一种具有生物活性器官的制造方法
【专利摘要】本发明公开了一种具有生物活性器官的制造方法，包括：读取待加工器官的三维模型，对所述三维模型进行分层，读取每层层文件的结构特征数据；在多孔基底上制作该层文件对应的器官截面，得到带有器官截面的器官基底；对于任意两个相邻的器官截面，在多孔基底上制作该相邻两个器官截面之间的营养通道截面，得到带有营养通道截面的营养通道基底；在器官基底上，根据每层层文件的结构特征数据信息，利用三维打印喷头实现细胞在器官截面上的沉积；将器官基底和营养通道基底按照次序依次固定，培养，形成具有生物活性器官。本发明采用了无菌滤纸或多孔薄膜作为器官截面的支撑，避免了无强度的凝胶堆积形成的器官易坍塌，难以成型的缺点。
【专利说明】一种具有生物活性器官的制造方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物制造领域，尤其是涉及一种具有生物活性器官的制造方法。
【背景技术】
[0002] 活性组织的制造可为人类的组织缺损提供最佳的替换品，因而一直是组织工程领 域的研究热点。而血管作为生物体中的基本组织，承担着营养输送的重要任务，目前有关制 作血管的方法主要有以下几类：
[0003] -类是以制作无生物活性的器官，主要以血管为主，例如：申请公布号为 CN100364489A的专利文献公开了一种抗折型机织人造血管，血管管坯由经纬纱交织而成， 在血管管坯的外表面有弹性带；在管坯的外壁具有以挑纱方式将经纱间隔挑成的一个个纱 圈，纱圈以螺旋状或网络状排列于管坯的外壁，弹性带穿入一个个纱圈内，由纱圈定位于管 坯的外壁。申请公布号为CN1522675A的专利文献公开了一种内壁无褶型机织人造血管， 以平纹或斜纹与绞纱为基本组织，其特征是在构成基本组织的经纱间辅以一定间隔的经浮 长纱，共同组成血管管坯的组织结构，管坯纬纱间的间隔因压缩而消除，形成光滑的血管 内壁，管坯经纱中的经浮长纱则因压缩而形成拱起，构成血管外壁的皱褶。申请公布号为 CN1248156A的专利文献公开了一种外科手术中之移植件的多层复合管状结构，包括：一包 括一生物相容性材料的外层；一包括冶金法粘接到该外层的一非透射性材料的中间层；和 一包括冶金法粘接到该中间层的一生物相容性材料的内层。这一类制作方法，仅能制作无 活性的器官，适用性差。
[0004] 第二类是以非人动物制作活性器官，例如申请公布号为CN102512263A的专利文 献公开了一种把异体的器官换为器官接受者细胞组成的器官：首先准备好器官大小与人 (器官接受者）器官大小差不多的动物（器官提供者），然后，在器官移植前或移植后向动 物的器官或循环的动物或器官接受者血液中注入相应的动物组织干细胞的抗体交联物。接 下来在移植手术成功后按照常规剂量使用免疫抑制剂，同时注射干细胞动员剂，本发明具 有器官来源充足，成本低，而且患者无需等待器官捐献者的出现就可以随时买到合适的器 官，患者无需终身服用免疫抑制药物。然而这种方法，以牺牲其他动物为前提，可实施性差。
[0005] 第三类是目前最具有研发前景的方法之一，该类方法以高分子等材料为主，基于 活体细胞直接制造血管，目前主要是方法是通过凝胶颗粒包裹细胞，然后使用三维运动平 台控制凝胶颗粒有序的沉积，实现活性血管的制造。这种方法的主要缺点是沉积后的血管 组织，无法具有正常血管的功能，所沉积细胞间无法有效的建立通讯联系，因而也就无法具 有正常血管的弹性、能分泌抗血栓物质等特性。
【发明内容】
[0006] 本发明提供了一种具有生物活性器官的制造方法，可方便快速的制造出器官，该 方法适于各种生物器官的制造中，具有加工方便，效率高、易于给制造出的器官输送营养、 易于对器官细胞施加各种模拟体内器官所处环境的刺激。
[0007] -种具有生物活性器官的制造方法，包括：
[0008] (1)读取待加工器官的三维模型，对所述三维模型进行分层，得到层文件，读取每 层层文件的结构特征数据；
[0009] (2)对于每一个层文件，根据其结构特征数据，分别在多孔基底上制作该层文件对 应的器官截面，得到带有器官截面的器官基底；
[0010] (3)对于任意两个相邻的器官截面，在多孔基底上制作该相邻两个器官截面之间 的营养通道截面，得到带有营养通道截面的营养通道基底；
[0011] (4)在器官基底上，根据每层层文件的结构特征数据信息，利用三维打印喷头实现 细胞在器官截面上的沉积；
[0012] (5)将器官基底和营养通道基底按照次序依次固定，培养，形成具有生物活性器 官。
[0013] 步骤（1)中，待加工器官的三维模型可通过三维软件得到，例如可采用 Solidworks、rhinocero等，也可采用CT扫描，然后三维重建的方式获得。对三维模型进行 分层可采用常见的分层软件，例如MagicRP、Slic3R、Skeinforge等。步骤（1)中分层厚度， 一般根据步骤（2)中多孔基底的厚度确定，一般为0. 1-lmm，进一步优选为0. 1-0. 4mm。
[0014] 步骤（2)和步骤（3)中，所述多孔基底可独立的选择无菌滤纸或多孔薄膜；可以是 商品化的亲水无菌滤纸、也可以是自制的多孔亲水薄膜，厚度在0. lmm-lmm之间，亲水无菌 滤纸或多孔亲水薄膜的孔径大小要能够通过细胞，即孔径控制在30 μ m-500 μ m之间。
[0015] 每层器官基底上主要包括如下结构：器官截面、以及便于实现器官截面固定的其 他辅助结构；所述器官截面包括与器官结构对应的孔结构、位于孔结构内壁的营养吸收纤 毛、以及除孔结构以外的细胞组织区域。所述其他辅助结构主要包括用于实现器官截面轴 向固定的组装定位孔、用于实现器官截面与器官基底其余部分径向固定的连接件。
[0016] 步骤（3)中，在多孔基底上制作两个相邻器官截面之间的营养通道截面时，一般 根据相邻两个器官截面中任一器官截面的结构制作；营养通道基底一般包括营养通道截 面、以及便于实现营养通道截面固定的其他辅助结构；营养通道截面包括与器官截面上孔 结构对应的径向传输孔结构、以及轴向传输孔结构，轴向传输孔结构一般位于两个相邻器 官截面的细胞组织区域之间，便于实现对两层细胞的营养输送。所述其他辅助结构主要包 括用于实现营养通道截面轴向固定的组装定位孔、用于实现营养通道截面与营养通道基底 其余部分径向固定的连接件。
[0017] 步骤（4)中，利用三维打印喷头实现细胞在器官截面上的沉积，沉积区域为器官 截面上除孔结构以外的细胞组织区域，与器官上细胞组织的分布一致。
[0018] 三维打印喷头可使用压电式喷头、挤压式、气动式等各种喷头。血管截面，由三层 环形截面构成，最里面是内皮细胞，中间是平滑肌细胞，外层是成纤维细胞。为固定住细胞， 可使用凝胶将细胞包裹，采用凝胶将细胞包裹可采用温敏凝胶如明胶，也可采用离子反应 实现，如使用纤维蛋白+凝血酶获得纤维蛋白凝胶、海藻酸钠+氯化钙获得海藻酸钠凝胶。
[0019] 对于明胶，可使用热溶液将明胶熔化，混入细胞后，装入喷头，通过二维平台的运 动，实现细胞在无菌滤纸或多孔薄膜上的沉积。然后对无菌滤纸或多孔薄膜降温，使得明胶 凝结成凝胶，依次按顺序使用三个喷头沉积血管的三种细胞，从而获得血管截面。
[0020] 如采用离子反应实现，以纤维蛋白凝胶为例，将纤维蛋白混合细胞后的溶液装入 喷头，通过二维平台的运动，实现纤维蛋白及在无菌滤纸或多孔薄膜上的沉积。然后将无菌 滤纸或多孔薄膜浸入凝血酶溶液中，纤维蛋白形成纤维蛋白凝胶，依次按顺序使用三个喷 头沉积血管的三种细胞，从而获得血管截面。
[0021] 步骤（4)完成后，根据需要，作为优选，增加培养步骤，S卩：将带沉积好的器官截面 的器官基底放入培养液中培养，1-2天。培养的目的是是刚沉积出的血管截面上的细胞适应 新的环境，可顺利的和培养液进行营养交换，进行生长。本步骤为优选，可根据实际情况省 略。
[0022] 当加入培养步骤时，步骤（4)的凝胶固化过程也可待步步骤（4)完成后进行，即在 培养步骤中的培养液中混入凝血酶，反应获得凝胶。
[0023] 步骤（5)中，利用器官基底和营养通道基底上的组装定位孔将多层器官截面和营 养通道截面轴向固定。同时，器官基底和营养通道基底上的径向连接件实现对器官截面和 营养通道截面的径向固定。固定完成后，多层器官截面和营养通道截面的孔结构相互对应， 形成完整的培养流道。
[0024] 步骤（5)中，培养过程为：将固定好的三维器官放入培养液中培养，在培养流道内 通入培养液，施加流场刺激，模拟实际器官在流动时所受体内流动剪切及器官的实际生长 环境，除对器官施加流场刺激外，也可对器官施加拉伸及剪切力作用。培养7-30天即可获 得活性血管。
[0025] 本发明制作方法可以用于各种器官的制作，例如可用于环形截面的血管的制作， 除了环形截面，由椭圆形截面或其他无规则截面构成的器官也同样可以采用本发明的方式 进行制造，例如可用于制作半月板。
[0026] 本发明通过培养流道实现了对器官径向的营养输送，通过营养通道截面实现器官 轴向的营养输送，保证器官在培养前期细胞的成活率，避免细胞死亡，保证器官制作的成功 率。
[0027] 与现有技术相比，本发明具有如下优点：
[0028] (1)、由于采用了无菌滤纸或多孔薄膜作为血管截面的支撑，避免了无强度的凝胶 堆积形成的器官易坍塌，难以成型的缺点。
[0029] (2)、本方法获得的器官易于构造拟器官生长的环境，通过特殊设计的器官培养流 道，很容易对器官施加流场刺激，也很容易施加拉伸及剪切力，更好的模拟器官生长环境。
[0030] (3)、通过特殊设计的营养吸收纤毛，便于器官吸收营养物质，从而避免了现有制 造器官的技术中出现的营养只限于表面，难以达到组织内部的情形。
【专利附图】
【附图说明】
[0031] 图1为本发明实施例1使用的无菌滤纸结构图。
[0032] 图2为本发明实施例1中器官基底的结构示意图。
[0033] 图3为本发明实施例1中营养通道基底的结构示意图。
[0034] 图4为本发明实施例1中的带有细胞的环形的血管截面图。
[0035] 图5为本发明实施例1中制备得到具有生物活性血管的二维结构示意图。
[0036] 图6为本发明实施例2中需要制备的半月板的结构示意图。
[0037] 图7(a)-图7(c)为本发明实施例2中制备的半月板基底的结构示意图。
[0038] 图8(a)-图8(c)为本发明实施例2制备的营养通道基底的结构示意图。
[0039] 图9为本发明实施例2中制备的得到具有生物活性半月板的二维结构示意图。
【具体实施方式】
[0040] 实施例1 :制作血管
[0041] 利用三维软件例如Solidworks制作血管的三维模型，对得到的三维模型进行分 层，得到多层层文件，厚度为0. 34mm，同时读取每层层文件的结构特征数据信息，输入到数 控激光切割机中，然后进行如下步骤。
[0042] (a)、如图1所示，多孔基底采用无菌滤纸100,无菌滤纸采用Whatman滤纸，型号为 3030-961，厚度为0. 34_的滤纸。对于每一个层文件，使用数控激光切割机在图1所示的 无菌滤纸100上切割出图2所示的血管基底、以及与该层血管基底相邻的图3所示的营养 通道基底。
[0043] 制作图2所示的血管基底时，利用数控激光切割机在图1所示的无菌滤纸100上 加工出血管组装定位孔101、血管培养流道外截面孔102、血管培养流道内截面孔103、血管 固定连接件104、血管外壁营养吸收纤毛105、血管内壁营养吸收纤毛106,血管外壁营养吸 收纤毛105及血管内壁营养吸收纤毛106间为环形区域107,用于细胞在该处沉积，构成图 4所示的血管截面200。血管截面200,由三层环形截面构成，最里面是内皮细胞，中间是平 滑肌细胞，外层是成纤维细胞。
[0044] 制作图3所示的营养通道基底时，利用数控激光切割机在图1所示的无菌滤纸100 上加工出营养通道组装定位孔301、血管培养流道外截面孔302、营养通道固定连接件304、 以及血管截面毛细输送通道307。血管截面毛细输送通道307为环形，位于两个相邻血管截 面200的中间，方便为血管内外层通过滤纸的毛细效应输送营养。
[0045] (b)、通过安装有压电式喷头的二维工作平台，在图2所示的环形区域107位置沉 积出带有细胞的环形的血管截面200,如图4所示。共沉积三层细胞构成血管截面200,最 里面是内皮细胞，中间是平滑肌细胞，外层是成纤维细胞。使用三个独立喷头分别喷射纤维 蛋白溶液混合内皮细胞、纤维蛋白溶液混合平滑肌细胞、纤维蛋白溶液混合成纤维细胞。沉 积完成血管截面200后，将滤纸浸入凝血酶溶液中，血管截面200处的纤维蛋白和凝血酶反 应形成纤维蛋白凝胶，起到固定血管截面上的各种细胞的作用。
[0046] (c)、将沉积好血管截面的滤纸放入培养液中培养1-2天。培养的目的是刚沉积出 的血管截面上的细胞适应新的环境，可顺利的和培养液进行营养交换，进行生长。培养液没 有特殊要求，可采用常用的牛血清培养液。
[0047] (d)、将多片步骤（c)处理后带有血管截面200的无菌滤纸及为血管细胞提供营 养输送的带有营养通道截面的无菌滤纸，通过血管组装定位孔101和营养通道组装定位孔 301，叠加组装起来，实现从二维血管截面到三维血管502的制作，如图5所示。血管基底 500和营养通道基底501的数量比为1-10,优选为1 :1。由血管培养流道外截面孔102、血 管培养流道外截面孔302组成血管外壁培养流道503 ;由血管培养流道内截面孔103、血管 截面毛细输送通道307组成血管内壁培养流道504。
[0048] (e)、将三维血管放入培养液中培养，在血管外壁培养流道503及血管内壁培养流 道504内通入培养液，施加流场刺激，模拟实际血管在流动时所受体内流动剪切及血管的 实际生长环境，除对血管施加流场刺激外，也可对血管施加拉伸及剪切力作用，培养10天 后获得活性血管。
[0049] 在血管外壁培养流道503及血管内壁培养流道504内通入培养液可更好的促进内 皮细胞间通讯，构成血管内膜，成纤维细胞间的通讯，构成血管外膜，平滑肌细胞间的通讯 以及和内皮细胞及成纤维细胞的通讯，构成血管中间层。由于无菌滤纸或多孔薄膜所具有 的毛细效应，三维血管可通过血管外壁营养吸收纤毛105、血管内壁营养吸收纤毛106,吸 收营养物质，从而避免了现有制造血管的技术中出现的营养只限于表面，难以达到组织内 部的情形。
[0050] 实施例2 :制作半月板
[0051] 利用三维软件例如Solidworks制作半月板的三维模型，对得到的三维模型进行 分层，得到多层层文件，如图6所示，厚度为0. 34mm，同时读取每层层文件的结构特征数据 信息，输入到数控激光切割机中，然后进行如下步骤。
[0052] (a)、如图1所示，多孔基底采用无菌滤纸100,无菌滤纸采用Whatman滤纸，型号为 3030-961，厚度为0. 34_的滤纸。对于每一个层文件，使用数控激光切割机在图1所示的 无菌滤纸100上依次切割出图7 (a)-图7 (c)所示的半月板基底、以及与该层半月板基底相 邻的图8(a)-图8(c)所示的营养通道基底。
[0053] 制作半月板基底时，利用数控激光切割机在图1所示的无菌滤纸100依次切出半 月板截面700,用于细胞在该处沉积。图7(a)-图7(c)所示为半月板中不同位置层文件对 应的几种半月板基底图结构。
[0054] 制作营养通道基底时，利用数控激光切割机在图1所示的无菌滤纸100上加工出 以及半月板截面营养输送通道800。图8(a)-图8(c)所示为半月板中不同位置层文件对应 的营养通道基底。半月板截面营养输送通道800,位于两个相邻半月板截面700的中间，方 便为半月板外层通过滤纸的毛细效应输送营养。
[0055] (b)、通过安装有喷头的二维工作平台，在图7所示的区域位置沉积出带有软骨细 胞的半月板截面700,使用一个喷头喷射纤维蛋白溶液混合软骨细胞。沉积完成半月板截面 700后，将滤纸浸入凝血酶溶液中，半月板截面700处的纤维蛋白和凝血酶反应形成纤维蛋 白凝胶，起到固定半月板截面上的细胞的作用。
[0056] (c)、将沉积好半月板截面的滤纸放入培养液中培养1-2天。培养的目的是刚沉积 出的半月板截面上的细胞适应新的环境，可顺利的和培养液进行营养交换，进行生长。培养 液没有特殊要求，可采用常用的牛血清培养液。
[0057] (d)、将多片步骤（c)处理后带有半月板截面700的无菌滤纸及为半月板细胞提供 营养输送的带有营养通道截面的无菌滤纸，叠加组装起来，实现从二维半月板截面到三维 半月板903的制作，如图9所示。半月板基底900和营养通道基底901的数量比为1-10,优 选为1 :1。
[0058] (e)、将三维半月板放入培养液中培养，在半月板外壁培养流道902内通入培养 液，施加流场刺激，模拟实际半月板在流动时所受体内流动剪切及半月板的实际生长环境， 除对半月板施加流场刺激外，也可对半月板施加拉伸及剪切力作用，培养10天后获得活性 半月板。
【权利要求】
1. 一种具有生物活性器官的制造方法，其特征在于，包括： (1) 读取待加工器官的三维模型，对所述三维模型进行分层，得到层文件，读取每层层 文件的结构特征数据； (2) 对于每一个层文件，根据其结构特征数据，分别在多孔基底上制作该层文件对应的 器官截面，得到带有器官截面的器官基底； (3) 对于任意两个相邻的器官截面，在多孔基底上制作该相邻两个器官截面之间的营 养通道截面，得到带有营养通道截面的营养通道基底； (4) 在器官基底上，根据每层层文件的结构特征数据信息，利用三维打印喷头实现细胞 在器官截面上的沉积； (5) 将器官基底和营养通道基底按照次序依次固定，培养，形成具有生物活性器官。
2. 根据权利要求1所述的具有生物活性器官的制造方法，其特征在于，步骤（2) 和步骤（3)中，所述多孔基底为无菌滤纸或多孔薄膜；厚度为0. lmm-lmm，孔径控制为 30 μ m_500 μ m〇
3. 根据权利要求1所述的具有生物活性器官的制造方法，其特征在于，所述器官基底 和营养通道基底的数量比例为1:1-10。
4. 根据权利要求3所述的具有生物活性器官的制造方法，其特征在于，所述器官基底 和营养通道基底的数量比例为1:1。
5. 根据权利要求1所述的具有生物活性器官的制造方法，其特征在于，步骤（4)完成 后，先将沉积好细胞的器官基底放入培养液中培养，1-2天，然后再进行步骤（5)。
6. 根据权利要求1所述的具有生物活性器官的制造方法，其特征在于，步骤（4)中，利 用三维打印喷头实现细胞在器官截面上的沉积时，采用凝胶将细胞包裹打印。
7. 根据权利要求6所述的具有生物活性器官的制造方法，其特征在于，所述凝胶为明 胶；使用时将明胶熔化，混入细胞后，装入喷头，通过二维平台的运动，实现细胞在器官截面 的沉积；然后对沉积后的器官截面降温，使得明胶凝结成凝胶。
8. 根据权利要求6所述的具有生物活性器官的制造方法，其特征在于，所述凝胶为纤 维蛋白凝胶、海藻酸钠凝胶；使用时，将纤维蛋白或海藻酸钠与细胞混合后的溶液装入喷 头，通过二维平台的运动，实现纤维蛋白或海藻酸钠在器官截面上的沉积；然后将沉积后的 器官截面浸入凝血酶溶液或氯化钙溶液中，纤维蛋白形成纤维蛋白凝胶或者海藻酸钠形成 海藻酸钠凝胶。
9. 根据权利要求1所述的具有生物活性器官的制造方法，其特征在于，所述具有生物 活性器官为血管或半月板。
【文档编号】A61F2/06GK104146793SQ201410362702
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年7月28日 优先权日:2014年7月28日
【发明者】贺永, 刘安, 肖箫, 傅建中, 严世贵 申请人:浙江大学