林蛙提取冻干粉及其在制备治疗痤疮的药物及化妆品中的应用的制作方法
【专利摘要】一种林蛙提取冻干粉及其在制备治疗痤疮的药物及化妆品中的用途，属于生物制药【技术领域】。是将林蛙干除杂除尘后粉碎，再加入复合酶水解液，取离心后的上层上清液；将剩余混合物研磨后剪切，喷雾干燥成粉末状，将该超微粉加入到醋酸中超声后纱网过滤，离心后取上清液减压浓缩；从而得到多糖、抗菌肽和钙离子的混合物；将上述物质混合得到林蛙提取混合液，经预冻、升华、解吸、后处理得到林蛙提取冻干粉。冻干粉是纯生物制剂，无任何副作用，所含短肽胶原蛋白在多糖的作用下可更好的进入正常细胞，给予细胞充足营养，并可修复受损细胞；抗菌肽可结合钙离子，增强其对细菌细胞壁的破坏，并进入细菌细胞达到抑菌效果。
【专利说明】林蛙提取冻干粉及其在制备治疗痤疮的药物及化妆品中的 应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物制药【技术领域】，具体涉及一种林蛙提取冻干粉及其在制备治疗痤 疮的药物及化妆品中的用途。
【背景技术】
[0002] 痤疮是好发于毛囊皮脂腺的慢性炎症性疾病，好发于颜面、胸背，以粉刺、丘疹、脓 疤、结节、囊肿及疤痕为特征，常伴皮脂溢出。多发于青年男女，又被称为"青春痘"，古代称 面疮、酒刺、肺风等。但随着生活压力加大和综合因素的影响，痤疮的发病年龄有提高的趋 势。病情缠绵难愈且留下瘫痕，不仅影响美观，还给患者带来严重的精神负担，影响工作和 社交活动。
[0003] 目前，国内对林蛙皮抗菌肽进行了研究，申报的专利也在增多，以林蛙为关键 词，检索国内外专利，没有查到国外关于林蛙的专利，国内专利中CN1216768A "生物抗菌 肽及其制备方法"是涉及一种具有广谱抗菌活性的林蛙蛙皮生物抗菌肽及其制备方法； CN1583166A "林蛙抗菌肽喷雾剂及其制备方法"、CN1583165A "林蛙抗菌肽凝胶剂及其制备 方法"是涉及保护林蛙皮肤抗菌肽以喷雾剂和凝胶剂两种形式用于临床皮肤感染、烧伤烫 伤感染领域；CN1679632A "林蛙镇痛水提物及其制备方法及其制备方法"是关于保护从林蛙 皮中提取的一种具有镇痛作用的林蛙镇痛水提物及其制备技术。均是以林蛙皮为原料，提 取了林蛙皮抗菌肽。CN103073628A-种利用超声波从林蛙体中提取抗菌肽的生产制备方法 是以林蛙体为原料采用超声提取抗菌肽，提取的抗菌肽是分子量为4KDa最适pH值为3. 5， 等电点pi值为8. 0 - 10. 5的碱性多肽。以上专利均以抗菌肽为保护内容，申请保护其在 抗菌方面的作用，所述抗菌是指抵抗细菌和真菌，包括大肠杆菌、绿脓杆菌等革兰氏阴性菌 和金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌及临床耐药菌克雷伯杆菌、鲍曼不动杆菌、白色念珠菌、 酵母菌的一种或多种；并且抗菌治疗途径均为外用给药。CN103432058A "林蛙胶原蛋白液 及其制备工艺"是以林蛙皮提取物、西洋参皂甙、五味子浸出液、芦荟提取物和水配制而成； CN102492760A "一种利用复合酶生产活性东北林蛙胶原蛋白低聚肽的方法"是以干东北林 蛙皮为原料；CN102229972A "制备林蛙皮胶原蛋白肽的方法"是以林蛙皮为原料，以上三个 专利均是以林蛙皮为原料或主要原料提取林蛙皮中所含的胶原蛋白。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的之一是提供一种林蛙提取冻干粉。
[0005] 本发明所述林蛙提取冻干粉含有短肽胶原蛋白、多糖、抗菌肽、钙离子，是按照下 述步骤制备得到的：
[0006] (1)将林蛙干（林蛙干为除脂除卵的林蛙干体）除杂除尘后依次经20?100目 粉碎，使林蛙干粉碎物的粒径在500 μ m以下，按照lg : 1?10mL的比例加入复合酶水解液， 复合酶水解液中含木瓜蛋白酶1?5wt%、胰蛋白酶2?4wt%，风味蛋白酶1?3wt% ;在 50?55°C下酶解1?2h，酶解pH为7. 0?7. 5,而后在85?90°C、5?15min灭酶；再将 混合物在10?30°C离心，离心时间为1?5min，离心转速为2000?4000rpm，取离心后混 合液体积20?40%的上层上清液，此时上层上清液中含有林蛙干短肽胶原蛋白（由于离心 力的作用，短链胶原蛋白将集中在上层上清液中，长链蛋白分子将会集中在混合液的中下 层剩余混合物中），其分子量为2?3KDa，等电点pi值为7. 5?7. 8,其中碱性氨基酸（精 氨酸、赖氨酸、组氨酸）占上层上清液的11. 04?12. 89% (质量比），酸性氨基酸（天冬氨 酸、谷氨酸）占上层上清液的17. 99?19. 13% (质量比）。
[0007] (2)将上述取上层上清液后的剩余混合物（原体积的60?80% )放入胶体磨， 研磨2?15min，使混合物的平均粒径在300 μ m以下；将混合物放入高剪切分散乳化机内， 剪切1?15min，使混合物平均粒径在100?200 μ m之间；再将混合物进行喷雾干燥成粉 末状，此时得到林蛙干提取短肽胶原蛋白后的剩余纤维、骨质等物质的超微粉；将纤维、骨 质等物质的超微粉加入到质量浓度为2?10%醋酸中超声，醋酸与超微粉的体积质量比为 10?40mL :lg，超声时间为5?75min，超声温度为4?30°C ;经150μπι纱网过滤，纱网上 面未过滤物质再加入质量体积比为lg: 1?8mL、浓度为0. 01?0. 03mol/L的氢氧化钠，进 行微波提取，微波功率为500?600W，微波提取时间为3?9min，再次经150 μ m纱网过滤； 合并两次滤液，30?50°C搅拌10?30min，搅拌速度为100?200rpm ;将搅拌后的滤液离 心，离心温度为4?30°C，离心时间为2?40min，离心转速为2000?15000rpm ;取上清液 减压浓缩，压力为600?700托，温度为65?70°C，浓缩体积比为8?40 :1 ;从而得到多糖、 抗菌肽和钙离子的混合物；其中多糖的分子量为1?5KDa ;抗菌肽的分子量为1?3KDa，其 等电点pi值为7. 5?8.0,且其中碱性氨基酸（精氨酸、赖氨酸、组氨酸）占多糖、抗菌肽和 钙离子的混合物的11. 28?13. 05% (质量比），酸性氨基酸（天冬氨酸、谷氨酸）占多糖、 抗菌肽和钙离子的混合物的10. 01?11. 47% (质量比）；
[0008] (3)将步骤（1)得到的短肽胶原蛋白和步骤（2)得到的多糖、抗菌肽、钙离子混合， 得到林蛙提取混合液；将上述林蛙提取混合液经过预冻、升华、解吸、后处理得到林蛙提取 冻干粉。
[0009] 预冻温度为-42?-48°C，预冻时间为150?180min ;升华为多温度段升华过程， 即在温度-35?-40°C，压力600?700托下维持150?240min ;在温度-30'-35°C，压力 600?700托下维持180?240min ;在温度-25?-30°C，压力500?600托下维持180? 240min ;在温度-20?-25°C，压力500?600托下维持150?180min ;在温度-15?-20°C， 压力450?500托下维持150?180min ;在温度-10?-15 °C，压力400?450托下维 持180?240min ;在温度-5?-10°C，压力300?400托下维持120?150min ;在温度 0?-5°C，压力300?400托下维持120?150min ;在温度0?5°C，压力400?500托下 维持150?180min ;解吸为多温度段解吸过程，即在温度5?10°C，压力400?500托下维 持240?300min ;在温度10?15°C，压力500?600托下维持180?240min ;在温度15? 20°C，压力600?700托下维持180?240min，从而得到林蛙提取冻干粉。
[0010] 所述的林蛙提取冻干粉可以与药学上可接受的载体或赋形剂形成药物制剂，所述 制剂可以为喷雾剂、气雾剂、霜剂、软膏剂、凝胶剂或湿巾等外用剂型；或为口服液、颗粒剂、 混悬液、乳剂等口服剂型。
[0011] 所述林蛙提取冻干粉可以与化妆品上可接受的载体或赋形剂形成相关化妆品，所 述化妆品可以为洗面奶、化妆水、洁肤水、平衡水、乳液、面霜、面膜、浴液等日化产品。
[0012] 本发明的目的之二是提供一种治疗痤疮的林蛙提取凝胶剂，按重量份计算，其原 料为：林蛙提取冻干粉3?8份，丙二醇5?15份，卡波姆0. 2?1. 5份，聚氧乙烯氢化蓖 麻油5?15份，亚硫酸氢钠0. 1?1份，乙二胺四乙酸二钠0. 1?1份，尼泊金0. 1?1份， 氮酮0. 2?1. 5份，三乙醇胺0. 1?1份；且由如下步骤制备得到：无菌条件下将亚硫酸氢 钠、乙二胺四乙酸二钠溶解于超纯水中，超纯水与亚硫酸氢钠、乙二胺四乙酸二钠的体积质 量比为5?15mL :lg，30?50°C下搅拌10?30min，搅拌速度为100?200rpm，搅拌过程 中加入卡波姆，从而得到溶胀均匀的卡波姆溶胀液；取林蛙提取冻干粉搅拌溶解于超纯水 中，超纯水与林蛙提取冻干粉的体积质量比为5?10mL :lg，再加入丙二醇、聚氧乙烯氢化 菌麻油、氮酮、尼泊金搅拌，搅拌温度30?60°C，搅拌时间15?40min，搅拌速度为100? 300rpm，然后将此混合溶液加入到卡波姆溶胀液中，20?50°C下搅拌10?40min，搅拌速度 为150?300rpm，搅拌过程中加入三乙醇胺；最后勻质4?7次，使粒径在100 μ m以下，从 而得到无色透明的林蛙提取凝胶剂。用法用量：外用，每日早晚两次患部涂敷，〇. 5?lmL/ 次，7天为1疗程。
[0013] 本发明的目的之三是提供一种治疗痤疮的林蛙提取乳液，按重量份计算，其原料 为林蛙提取冻干粉3?8份，硬脂酸2?10份，十八醇2?10份，十六醇3?8份，白油 2?6份，Twenn-601?3份，羊毛脂1?3份，橄榄油1?5份，甘油5?15份，三乙醇胺 0. 1?2份，茉莉香精0. 1?2份，布罗波尔0. 01?1份，尼泊金丙酯0. 1?2份；且由如 下步骤制备得到：
[0014] (1)将硬脂酸，十八醇，十六醇，白油，Twenn-60,羊毛脂，橄榄油混合，20?50°C下 搅拌15?35min，搅拌速度为150-300rpm，形成油相；
[0015] (2)将林蛙提取冻干粉与甘油，三乙醇胺，超纯水充分混合，20?40°C下搅拌10? 25min，搅拌速度为300?500rpm，形成水相；
[0016] (3)将油相与水相在20?40°C下混合搅拌，搅拌时间5?20min，加入茉莉香精， 布罗波尔，尼泊金丙酯，再次搅拌，搅拌温度20?40°C，搅拌时间10?30min，搅拌速度为 200?400rpm，经纳米勻质机3?8次，得到林娃提取乳液。
[0017] 本发明的目的之四是提供一种治疗痤疮的林蛙提取面膜，按重量份计算，其原料 为林蛙提取冻干粉3?8份，甘油4?8份，1，3- 丁二醇2?10份，透明质酸0. 05?1份， 熊果苷1?5份，卡波树脂0. 1?1. 5份，泛醇0. 1?2份，维生素 C脂质体2?6份，三 乙醇胺〇. 1?2份，聚乙二醇-60氢化蓖麻油0. 1?1份，尼泊金丙酯0. 1?2份，茉莉香 精0. 1?1份；且由如下步骤制备得到：将林蛙提取冻干粉，甘油，1，3-丁二醇，透明质酸， 熊果苷，卡波树脂，泛醇，维生素 C脂质体，三乙醇胺，聚乙二醇-60氢化蓖麻油，尼泊金丙 酯，茉莉香精与超纯水混合，搅拌，搅拌温度20?60°C，搅拌时间10?40min，搅拌速度为 300?500rpm，110?120°C灭菌10?20min ;自然后冷却至室温后加入到放有无菌无纺布 (15cmX 15cm)独立包装袋内，密封即得。
[0018] 本发明的目的之五是提供一种治疗痤疮的林蛙提取冻干粉口服剂，按重量份计 算，其原料为以20?65份林娃干按照上面方法提取的林娃提取混合液，朽 1檬酸5?10份， 甜菊糖苷5?30份，安赛蜜5?25份，黄原胶5?10份，山梨酸钾5?10份，醋酸锌1? 5份，β -环糊精5?10份；且由如下步骤制备得到：
[0019] (1)减压浓缩：将林蛙提取混合液在减压条件下进行蒸馏，压力在8X 103?3X 104 帕，温度为50?85°C，浓缩比为1?5:1，得浓缩液；
[0020] (2)将研细的醋酸锌缓慢加入浓缩液中，边加边搅拌；加完后用0· lmol/L的NaOH 调节pH为6. 2?6. 5,搅拌均匀后使其自然沉降，自然冷却过夜；
[0021] (3)0. 45 μ m滤膜过滤，得澄清液体后，加入用柠檬酸、甜菊糖苷、安赛蜜，50? 65°C、100?200rpm下搅拌10?25min，过滤；然后向清液中加入黄原胶、山梨酸钾、β -环 糊精，再经〇. 22 μ m滤膜精滤；
[0022] (4)冷冻干燥得林蛙提取冻干粉口服剂。
[0023] 用法用量：内服，每日早晚两次口服，20mg/次，可溶解于饮用水、牛奶、豆浆等液 体食物中，7天为1疗程。
[0024] 本发明的积极效果在于：林蛙提取冻干粉是纯生物制剂，无任何副作用，所含短肽 胶原蛋白在多糖的作用下可更好的进入正常细胞，给予细胞充足营养，并可修复受损细胞； 抗菌肽可结合钙离子，增强其对细菌细胞壁的破坏，并进入细菌细胞达到抑菌效果。本发明 对皮肤粘膜无刺激、杀菌速度快、使用简便、无色无味，适合不同年龄人群使用。
【专利附图】
【附图说明】
[0025] 图1 :林蛙提取混合液中上层上清液中所含短链胶原蛋白凝胶电泳图。
[0026] 采用Tricine电泳法测短肽胶原蛋白分子量，以索莱宝公司的超低分子量蛋白质 marker作为标准，得出所含短肽胶原蛋白分子量约为2?3KDa。
[0027] 图中左侧为标准的marker，即标准分子量蛋白质的电泳图，由左向右依次为实施 例一中林蛙提取混合液中上层上清液中所含短链胶原蛋白凝胶电泳图；实施例二中林蛙提 取混合液中上层上清液中所含短链胶原蛋白凝胶电泳图；实施例三中林蛙提取混合液中上 层上清液中所含短链胶原蛋白凝胶电泳图；实施例四中林蛙提取混合液中上层上清液中所 含短链胶原蛋白凝胶电泳图；实施例五中林蛙提取混合液中上层上清液中所含短链胶原蛋 白凝胶电泳图。
[0028] 图2 :多糖分子量标准曲线。
[0029] 以标准葡聚糖T1 (分子量1000)、T3 (分子量3000)、T5 (分子量5000)、T10 (分子量 10000)，蓝葡聚糖（分子量2000000)为标准品，经S印hadex G-25凝胶柱（100cmX1.5cm) 以超纯水洗脱，流速为1. 2mL/min，254nm检测多糖分子量分布，计算出每种标准葡聚糖糖 峰洗脱体积。以分子量为200万的蓝葡聚糖和葡萄糖作为标准糖来确定层析柱的外水体积 Vo和总体积Vt，Ve为总体积减去外水体积。以Ve/Vt为横坐标，lg(Mw)为纵坐标作标准曲 线，计算多糖分子量的公式为：
[0030] Lg(Mw) = - K2)Ve/Vt
[0031] Mw :多糖分子量
[0032] Ve :待测样品的糖峰洗脱体积；
[0033] Vo :分子筛排阻层析柱的外水体积；
[0034] Vt :分子筛排阻层析柱的总体积；
[0035] 1^、1(2为常数。
[0036] 以蓝葡聚糖和不同分子量葡萄糖标准制作得出多糖分子量标准曲线；
[0037] 图3 :林蛙提取混合液所含多糖经S印hadex G-25凝胶柱层析得到的洗脱曲线。
[0038] 采用凝胶层析制备方法检测，用S印hadex G-25凝胶柱层析254nm下紫外检测 仪测定林蛙提取混合液洗脱曲线，得出洗脱体积Ve。将洗脱体积Ve带入公式lg(Mw)= (I -K2)Ve/Vt，根据标准葡聚糖曲线（图2所示曲线），算出林蛙提取混合液所含多糖分子 量Mw约为1?5Kda。
[0039] 图4 :混合多糖标准RP-HPLC分析图谱。
[0040] 采用高效液相色谱法测定绘制单糖标准曲线，称取多糖标准样品，加入lmL无水 盐酸-甲醇，充N2封管后，100°C水解16h后吹干液体。甲醇解后的多糖标准样品经干燥后， 加入2mol/L三氟乙酸2mL，120°C充N2封管水解3h，水解产物倒入蒸发皿中，加入适量无水 乙醇45°C水浴蒸除三氟乙酸。PMP柱前衍生化及其处理，取0. 5mL PMP试剂和0. 5mL0. 3mol/ L的NaOH溶液于蒸发皿中，将干燥物溶解后取其中的0. 1 mL于小离心管中，7 0 °C水浴 30min。进行高效液相检测。
[0041] 高效液相色谱分析条件
[0042] 仪器：Shimadzu LC-14ATvp液相色谱仪，附SPD-10AVD紫外检测器
[0043] 色谱柱：DIKMA Inertsil 0DS-3ym(150X4. 6mm)
[0044] 检测温度：35 °C
[0045] 检测波长：245nm
[0046] 洗脱液：82% PBS (0· 1M，ρΗ7· 0)，18% Acetonitrile (v/v)
[0047] 流速：1. OmL/min
[0048] 图5 :林蛙提取液所含多糖组分的RP-HPLC分析图谱。
[0049] 采用高效液相法分析其单糖组成情况，利用混合多糖的标样确定组分中单糖的比 例。林蛙提取混合液中含有的单糖有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩 藻糖、葡萄糖醛酸以及半乳糖醛酸，其中鼠李糖：甘露糖：半乳糖：葡萄糖：木糖：阿拉伯糖： 岩藻糖的比例约为1 :4 :6 :12 :7 :5 :3(体积比），糖醛酸含量中葡萄糖醛酸：半乳糖醛酸= 1 :1(体积比）；
[0050] 图6 :林蛙提取混合液中所含抗菌肽分子凝胶电泳图。
[0051] 采用Tricine电泳法测抗菌肽分子量，以索莱宝公司的超低分子量蛋白质marker 作为标准，得出所含抗菌肽分子量约为1?3Kda。
[0052] 图中左侧为标准的marker，即标准分子量蛋白质的电泳图，由左向右依次为实施 例一中林蛙提取混合液中所含抗菌肽分子凝胶电泳图；实施例二中林蛙提取混合液中所含 抗菌肽分子凝胶电泳图；实施例三中林蛙提取混合液中上所含抗菌肽分子凝胶电泳图；实 施例四中林蛙提取混合液中所含抗菌肽分子凝胶电泳图；实施例五中林蛙提取混合液中所 含抗菌肽分子凝胶电泳图。
【具体实施方式】
[0053] 下面结合实施例对本发明作进一步描述。本发明所用林蛙干产自是我国东北地区 长白山麓。中国林娃（Rana temporaria chensinensis)俗称田鸡、哈士蟆、雪哈等，在动物 分类上属两栖纲、无尾目、蛙科、蛙属，是我国东北地区长白山麓的特有品种，属于药、食两 用的珍贵蛙种，并且资源丰富。
[0054] 实施例一林蛙提取冻干粉的制备
[0055] 将林蛙干35g(林蛙干为除脂除卵的林蛙干体）除杂除尘后分别经20、40目、80 目、100目粉碎，使林蛙干粉碎物的粒径在500 μ m以下，按照lg :7mL的比例加入复合酶水 解液，复合酶水解液中含木瓜蛋白酶2wt %、胰蛋白酶3wt %，风味蛋白酶2wt %，酶解温度 为52°C，酶解时间为1. 5h，酶解pH为7. 3,而后85°C、12min灭酶，将混合物在温度25°C时 离心，离心时间为311^11，离心转速为3000印111，取离心后混合液体积30 (%的上层上清液，此 时提取了林蛙干中含有的短肽胶原蛋白；
[0056] 短肽胶原蛋白中（紫外光谱分析法分析氨基酸类别，氨基酸自动分析仪收集测定 氨基酸质量分数）精氨酸、赖氨酸、组氨酸的含量（占上层上清液质量的百分数）分别为 3.12%、7.43%、0.73 (%，天冬氨酸、谷氨酸的含量（占上层上清液质量的百分数）分别为 7. 86%、11· 19%。
[0057] 取上清后剩余混合物（原体积的70% )，放入胶体磨，研磨5min，使混合物的平均 粒径在300 μ m以下；将混合物再放入高剪切分散乳化机内，剪切4min，使混合物平均粒径 在100?200 μ m之间，将混合物进行喷雾干燥成粉末状，此时得到林蛙干提取短肽胶原蛋 白后剩余纤维、骨质等物质的超微粉；
[0058] 将纤维、骨质等物质的超微粉加入到质量浓度为8%醋酸中，醋酸与超微粉的体积 质量比（mL :g)为18:1。超声，超声时间为：45min，超声温度为20°C;过滤，经150μπι纱网 过滤；150 μ m纱网上面未过滤物质加入质量体积比为1:6的0.025mol/L氢氧化钠，进行微 波提取，微波功率为520W，微波时间6min，再次经150 μ m纱网过滤；合并两次滤液，20°C，搅 拌15min，搅拌速度为120rpm ;搅拌后的滤液离心，离心温度为20°C，离心时间为16min，离 心转速为6000rpm;取上清，减压浓缩，压力为650托，温度为65°C，浓缩体积比为12:1 ;此 时得到多糖、抗菌肽、钙离子的混合物（钙离子的检测采用EDTA滴定法检测）；
[0059] 混合物中多糖（Sephadex G - 25凝胶柱分离收集单糖，高效液相色谱法测定单糖 组成）主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖、葡萄糖醛酸以及半 乳糖醛酸组成，其中含单糖鼠李糖：甘露糖：半乳糖：葡萄糖：木糖：阿拉伯糖：岩藻糖约为 1 :4:6 :12 :1 :0.5 :1(体积比），糖醛酸中葡萄糖醛酸：半乳糖醛酸=1 :1(体积比）；
[0060] 抗菌肽中（紫外光谱分析法分析氨基酸类别，氨基酸自动分析仪收集测定氨基酸 质量分数）精氨酸、赖氨酸、组氨酸的含量（占混合物的百分数）分别为2. 73%、8. 16%、 0.69%，天冬氨酸、谷氨酸的含量（占混合物的百分数）分别为4. 47% :5. 98%。
[0061] 将短肽胶原蛋白、多糖、抗菌肽、钙离子混合，得到林蛙提取混合液130mL，其中钙 离子为 104mg(80mg/100ml)。
[0062] 将林蛙提取混合液经过预冻温度为_35°C，预冻时间为150min;升华当温 度-38°C，压力650托，维持时间180min，当温度-33°C，压力680托，维持时间180min，当温 度-25°C，压力500托，维持时间240min，当温度-20°C，压力500托，维持时间150min，当温 度-15°C，压力450托，维持时间150min，当温度-10°C，压力400托，维持时间240min，当温 度-5°C，压力300托，维持时间120min，当温度-2°C，压力300托，维持时间120min，当温度 2°C，压力400托，维持时间180min ;解吸当温度5°C，压力450托，维持时间240min，当温度 l〇°C，压力500托，维持时间180min，当温度15°C，压力600托，维持时间240min，得到林蛙 提取冻干粉，质量是3. 8g。
[0063] 实施例二林蛙提取凝胶剂的制备
[0064] 处方组成（按重量份计算）：按照实施例一的方法由林蛙干35g制备的林蛙提取 冻干粉3. 8g，丙二醇5g，卡波姆0. 2g，聚氧乙烯氢化蓖麻油5g，亚硫酸氢钠0. lg，乙二胺四 乙酸二钠〇. lg，尼泊金〇. lg，氮酮〇. 2g，三乙醇胺0. lg。
[0065] 制备方法：
[0066] (1)林蛙提取冻干粉的制备
[0067] 称取林娃干35g(中国林娃长白山亚种，购自吉林大药房），按照实施例一的方法 制备成林蛙提取冻干粉3. 8g ;
[0068] (2)林蛙提取凝胶剂的制备
[0069] 无菌条件下将亚硫酸氢钠、乙二胺四乙酸二钠溶解于7:1 (mL:g)超纯水中，40°C， 搅拌15min，搅拌速度为150rpm，搅拌过程中加入卡波姆，使其溶胀均勻；取林娃提取冻干 粉搅拌溶解于5:1 (mL:g)超纯水中，加入丙二醇、聚氧乙烯氢化蓖麻油、氮酮、尼泊金搅拌， 搅拌温度40°C，搅拌时间20min，搅拌速度为200rpm，将此溶液加入到卡波姆溶胀物中， 30°C，搅拌时间20min，搅拌速度为200rpm，搅拌过程中加入三乙醇胺，使其均匀，经纳米匀 质机6次，使林蛙提取凝胶原液的粒径在100 μ m以下。分装，得无色透明林蛙提取凝胶剂， 质量是34. 6g。
[0070] 实施例三林蛙提取乳液的制备
[0071] 处方组成（按重量份计算）：按照实施例一的方法由林蛙干35g制备的林蛙提取 冻干粉3. 8g，硬脂酸4. 5g,十八醇2. 51g,十六醇2. 5g,白油3. lg, Twenn-600. 5g,羊毛脂 1. 2g，橄榄油0. 5g，甘油6. 5g，三乙醇胺0. 31g，茉莉香精0. lg，布罗波尔0. 05g，尼泊金丙 酯 〇. 2g。
[0072] 制备方法：
[0073] (1)林蛙提取冻干粉的制备
[0074] 称取林娃干35g(中国林娃长白山亚种，购自吉林大药房），按照实施例一的方法 制备成林蛙提取冻干粉3. 8g ;
[0075] (2)林蛙提取乳液的制备
[0076] 将硬脂酸，十八醇，十六醇，白油，Twenn-60,羊毛脂，橄榄油混合，搅拌，搅拌温度 40°C，搅拌时间20min，搅拌速度为200rpm，形成油相；
[0077] 将林蛙提取冻干粉与甘油，三乙醇胺，超纯水充分混合，搅拌，搅拌温度20°C，搅拌 时间lOmin，搅拌速度为300rpm，形成水相；
[0078] 将油相与水相在30°C下混合搅拌，加入香精，布罗波尔，尼泊金丙酯，再次搅拌，搅 拌温度25°C，搅拌时间15min，搅拌速度为200rpm，经纳米匀质机4次，既得林蛙提取乳液， 质量是120g。
[0079] 实施例四林蛙提取面膜的制备
[0080] 处方组成（按重量份计算）：按照实施例一的方法由林蛙干35g制备的林蛙提取 冻干粉3. 8g，甘油5. Og，1，3- 丁二醇4. Og，透明质酸0. lg，熊果苷2. Og，卡波树脂0. 5g，泛 醇0. 5g，维生素 C脂质体3. 0g，三乙醇胺0. 4g，聚乙二醇-60氢化蓖麻油0. 3g，尼泊金丙酯 0.2g，茉莉香精0. lg。
[0081] 制备方法：
[0082] (1)林蛙提取冻干粉的制备
[0083] 称取林娃干35g(中国林娃长白山亚种，购自吉林大药房），按照实施例一的方法 制备成林蛙提取冻干粉3. 8g ;
[0084] (2)林蛙提取面膜的制备
[0085] 将林蛙提取冻干粉，甘油，1，3- 丁二醇，透明质酸，熊果苷，卡波树脂，泛醇，维生素 C脂质体，三乙醇胺，聚乙二醇-60氢化蓖麻油，尼泊金丙酯，茉莉香精与超纯水混合，超纯 水加至100. 〇%，115°C灭菌lOmin。自然冷却至室温，加入到放有无菌无纺布（15cmX 15cm) 独立包装袋内，密封即得。
[0086] 实施例五林蛙提取冻干粉口服剂的制备
[0087] 处方组成（按重量份）：按照实施例一的方法由林蛙干35g制备的林蛙提取混合 液130mL，柠檬酸6g，甜菊糖苷5g，安赛蜜5g，黄原胶5g，山梨酸钾5g，醋酸锌lg，β -环糊 精5g。
[0088] 制备方法：
[0089] (1)林蛙提取混合液的制备：
[0090] 称取林娃干35g(中国林娃长白山亚种，购自吉林大药房），按照实施例一的方法 制备成林娃提取混合液130mL ;
[0091] (2)减压浓缩：将提取混合液在减压条件下进行蒸馏，压力在9. 3X 103帕，温度为 65°C，浓缩比为4:1，得浓缩液；
[0092] (3)将研细的醋酸锌缓慢加入浓缩液中，边加边搅拌；加完后用0· lmol/L NaOH调 节pH为6. 4,搅匀后使其自然沉降，自然冷却过夜；
[0093] (4)0. 45 μ m滤膜过滤，得澄清液体后，加入用柠檬酸酸化的甜菊糖苷、安赛蜜，温 度在58°C时，160rpm搅拌，搅拌时间为18min，过滤，再向清液中加入适量黄原胶和溶解好 的山梨酸钾、β -环糊精，经0. 22 μ m滤膜精滤；
[0094] (5)冷冻干燥得成品--林蛙提取冻干粉口服剂型。
[0095] 以下试验例表明本发明在治疗痤疮药物中的用途
[0096] 试验例1
[0097] 采用完全随机的方法，将420例病患受试对象分配到治疗组（240例，共4组）和 对照组（180例，3组）。治疗组分别采用实施例二、实施例三、实施例四、实施例五制成的林 蛙提取冻干粉制剂，对照组采用迪维霜（重庆华邦制药股份有限公司）、林蛙皮抗菌肽（采 用CN1216768A方法制备）、林蛙体抗菌肽（采用CN103073628A方法制备）。根据疗效标准 判断疗效，结果见表1。
[0098] 用法：实施例二组、实施例三组、实施例四组、迪维霜组、林娃皮抗菌肽组、林娃体 抗菌肽组为外用剂型，每日早晚两次清洗患处后使用药物，实施例二组每次用药量为2g，用 药方式为涂抹患处，2次/d ;实施例三组每次用量为2mL，使用方式为涂抹患处，2次/d ;实 施例四组使用前清洗患处，每次使用时间为15min，1次/d ;迪维霜组每次用药量为2g，用药 方式为涂抹患处，2次/d ;林蛙皮抗菌肽组每次用药量为2mL，用药方式为涂抹患处，2次/ d ;林蛙体抗菌肽组每次用药量为2mL，用药方式为涂抹患处，2次/d ;实施例五组为内服组， 早晚每次口服20mg。
[0099] 各组同时停用其他相关手段和治疗药物，均以7天为1疗程。
[0100] 统计学方法：计量资料用t检验，记数资料用X2及Rdiit检验，P〈0. 05为差异有 统计学意义。
[0101] 疗效评定标准：
[0102] 参照《中药新药治疗痤疮的临床研究指导原则》中关于疾病疗效判定标准。痊愈： 症状，体征消失或基本消失，积分值减少1>95% ;显效：症状，体征明显改善，积分值减少 > 70% ;有效：症状，体征有好转，积分值减少> 30% ;无效：症状，体征未见好转，积分值减 少〈30%。
[0103] 表1本发明治疗痤疮的情况（例）
[0104]
【权利要求】
1. 一种林蛙提取冻干粉，其特征在于：含有短肽胶原蛋白、多糖、抗菌肽和钙离子，且 按照下述步骤制备得到： (1) 将林蛙干除杂除尘后依次经20?100目粉碎，使林蛙干粉碎物的粒径在500 μ m以 下，按照lg :1?10mL的比例加入复合酶水解液，复合酶水解液中含木瓜蛋白酶1?5wt%、 胰蛋白酶2?4wt %，风味蛋白酶1?3wt %;在50?55°C下酶解1?2h，酶解pH为7. 0? 7. 5,而后在85?90°C、5?15min灭酶；再将混合物在10?30°C离心，离心时间为1? 5min，离心转速为2000?4000rpm，取离心后混合液体积20?40 %的上层上清液，此时上 层上清液中含有林蛙干短肽胶原蛋白； (2) 将上述取上层上清液后的剩余混合物放入胶体磨，研磨2?15min，使混合物的平 均粒径在300 μ m以下；将研磨后的混合物放入高剪切分散乳化机内，剪切1?15min，使混 合物平均粒径在100?200 μ m之间；再将剪切后的混合物喷雾干燥成粉末状，得到超微粉； 将该超微粉加入到质量浓度为2?10%醋酸中超声，醋酸与超微粉的体积质量比为10? 40mL :lg，超声时间为5?75min，超声温度为4?30°C;再经150μ m纱网过滤，纱网上面未 过滤物质再加入质量体积比为lg: 1?8mL、浓度为0. 01?0. 03mol/L的氢氧化钠，进行微 波提取，微波功率为500?600W，微波提取时间为3?9min，再次经150 μ m纱网过滤；合并 两次滤液，30?50°C搅拌10?30min，搅拌速度为100?200rpm ;将搅拌后的滤液离心，离 心温度为4?30°C，离心时间为2?40min，离心转速为2000?15000rpm ;取上清液减压 浓缩，压力为600?700托，温度为65?70°C，浓缩体积比为8?40 :1 ;从而得到多糖、抗 菌肽和钙离子的混合物； (3) 将步骤（1)得到的短肽胶原蛋白和步骤（2)得到的多糖、抗菌肽、钙离子混合，得到 林娃提取混合液； (4) 将上述林蛙提取混合液经过预冻、升华、解吸处理后得到林蛙提取冻干粉。
2. 如权利要求1所述的林蛙提取冻干粉，其特征在于：预冻温度为-42?-48°C，预冻 时间为150?180min ;升华为多温度段升华过程，即在温度-35?-40°C，压力600?700 托下维持150?240min ;在温度-30'-35°C，压力600?700托下维持180?240min ;在 温度-25?-30°C，压力500?600托下维持180?240min ;在温度-20?-25°C，压力 500?600托下维持150?180min ;在温度-15?-20°C，压力450?500托下维持150? 180min ;在温度-10?-15°C，压力400?450托下维持180?240min ;在温度-5?-10°C， 压力300?400托下维持120?150min ;在温度0?-5 °C，压力300?400托下维持120? 150min ;在温度0?5°C，压力400?500托下维持150?180min ;解吸为多温度段解吸过 程，即在温度5?10°C，压力400?500托下维持240?300min ;在温度10?15°C，压力 500?600托下维持180?240min ;在温度15?20°C，压力600?700托下维持180? 240min，从而得到林蛙提取冻干粉。
3. 权利要求1或2所述的林蛙提取冻干粉在制备治疗痤疮的药物及化妆品中的应用。
4. 一种治疗痤疮的林蛙提取凝胶剂，其特征在于：按重量份计算，其原料为林蛙提取 冻干粉3?8份，丙二醇5?15份，卡波姆0. 2?1. 5份，聚氧乙烯氢化菌麻油5?15份， 亚硫酸氢钠0. 1?1份，乙二胺四乙酸二钠0. 1?1份，尼泊金0. 1?1份，氮酮0. 2?1. 5 份，三乙醇胺0. 1?1份；且由如下步骤制备得到： (1)无菌条件下将亚硫酸氢钠、乙二胺四乙酸二钠溶解于超纯水中，超纯水与亚硫酸氢 钠、乙二胺四乙酸二钠的体积质量比为5?15mL :lg，30?50°C下搅拌10?30min，搅拌速 度为100?200rpm，搅拌过程中加入卡波姆，从而得到溶胀均匀的卡波姆溶胀液； (2) 取林蛙提取冻干粉搅拌溶解于超纯水中，超纯水与林蛙提取冻干粉的体积质量比 为5?10mL :lg，再加入丙二醇、聚氧乙烯氢化蓖麻油、氮酮、尼泊金搅拌，搅拌温度30? 60°C，揽拌时间15?40min，揽拌速度为100?300rpm ; (3) 将步骤（2)的混合溶液加入到步骤（1)的卡波姆溶胀液中，20?50°C下搅拌10? 40min，搅拌速度为150?300rpm，搅拌过程中加入三乙醇胺； (4) 匀质4?7次，使上述反应产物粒径在100 μ m以下，从而得到无色透明的用于治疗 痤疮的林蛙提取凝胶剂。
5. -种治疗痤疮的林蛙提取乳液，其特征在于：按重量份计算，其原料为林蛙提取 冻干粉3?8份，硬脂酸2?10份，十八醇2?10份，十六醇3?8份，白油2?6份， Twenn-601?3份，羊毛脂1?3份，橄榄油1?5份，甘油5?15份，三乙醇胺0. 1?2 份，茉莉香精〇. 1?2份，布罗波尔0. 01?1份，尼泊金丙酯0. 1?2份；且由如下步骤制 备得到： (1) 将硬脂酸，十八醇，十六醇，白油，Twenn-60,羊毛脂，橄榄油混合，20?50°C下搅拌 15?35min，搅拌速度为150_300rpm，形成油相； (2) 将林蛙提取冻干粉与甘油，三乙醇胺，超纯水充分混合，20?40°C下搅拌10? 25min，搅拌速度为300?500rpm，形成水相； (3) 将油相与水相在20?40°C下混合搅拌，搅拌时间5?20min，加入茉莉香精，布罗 波尔，尼泊金丙酯，再次搅拌，搅拌温度20?40°C，搅拌时间10?30min，搅拌速度为200? 400rpm，经纳米匀质机匀质3?8次，得到用于治疗痤疮的林蛙提取乳液。
6. -种治疗痤疮的林蛙提取面膜，其特征在于：按重量份计算，其原料为林蛙提取冻 干粉3?8份，甘油4?8份，1，3- 丁二醇2?10份，透明质酸0. 05?1份，熊果苷1?5 份，卡波树脂〇. 1?1. 5份，泛醇0. 1?2份，维生素 C脂质体2?6份，三乙醇胺0. 1?2 份，聚乙二醇-60氢化蓖麻油0. 1?1份，尼泊金丙酯0. 1?2份，茉莉香精0. 1?1份；且 由如下步骤制备得到： (1) 将林蛙提取冻干粉，甘油，1，3- 丁二醇，透明质酸，熊果苷，卡波树脂，泛醇，维生素 C脂质体，三乙醇胺，聚乙二醇-60氢化蓖麻油，尼泊金丙酯，茉莉香精与超纯水混合，搅拌， 搅拌温度20?60°C，搅拌时间10?40min，搅拌速度为300?500rpm，110?120°C灭菌 10 ?20min ; (2) 将上述反应物冷却后加入到放有无菌无纺布独立包装袋内，密封后得到用于治疗 痤疮的林蛙提取面膜。
7. -种治疗痤疮的林蛙提取冻干粉口服剂，其特征在于：按重量份计算，其原料为 20?65份林蛙干按照权利要求1所述步骤得到的林蛙提取混合液，5?10份柠檬酸，甜菊 糖苷5?30份，5?25份安赛蜜，5?10份黄原胶，5?10份山梨酸钾，1?5份醋酸锌， 5?10份β -环糊精；且由如下步骤制备得到： (1) 减压浓缩：将林蛙提取混合液在减压条件下进行蒸馏，压力为8Χ 103?3Χ 104帕， 温度为50?85°C，浓缩比为1?5:1，得浓缩液； (2) 将研细的醋酸锌缓慢加入浓缩液中，边加边搅拌；加完后用0. lmol/L的NaOH调节 pH为6. 2?6. 5,搅拌均匀后使其自然沉降，冷却过夜； (3) 0. 45 μ m滤膜过滤，得澄清液体后，加入柠檬酸、甜菊糖苷、安赛蜜，50?65 °C、 100?200rpm下搅拌10?25min，过滤；然后向清液中加入黄原胶、山梨酸钾、β -环糊精， 再经0. 22 μ m滤膜精滤； (4) 冷冻干燥，即得到用于治疗痤疮的林蛙提取冻干粉口服剂。
【文档编号】A61K9/06GK104147050SQ201410360694
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年7月25日 优先权日:2014年7月25日
【发明者】孟庆繁, 王迪, 付珧, 滕乐生, 刘艳, 逯家辉, 李喆, 张 杰, 刘瑜, 滕利荣, 孟威, 孟研 申请人:吉林大学