1)空气对照组（air):空气组小鼠与母鼠一起饲养在正常氧环境中；小鼠于出生 后6d (P6)开始腹腔注射玉米油，用量为20μ Ι/g鼠体重/日，连续注射4d(P9);于P17脱 颈处死小鼠，取视网膜进行试验。
[0045] (2)空气atRA组（atRA air):空气atRA组小鼠与母鼠一起饲养在正常氧环境中； 小鼠于出生后6d (P6)开始腹腔注射atRA，atRA为sigma公司的货号为R2625的试剂，玉 米油溶解atRA至atRA浓度为0. 05 μ g/ μ 1，atRA的用量为1 μ g/g鼠体重/日，atRA在该 用量上显示出最大药效，连续注射4d (P9);于P17脱颈处死小鼠，取视网膜进行试验。
[0046] (3)高氧对照组（02):高氧对照组小鼠与母鼠一起饲养在正常氧环境中；小鼠于出 生后7d(P7)与母鼠共置于氧浓度为75%的密闭氧箱饲养5d ;且该组小鼠出生后6d(P6)开 始腹腔注射玉米油，用量为20μ Ι/g鼠体重/日，连续注射4d(P9);于出生后12d(P12)取出 小鼠，取出后与母鼠一起饲养在正常氧环境中；于P17脱颈处死小鼠，取视网膜进行试验。
[0047] (4)高氧atRA组（atRA 02):高氧atRA组小鼠与母鼠一起饲养在正常氧环境中； 高氧atRA组小鼠于出生后7d(P7)与母鼠共置于氧浓度为75%的密闭氧箱饲养5d ;且该组 小鼠于出生后6d (P6)进行腹腔注射atRA，atRA使用sigma公司购买的试剂，货号为R2625， atRA的用量为lyg/g鼠体重/日，连续注射4d(P9);于出生后12d(P12)取出小鼠，取出后 与母鼠一起饲养在正常氧环境中；于P17脱颈处死小鼠，取视网膜进行试验。
[0048] 于P17脱颈处死各组小鼠（n=8)，摘除小鼠眼球，并分离视网膜。右眼用于视网膜 整铺片Isolectin IB4荧光染色，观察低氧诱导的小鼠视网膜新生血管的形态变化，计算 NV% 和 V0%。对应左眼用于 Real time PCR 和 Western blot 实验。应用 Real-time PCR 检测在不同处理方案下小鼠视网膜中VEGF mRNA的表达变化；应用Western blot实验分 析各组视网膜中 VEGF 蛋白的表达。Isolectin IB4 (Isolectin GS-IB4 from Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor? 594 conjugate)试剂为 Invitrogen 公司购买，货号为 121413。SYBR Rremix Ex Taq II (Tli RnaseH Plus)Kit 试剂为 Takara 公司购买，进行 Real time PCR实验。羊抗鼠 VEGF多克隆抗体为Santa cruz biotechnology公司购买，货 号为 sc-7269,进行 Western blot 实验。
[0049] NV百分比的评价： 取各组P17小鼠右眼，制作成视网膜平铺片，视网膜血管染色使用Isolectin IB4进 行。运用激光共聚焦显微镜（Nikon CISi)拍摄视网膜血管图像，图像解析（NIH ImageJ) 测定新生血管区NV的面积，用新生血管区NV的面积除以整个视网膜的面积计算得NV百分 比。
[0050] V0百分比的评价： 取各组P17小鼠右眼，制作视网膜平铺片，视网膜血管染色使用Isolectin IB4进行。 运用激光共聚焦显微镜（Nikon CISi)拍摄视网膜血管图像，用图像解析（NIH ImageJ)测定 无血管区V0的面积，用无血管区V0的面积除以整个视网膜的面积计算V0百分比。
[0051] Real-time PCR 检测实验： 在NCBI网站查询小鼠 GAPDH和VEGFA序列，使用Primer5. 0设计引物如下。
[0052] 分离P17 小鼠左眼视网膜，使用 Ε· Ζ· N. A. ? MicroElute? Total RNA kit (Omega, USA, R6831-01)试剂盒按说明书提取总 RNA,利用 PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser (Takara, Japan)试剂将 RNA 反转录成 cDNA，使用 SYBR Rremix Ex Taq II (Tli RnaseH Plus) Kit (Takara, Japan)试剂盒按操作说明进行 Real-time PCR 试验， 以视网膜总cDNA为模板，使用下列引物扩增目标序列，同时将GAPDH作为内参进行扩增，在 ABI 7300仪器（Applied Biosystems, USA)上运行程序，得出结果，通过2_ Gt方法计算目 标基因改变倍数。
[0053] 设计并合成引物如下：
【权利要求】
1. 全反式维甲酸在视网膜血管生成疾病的药物中的应用。
2. 如权利要求1所述的全反式维甲酸在视网膜血管生成疾病的药物中的应用，其特征 在于：所述全反式维甲酸通过调节血管内皮生长因子VEGF的生成，达到在预防、调节、治疗 视网膜血管的生成及抑制视网膜血管通透性增高和视网膜正常血管萎缩、退化的药物中的 应用。
3. 如权利要求2所述的全反式维甲酸在视网膜血管生成疾病的药物中的应用，全反式 维甲酸调节血管内皮生长因子VEGF的生成，测定小鼠视网膜VEGF mRNA的PCR引物对，由 两条单链DNA组成，其特征在于：所述两条单链DNA是序列表中序列1所示的单链DNA和序 列表中序列2所示的单链DNA。
【文档编号】A61K31/203GK104116727SQ201410149933
【公开日】2014年10月29日 申请日期:2014年4月15日 优先权日:2014年4月15日
【发明者】王丽娅, 阎琦, 史平玲, 许中中, 李晶, 张俊杰, 王志立, 谢艳婷 申请人:河南省眼科研究所