抗人cd52免疫球蛋白的制作方法

抗人cd52免疫球蛋白的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种对人类CD52具有结合特异性的人源化免疫球蛋白、小鼠单克隆抗体及嵌合抗体。本发明进一步涉及一种人源化免疫球蛋白轻链和人源化免疫球蛋白重链。本发明还涉及包含编码人源化免疫球蛋白或免疫球蛋白轻链或重链的序列的分离核酸、重组载体及宿主细胞，并涉及人源化免疫球蛋白的制备方法。该人源化免疫球蛋白可用于治疗用途以治疗，例如，自体免疫疾病、癌症、非何杰金氏淋巴瘤、多发性硬化症及慢性淋巴细胞白血病。
【专利说明】抗人CD52免疫球蛋白
[0001] 本申请是于2010年5月13日提交的、题为"抗人⑶52免疫球蛋白"的中国专利 申请第201080031266. 2号的分案申请。
[0002] 本申请要求于2009年5月13日申请的美国临时申请第61/177, 837号的优先权。 该申请的公开内容完整地引入本文以供参考。

【背景技术】
[0003] ⑶52是一种在各种正常和恶性淋巴样细胞（例如T和B细胞）上大量 (500, 000分子/细胞）发现的糖基化的糖基化磷脂酰肌醇（GPI)-锚定的细胞表面蛋 白。参考，例如，Hale 等人，J Biol regul Homeost Agentsl5:386_391(2001) ;Huh 等 人，Blood92 :Abstract4199 (1998) ;Elsner 等人，Blood88:4684-4693 (1996) ;Gilleece 等 人，Blood82:807-812 (1993) ;Rodig 等人，Clin Cancer Resl2:7174-7179 (2006) ;Ginaldi 等人，Leuk Res22:185-191 (1998)。⑶52在髓样细胞例如单核细胞、巨噬细胞和树突状细 胞上以较低水平表达，并且发现在成熟自然杀手（NK)细胞、嗜中性粒细胞和造血干细胞上 几乎不表达。Id.⑶52也由附睾及输精管中的上皮细胞产生，并由精子在通过生殖道期间 获得（Hale 等人，2001，上文；Domagala 等人，Med Sci Monit7:325-331 (2001))。CD52 的确切生物功能仍不清楚，但一些证据暗示其可能涉及T细胞迁移和共刺激（Rowan等 人，Int Immunol7:69-77 (1995) ;Masuyama 等人，J Exp Medl89:979-989 (1999) ;Watanabe 等人，Clin Immunol 120:247-259 (2006))。
[0004] Campath-1H'-(阿仑单抗（alemtuzumab)，Campath'*, MabCampath* )是一 种人源化抗人CD52单克隆抗体，其显现有效力的体外细胞毒作用（抗体依赖性细胞介导 的细胞毒性（ADCC)和补体依赖的细胞毒性（⑶C))。CiimpmhK'识别由成熟⑶52蛋白的 羧基端四个氨基酸及带负电的GPI锚区的一部分所构成的表位。因为其显著的细胞毒作 用，Campath?能够在体内消减⑶52阳性细胞，并且其已被批准用于慢性淋巴细胞白血病 (CLL)的一线及三线治疗。已对Campat:h_&在治疗数种自身免疫疾病包括类风湿性关节 炎、血管炎、肌炎和Wegener's疾病中的效用进行了评价。然而，Campath?的最先进研究 在于治疗复发缓解型多发性硬化症（MS)。相对于活性对照（Rebif? (即干扰素 β-la))， 这些研究显示出对复发时间的显著改善。
[0005] 存在对额外治疗剂和靶向⑶52的途径的需求。


【发明内容】

[0006] 人源化免疫球蛋白
[0007] 本发明涉及一种对人类CD52(huCD52)具有结合特异性的人源化免疫球蛋白。其 可包括鼠抗人CD52抗体的互补决定区（CDRs)。本发明的人源化免疫球蛋白具有与其它人 源化免疫球蛋白不同，并且特别是与包括鼠抗人CD52抗体的CDRs的其它人源化免疫球蛋 白不同的氨基酸序列。本发明的人源化免疫球蛋白与人源化免疫球蛋白Campath?不同。 在一些实施方式中，它们提供超过含有Camptulr.ir的⑶RS的人源化抗体的优点。
[0008] 本文所述的人源化免疫球蛋白可包括人源化重链和人源化轻链。在一个实施方式 中，人源化免疫球蛋白包括含有SEQ ID N0 :3的一个或多个⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs)的 轻链和含有SEQ ID N0:16的一个或多个⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs)的重链；含有SEQ ID N0:4的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的轻链和含有SEQIDN0:17的一个或多个 ⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs)的重链；含有SEQ ID NO :5的一个或多个⑶Rs (例如，所有三 个⑶Rs)的轻链和含有SEQ ID N0:18的一个或多个⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs)的重链； 含有SEQ ID N0:6的一个或多个⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs)的轻链和含有SEQ ID N0:19 的一个或多个⑶Rs的重链；含有SEQ ID NO :7的一个或多个⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs) 的轻链和含有SEQ ID NO :20的一个或多个⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs)的重链；含有SEQ ID N0:8的一个或多个CDRs (例如，所有三个CDRs)的轻链和含有SEQ ID N0:21的一个或 多个CDRs (例如，所有三个CDRs)的重链；含有SEQ ID N0 :9的一个或多个CDRs (例如，所 有三个⑶Rs)的轻链和含有SEQ ID N0 :22的一个或多个⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs)的 重链；含有SEQ ID N0:10的一个或多个⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs)的轻链和含有SEQ ID NO :23的一个或多个CDRs (例如，所有三个CDRs)的重链；含有SEQ ID NO : 11的一个或多 个⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs)的轻链和含有SEQ ID N0:24的一个或多个⑶Rs (例如，所有 三个⑶Rs)的重链；含有SEQ ID N0 :12的一个或多个⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs)的轻链 和含有SEQ ID N0:25的一个或多个⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs)的重链；含有SEQ ID N0: 12的一个或多个⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs)的轻链和含有SEQ ID NO :137的一个或多个 ⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs)的重链；或含有SEQ ID NO :13的一个或多个⑶Rs (例如，所有 三个⑶Rs)的轻链和含有SEQ ID N0:26的一个或多个⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs)的重链 序列。上述SEQ ID NOs中的⑶Rs由图2和图3指出并且在本文提供的表1-6中提及。
[0009] 在另一个实施方式中，对人CD52具有结合特异性的人源化免疫球蛋白包括轻链， 其含有一个或多个（例如，所有三个）选自SEQ ID N0:27、SEQ ID N0:28、SEQ ID N0:29、 SEQ ID N0:30、SEQ ID N0:31、SEQ ID N0:32、SEQ ID N0:33、SEQ ID N0:34、SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO ：36, SEQ ID NO ：37, SEQ ID NO ：38, SEQ ID NO ：39, SEQ ID NO ：40, SEQ ID NO :41、SEQ ID NO :42、SEQ ID NO :43、SEQ ID NO :44、SEQ ID NO :45、SEQ ID NO :46、SEQ ID NO :47和SEQ ID NO :48的⑶Rs ;以及重链，其含有一个或多个（例如，所有三个）选自 SEQ ID N0：49,SEQ ID N0：50,SEQ ID N0：5USEQ ID N0：52,SEQ ID N0：53,SEQ ID NO： 54、SEQ ID NO :55、SEQ ID NO :56、SEQ ID NO :57、SEQ ID NO :58、SEQ ID NO :59、SEQ ID NO :60、SEQ ID NO :61、SEQ ID NO :62、SEQ ID NO :63、SEQ ID NO :64、SEQ ID NO :65、SEQ ID NO ：66, SEQ ID NO ：67, SEQ ID NO ：68, SEQ ID NO ：69, SEQ ID NO ：70, SEQ ID NO ：7U SEQ ID NO :72、SEQ ID NO :73、SEQ ID NO :74 和 SEQ ID NO :294 的 CDRs ;或此种轻链和此 种重链；其中该人源化免疫球蛋白不是CampathiL
[0010] 在另一个实施方式中，对人CD52具有结合特异性的人源化免疫球蛋白包括轻链， 其含有SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0: 8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :12 或 SEQ ID NO :13 的一个或 多个 CDRs (例如，所有三个 CDRs);重链，其含有 SEQ ID N0:16、SEQ ID N0:17、SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO ：19, SEQ ID NO ：20, SEQ ID NO ：2U SEQ ID NO ：22, SEQ ID NO ：23, SEQ ID NO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26或SEQIDNO :137的一个或多个CDRs(例如，所有三 个⑶Rs);或此种轻链和此种重链；其中该人源化免疫球蛋白不是Campath?。 toon] 在一些实施方式中，该人源化免疫球蛋白的骨架区相对于免疫球蛋白（由其得到 轻链⑶Rs和重链⑶Rs)的骨架区具有至少50%的同源性。例如，该人源化免疫球蛋白的 骨架区可与生殖系人类免疫球蛋白序列至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少 90 %、至少95 %、至少98 %、至少99 %、或者甚至100 %相同。在一个实施方式中，该人源化 免疫球蛋白的骨架区可衍生自或从IgG人类抗体可变区得到。在另一个实施方式中，CD52 为野生型人CD52。在又一实施方式中，该人源化免疫球蛋白可与阿仑单抗竞争以结合至人 CD52,例如，其可结合至与阿仑单抗所要结合的表位相同的表位，或是与之重叠的表位。
[0012] 本发明还涉及本发明的人源化免疫球蛋白的人源化轻链。在一个实施方式中，人 源化轻链包括选自 SEQ ID N0 :27、SEQ ID N0 :28、SEQ ID N0 :29、SEQ ID N0 :30、SEQ ID NO :31、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO :33、SEQ ID NO :34、SEQ ID NO :35、SEQ ID NO :36、SEQ ID NO ：37, SEQ ID NO ：38, SEQ ID NO ：39, SEQ ID NO ：40, SEQ ID NO ：4U SEQ ID NO ：42, SEQ ID NO :43、SEQ ID NO :44、SEQ ID NO :45、SEQ ID NO :46、SEQ ID NO :47、和 SEQ ID NO :48、或其组合的一个或多个⑶Rs，其中人源化轻链不是Campath?的人源化轻链。
[0013] 在另一个实施方式中，人源化轻链包括SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID N0 :5、 SEQ ID NO ：6, SEQ ID NO ：7, SEQ ID NO ：8, SEQ ID NO ：9, SEQ ID NO ：10, SEQ ID NO ：1U SEQ ID NO :12或SEQ ID NO :13的一个或多个CDRs (例如，所有三个CDRs)，其中该人源化 轻链不是的人源化轻链。
[0014] 本发明还涉及本发明的人源化免疫球蛋白的人源化重链。在一个实施方式中，人 源化重链包括选自 SEQ ID N0 :49、SEQ ID N0 :50、SEQ ID N0 :51、SEQ ID N0 :52、SEQ ID NO :53、SEQ ID NO :54、SEQ ID NO :55、SEQ ID NO :56、SEQ ID NO :57、SEQ ID NO :58、SEQ ID NO :59、SEQ ID NO :60、SEQ ID NO :61、SEQ ID NO :62、SEQ ID NO :63、SEQ ID NO :64、 SEQ ID NO ：65, SEQ ID NO ： 66, SEQ ID N0：67,SEQ ID NO ： 68, SEQ ID N0：69,SEQ ID NO： 70、SEQIDN0:71、SEQIDN0:72、SEQIDN0:73、SEQIDN0 :74、和SEQIDN0:294、或其 组合的ig可变域的一个或多个⑶Rs，其中该人源化重链不是Campath?的人源化重链。
[0015] 在其它实施方式中，该人源化重链包括SEQ ID NO :16、SEQ ID NO :17、SEQ ID N0 : 18、SEQ ID NO : 19、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :23、SEQ ID N0:24、SEQIDN0:25、SEQIDN0:26、或SEQIDN0 :137的一个或多个CDRs(例如，所有三 个⑶Rs),其中该人源化重链不是Campath?的人源化重链。
[0016] 优选地，本发明的人源化免疫球蛋白包括本发明的人源化轻链和本发明的人源化 重链二者。
[0017] 在其它实施方式中，本发明提供一种人源化免疫球蛋白，该人源化免疫球蛋白结 合至人CD52上的与小鼠单克隆抗体所结合表位相同的表位或与小鼠单克隆抗体竞争或与 其交叉竞争，该小鼠单克隆抗体包括SEQ ID N0 :3的轻链可变区和SEQ ID N0 :16的重链可 变区；SEQ ID NO :4的轻链可变区和SEQ ID NO :17的重链可变区；SEQ ID NO :5的轻链可 变区和SEQ ID NO :18的重链可变区；SEQ ID NO :6的轻链可变区和SEQ ID NO :19的重链 可变区；SEQ ID NO :7的轻链可变区和SEQ ID NO :20的重链可变区；SEQ ID NO :8的轻链 可变区和SEQ ID NO :21的重链可变区；SEQ ID NO :9的轻链可变区和SEQ ID NO :22的重 链可变区；SEQ ID NO :10的轻链可变区和SEQ ID NO :23的重链可变区；SEQ ID NO :11的 轻链可变区和SEQ ID NO :24的重链可变区；SEQ ID NO :12的轻链可变区和SEQ ID NO :25 的重链可变区；或SEQ ID NO :13的轻链可变区和SEQ ID NO :26的重链可变区。在其它实 施方式中，人源化免疫球蛋白结合至人CD52上的表位，该表位与这样的小鼠单克隆抗体所 结合的表位重叠。
[0018] 在其它实施方式中，本发明提供一种结合至人⑶52(例如，SEQ ID NO :104)上的 表位的人源化免疫球蛋白，其包括至少成熟人类CD52序列的残基1 (其中残基1是成熟人 类CD52序列的N端，S卩，N端甘氨酸[G]残基；参见图4)。该人源化免疫球蛋白可结合至 包括至少成熟人类CD52序列的残基1、3、4和5的表位（这些残基分别是甘氨酸[G]、天冬 酰胺[N]、天冬氨酸[D]、和苏氨酸[T])。该人源化免疫球蛋白可结合至包括至少成熟人类 CD52序列的残基1、2、3、4和5的表位（这些残基分别为甘氨酸[G]、谷氨酰胺[Q]、天冬酰 胺[N]、天冬氨酸[D]、及苏氨酸[T])。在其它实施方式中，本发明提供一种结合至人CD52 上的表位的人源化免疫球蛋白，该表位包括至少成熟人类⑶52序列的残基7、8和9(这些 残基分别为谷氨酰胺[Q]、苏氨酸[T]、和丝氨酸[S])。在一些实施方式中，表位包括至少成 熟人类CD52序列的残基7 (Q)、8 (T)和11 (P)。在一些实施方式中，表位包括至少成熟人类 CD52序列的残基4 (D)和11 (P)。
[0019] 在一些实施方式中，本发明提供一种结合至人CD52的人源化免疫球蛋白，其包括 含有选自 SEQ ID N0:115、SEQ ID N0:118、和 SEQ ID N0:121 的一个或多个 CDRs (例如， 所有三个所述⑶Rs)的轻链，或含有选自SEQ ID NO :124、SEQ ID NO :127、和SEQ ID NO: 130的一个或多个⑶Rs (例如，所有三个所述⑶Rs)的重链，或此种轻链和此种重链二者。 在其它实施方式中，本发明提供一种结合至人CD52的人源化免疫球蛋白，且其包括含有选 自 SEQ ID N0:116、SEQ ID N0:119、和 SEQ ID N0:122 的一个或多个 CDRs(例如，所有三 个所述 CDRs)的轻链，或含有选自 SEQ ID NO: 125、SEQ ID NO: 128、和 SEQ ID NO :131 的 一个或多个⑶Rs (例如，所有三个所述⑶Rs)的重链，或此种轻链和重链二者。在进一步的 实施方式中，本发明提供一种结合至人CD52的人源化免疫球蛋白，且其包括含有选自SEQ ID N0:117、SEQ ID N0:120、和SEQ ID N0:123的一个或多个CDRs(例如，所有三个所述 CDRs)的轻链，或含有选自 SEQ ID N0:126、SEQ ID N0:129、和 SEQ ID N0:132 的一个或多 个⑶Rs (例如，所有三个所述⑶Rs)的重链，或此种轻链和此种重链二者。
[0020] 在某些实施方式中，人源化免疫球蛋白包括含有SEQ ID N0 :115、SEQ ID N0 :118 和 SEQ ID NO :121 的 CDRs 的轻链，以及含有 SEQ ID NO :124、SEQ ID NO :127 和 SEQ ID NO: 130的⑶Rs的重链。在其它实施方式中，人源化免疫球蛋白包括含有SEQ ID NO :116、SEQ ID NO :119 和 SEQ ID NO :122 的 CDRs 的轻链，以及含有 SEQ ID NO :125、SEQ ID NO :128 和 SEQ ID NO :131的⑶Rs的重链。在其它实施方式中，人源化免疫球蛋白包括含有SEQ ID NO :117、SEQ ID NO :120 和 SEQ ID NO :123 的 CDRs 的轻链，以及含有 SEQ ID NO : 126、SEQ ID NO :129 和 SEQ ID NO :132 的 CDRs 的重链。
[0021] 本发明的人源化免疫球蛋白与人源化免疫球蛋白Campath?不同。
[0022] 上述SEQ ID NOs :115-132的氨基酸序列提供于下文，并且是基于本文他处提供的 表1-6中所报告的氨基酸序列。在这些氨基酸序列中，"X"表示任意氨基酸，且符号"/"表 示相邻该符号的氨基酸的其中一个（或任一个）可存在于所指出位置（例如，K/R表示赖 氨酸或精氨酸残基存在于所指出位置，F/L/V指出苯丙氨酸、亮氨酸或缬氨酸残基存在于所 指出位置）。
[0023] 轻链CDR-1序列
[0024] K/RSSQSLL/V/IXS/TN/DGXS/TYLX(SEQ ID NO ： 115)
[0025] K/RSSQSLL/V/IHS/TNGXS/TYLH(SEQ ID NO ： 116)
[0026] RSSQSLVHTNGNS/TYLH(SEQ ID NO： 117)
[0027] 轻链CDR-2序列
[0028] XVSXXXS(SEQ ID NO ：118)
[0029] XVSXRXS(SEQ ID NO ：119)
[0030] MVSXRFS(SEQ ID NO ：120)
[0031] 轻链CDR-3序列
[0032] XQXXH/R/KF/L/V/IXX(SEQ ID NO： 121)
[0033] SQSXH/R/KF/L/V/IPX(SEQ ID NO： 122)
[0034] SQSXHVPF/P(SEQ ID NO： 123)
[0035] 重链CDR-1序列
[0036] GFXFXXYff/YMX(SEQ ID NO： 124)
[0037] GFTFXXYff/YMX(SEQ ID NO： 125)
[0038] GFTFTDYff/YMS(SEQ ID NO： 126)
[0039] 重链CDR-2序列
[0040] XIRXKXBXYXTXYXXSVKG(SEQ ID NO： 127)
[0041] XIRXKXNXYTTEYXXSVKG(SEQ ID NO： 128)
[0042] FIRNKANGYTTEYXXSVKG(SEQ ID NO： 129)
[0043] 重链CDR-3序列
[0044] TXXXY/F/ff(SEQ ID NO： 130)
[0045] TRYXY/F/WFDY(SEQ ID NO： 131)
[0046] TRYIF/WFDY(SEQ ID NO： 132)
[0047] 本发明还涉及一种人源化轻链，其含有选自SEQ ID NO :115、SEQ ID NO :118、和 SEQ ID NO :121的一个或多个⑶Rs(例如，所有三个该⑶Rs);-种人源化轻链，其含有选自 SEQ ID N0:116、SEQ ID N0:119、和 SEQ ID N0:122 的一个或多个 CDRs (例如，所有三个该 CDRs);或一种人源化轻链，其含有选自 SEQ ID N0:117、SEQ ID N0:120、和SEQ ID N0:123 的一个或多个⑶Rs (例如，所有三个该⑶Rs)。
[0048] 本发明还涉及一种人源化重链，其含有选自SEQ ID N0 :124、SEQ ID N0 :127、和 SEQ ID NO :130的一个或多个⑶Rs(例如，所有三个该⑶Rs);-种人源化重链，其含有选自 SEQ ID N0:125、SEQ ID N0:128、和 SEQ ID N0:131 的一个或多个 CDRs (例如，所有三个该 CDRs);或一种人源化重链，其含有选自 SEQ ID NO :126、SEQ ID NO :129、和SEQ ID NO :132 的一个或多个⑶Rs (例如，所有三个该⑶Rs)。
[0049] 本发明的人源化轻链和人源化重链与人源化免疫球蛋白Campath?的人源化轻 链和人源化重链不同。
[0050] 在本发明的一些实施方式中，本发明的人源化免疫球蛋白（不考虑它们可能被另 外限定的方式，例如，不考虑它们是否也以其CDRs的一个或多个的序列的方式来限定和/ 或通过它们与小鼠单克隆抗体或另一人源化免疫球蛋白的交叉反应性来限定）：（1)显示 出结合至糖基化和去糖基化CD52而无明显偏好；（2)显示出对糖基化CD52的特异性结合； (3)显示出对去糖基化CD52的特异性结合；或（4)相对于糖基化CD52显示出对去糖基化 者的结合偏好。在某些实施方式中，本发明的人源化免疫球蛋白对糖基化的人CD52相比于 对非糖基化或去糖基化的人CD52具有更高的结合亲和性。的确，在本发明的某些实施方式 中，本发明的人源化免疫球蛋白显示出对糖基化的人CD52的特异性结合。对非糖基化或去 糖基化的人CD52的结合亲和性可使用已经用糖苷酶，例如使用内切糖苷酶PNGase-F去糖 基化的成熟人类CD52来确定。在本发明的某些实施方式中，本发明的人源化免疫球蛋白结 合至包含其N-连接的碳水化合物部分的成熟人类CD52上的表位。此碳水化合物部分是一 种唾液酸化的、含聚乳糖胺的核心岩藻糖化的四天线型N-连接的低聚糖（Treumann，A.等 人，（1995) J. Biol. Chem. 270:6088-6099)。此表位也可包含至少成熟人类CD52序列的残基 1，至少成熟人类⑶52序列的残基3,至少成熟人类⑶52序列的残基1、3、4和5,或至少成 熟人类CD52序列的残基1、2、3、4和5。在一些实施方式中，本发明的鼠或嵌合抗体可具任 意这些结合特征。
[0051] 还提供如在本文他处所定义的编码本发明的人源化免疫球蛋白、人源化轻链或人 源化重链的分离的核酸分子。在一些实施方式中，本发明为一种（一个或多个）分离的核 酸分子，其编码人源化重链和人源化轻链（其结合在一起形成对人CD52具有结合特异性的 人源化免疫球蛋白），其中人源化轻链包含SEQ ID N0 :3的一个或多个⑶Rs (例如，所有三 个⑶Rs)且重链包含SEQ ID N0 :16的一个或多个⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs);包含SEQ ID N0 :4的一个或多个⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs)的轻链和包含SEQ ID N0:17的一个或 多个CDRs (例如，所有三个CDRs)的重链；包含SEQ ID N0 :5的一个或多个CDRs (例如，所 有三个⑶Rs)的轻链和包含SEQ ID N0:18的一个或多个⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs)的 重链；包含SEQ ID N0:6的一个或多个⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs)的轻链和包含SEQ ID NO :19的一个或多个⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs)的重链；包含SEQ ID NO :7的一个或多个 ⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs)的轻链和包含SEQ ID N0:20的一个或多个⑶Rs (例如，所有三 个⑶Rs)的重链；包含SEQ ID N0:8的一个或多个⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs)的轻链和包 含SEQ ID N0 :21的一个或多个CDRs(例如，所有三个CDRs)的重链；包含SEQ ID N0 :9的一 个或多个⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs)的轻链和包含SEQ ID N0 :22的一个或多个⑶Rs (例 如，所有三个⑶Rs)的重链；包含SEQ ID N0:10的一个或多个⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs) 的轻链和包含SEQ ID NO :23的一个或多个⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs)的重链；包含SEQ ID NO :11的一个或多个⑶Rs(例如，所有三个⑶Rs)的轻链和包含SEQ ID NO :24的一个 或多个⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs)的重链；包含SEQ ID NO :12的一个或多个⑶Rs(例如， 所有三个⑶Rs)的轻链和包含SEQ ID N0:25的一个或多个⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs)的 重链；包含SEQ ID N0:12的一个或多个⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs)的轻链和包含SEQ ID NO :137的一个或多个⑶Rs(例如，所有三个⑶Rs)的重链；或包含SEQ ID NO :13的一个或 多个⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs)的轻链和包含SEQ ID NO :26的一个或多个⑶Rs (例如， 所有三个CDRs)的重链序列。
[0052] 在一些实施方式中，本发明是一个或多个分离的核酸分子，其编码人源化重链和 人源化轻链（其结合在一起形成对人CD52具有结合特异性的人源化免疫球蛋白），其中该 人源化免疫球蛋白结合至与小鼠单克隆抗体所结合的人CD52上的表位相同的表位，该小 鼠单克隆抗体包含SEQ ID N0:3的轻链可变区和SEQ ID N0:16的重链可变区；SEQ ID N0: 4的轻链可变区和SEQ ID NO :17的重链可变区；SEQ ID NO :5的轻链可变区和SEQ ID NO: 18的重链可变区；SEQ ID NO :6的轻链可变区和SEQ ID NO :19的重链可变区；SEQ ID NO :7 的轻链可变区和SEQ ID NO :20的重链可变区；SEQ ID NO :8的轻链可变区和SEQ ID NO :21 的重链可变区；SEQ ID NO :9的轻链可变区和SEQ ID NO :22的重链可变区；SEQ ID NO :10 的轻链可变区和SEQ ID NO :23的重链可变区；SEQ ID NO :11的轻链可变区和SEQ ID NO : 24的重链可变区；SEQ ID NO :12的轻链可变区和SEQ ID NO :25的重链可变区；或SEQ ID NO :13的轻链可变区和SEQ ID NO :26的重链可变区。在其它实施方式中，本发明是一个或 多个分离的核酸分子，其编码人源化重链和人源化轻链（其结合在一起而形成对人CD52具 有结合特异性的人源化免疫球蛋白），其中该人源化免疫球蛋白结合至人CD52上的表位， 此表位与这样的小鼠单克隆抗体所结合的表位重叠。
[0053] 在其它实施方式中，本发明是一个或多个分离的核酸分子，其编码人源化重链和 人源化轻链（其结合在一起而形成对人CD52具有结合特异性的人源化免疫球蛋白），其中 该人源化免疫球蛋白结合至包含至少成熟人CD52的残基1的表位；该人源化免疫球蛋白结 合至包含至少成熟人⑶52的残基1、3、4和5的表位；该人源化免疫球蛋白结合至包含至少 成熟人CD52的残基1、2、3、4和5的表位；或者该人源化免疫球蛋白结合至包含至少成熟人 ⑶52的残基7、8和9的表位。在一些实施方式中，该表位包含至少成熟人类⑶52序列的残 基7、8和11。在一些实施方式中，该表位包含至少成熟人类⑶52序列的残基4和11。
[0054] 在其它实施方式中，本发明是一个或多个分离的核酸分子，其编码人源化重链和 人源化轻链（其结合在一起而形成对人CD52具有结合特异性的人源化免疫球蛋白），其中 该人源化免疫球蛋白包括：包含选自SEQ ID N0:115、SEQ ID N0:118、和SEQ ID N0:121的 一个或多个CDRs(例如，所有三个该CDRs)的轻链，和/或包含选自SEQ ID NO :124、SEQ ID NO :127、和SEQ ID NO :130的一个或多个CDRs (例如，所有三个该CDRs)的重链；包含选自 SEQ ID N0:116、SEQ ID N0:119、和 SEQ ID N0:122 的一个或多个 CDRs (例如，所有三个该 CDRs)的轻链，和 / 或包含选自 SEQ ID NO :125、SEQ ID NO :128、和 SEQ ID NO :131 的一个 或多个CDRs(例如，所有三个该CDRs)的重链；或者，包含选自SEQ ID NO :117、SEQ ID NO: 120、和SEQ ID NO :123的一个或多个⑶Rs (例如，所有三个该⑶Rs)的轻链，和/或包含选 自 SEQ ID N0:126、SEQ ID N0:129、和 SEQ ID N0:132 的一个或多个CDRs(例如，所有三个 该⑶Rs)的重链。
[0055] 在某些实施方式中，本发明是一个或多个分离的核酸分子，其编码人源化重链和 人源化轻链（其结合在一起而形成对人CD52具有结合特异性的人源化免疫球蛋白），其中 该人源化免疫球蛋白包括，包含SEQ ID N0:115、SEQ ID N0:118和SEQ ID N0:121的CDRs 的轻链，以及包含SEQ ID NO : 124、SEQ ID NO :127和SEQ ID NO :130的CDRs的重链；包含 SEQ ID NO :116、SEQ ID NO :119 和 SEQ ID NO :122 的 CDRs 的轻链，以及包含 SEQ ID NO : 125、SEQIDNO:128和SEQIDNO:131的CDRs的重链；或包含SEQIDNO :117、SEQIDNO: 120 和 SEQ ID NO :123 的 CDRs 的轻链，以及包含 SEQ ID NO :126、SEQ ID NO :129 和 SEQ ID NO :132的CDRs的重链。
[0056] 本发明的该一个或多个核酸不编码人源化免疫球蛋白CampaUrJi::.:..
[0057] 在其它实施方式中，本发明是一个或多个分离的核酸分子，其编码人源化重链和 人源化轻链（其结合在一起而形成对人CD52具有结合特异性的人源化免疫球蛋白），其中 该人源化免疫球蛋白对糖基化的人CD52相比于对非糖基化或去糖基化的人CD52具有更大 的结合亲和性，例如，显现出对糖基化的人CD52的特异性结合。人源化免疫球蛋白可结合 至包含其N-连接的碳水化合物部分的成熟人CD52上的表位。此表位也可包含至少成熟人 类CD52序列的残基1，至少成熟人类CD52序列的残基3，至少成熟人类CD52序列的残基1、 3、4和5,或是至少成熟人类⑶52序列的残基1、2、3、4和5。
[0058] 在其它实施方式中，本发明是一种分离的核酸分子，其编码人源化轻链，该人源化 轻链包含 SEQ ID N0 :3、SEQ ID N0 :4、SEQ ID N0 :5、SEQ ID N0 :6、SEQ ID N0 :7、SEQ ID N0:8、SEQIDN0:9、SEQIDN0:10、SEQIDN0 :11、SEQIDN0:12或SEQIDN0:13的一个 或多个CDRs (例如，所有三个该CDRs),其中该人源化轻链不是Campath?的人源化轻链。
[0059] 在其它实施方式中，本发明是一种分离的核酸分子，其编码人源化重链，该人源化 重链包含 SEQ ID N0 :16、SEQ ID N0 :17、SEQ ID N0 :18、SEQ ID N0 :19、SEQ ID N0 :20、 SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:22、SEQ ID N0:23、SEQ ID N0:24、SEQ ID N0:25、SEQ ID NO: 26、或SEQ ID NO :137的一个或多个⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs)，其中该人源化重链不是 Campath?的人源化重链。
[0060] 在其它实施方式中，本发明是一种分离的核酸分子，其编码人源化轻链，该人源化 轻链包含选自 SEQ ID N0 :27、SEQ ID N0 :28、SEQ ID N0 :29、SEQ ID N0 :30、SEQ ID N0 : 31、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO :33、SEQ ID NO :34、SEQ ID NO :35、SEQ ID NO :36、SEQ ID NO：37,SEQ ID NO：38,SEQ ID NO：39,SEQ ID NO：40,SEQ ID NO ：4U SEQ ID NO ：42,SEQ ID N0:43、SEQ ID N0:44、SEQ ID N0:45、SEQ ID N0:46、SEQ ID N0:47、和 SEQ ID N0:48 或其组合的一个或多个CDRs，其中该人源化轻链不是CampathP的人源化轻链。
[0061] 在其它实施方式中，本发明是一种分离的核酸分子，其编码人源化重链，该人源化 重链包含选自 SEQ ID N0 :49、SEQ ID N0 :50、SEQ ID N0 :51、SEQ ID N0 :52、SEQ ID N0 : 53、SEQ ID NO :54、SEQ ID NO :55、SEQ ID NO :56、SEQ ID NO :57、SEQ ID NO :58、SEQ ID NO :59、SEQ ID NO :60、SEQ ID NO :61、SEQ ID NO :62、SEQ ID NO :63、SEQ ID NO :64、SEQ ID NO ：65, SEQ ID NO ：66, SEQ ID NO ：67, SEQ ID NO ：68, SEQ ID NO ：69, SEQ ID NO ：70, SEQIDN0:71、SEQIDN0:72、SEQIDN0:73、SEQIDN0 :74、和SEQIDN0:294、或其组合 的一个或多个⑶Rs,其中该人源化重链不是Campath?的人源化重链。
[0062] 在其它实施方式中，本发明是一种分离的核酸分子，其编码包含选自SEQ ID N0 : 115、SEQ ID N0:118、和SEQ ID N0:121的一个或多个CDRs(例如，所有三个该CDRs)的 人源化轻链；包含选自SEQ ID NO :116、SEQ ID NO :119、和SEQ ID NO :122的一个或多个 CDRs(例如，所有三个该CDRs)的人源化轻链；或包含选自SEQ ID N0:117、SEQ ID N0:120、 和SEQ ID NO :123的一个或多个⑶Rs (例如，所有三个该⑶Rs)的人源化轻链。
[0063] 在其它实施方式中，本发明是一种分离的核酸分子，其编码包含选自SEQ ID N0 : 124、SEQ ID NO :127、和SEQ ID NO :130的一个或多个CDRs(例如，所有三个该CDRs)的 人源化重链；包含选自SEQ ID NO : 125、SEQ ID NO : 128、和SEQ ID NO :131的一个或多个 CDRs(例如，所有三个该CDRs)的人源化重链；或包含选自SEQ ID NO :126、SEQ ID NO :129、 和SEQ ID NO :132的一个或多个⑶Rs (例如，所有三个该⑶Rs)的人源化重链。
[0064] 本发明还涉及一种重组载体（例如，表达载体，包括哺乳动物细胞表达载体），其 包含编码本发明的人源化免疫球蛋白（例如，人源化轻链和人源化重链）、人源化轻链、或 人源化重链的核酸。在一些实施方式中，本发明为一种重组载体，其包含编码人源化免疫球 蛋白的核酸，该人源化免疫球蛋白包含含有SEQ ID N0 :3的一个或多个⑶Rs(例如，所有三 个⑶Rs)的轻链和含有SEQ ID N0:16的一个或多个⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs)的重链；含 有SEQ ID N0 :4的一个或多个CDRs (例如，所有三个CDRs)的轻链和含有SEQ ID N0:17的 一个或多个⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs)的重链；含有SEQ ID NO :5的一个或多个⑶Rs (例 如，所有三个⑶Rs)的轻链和含有SEQ ID N0:18的一个或多个⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs) 的重链；含有SEQ ID NO :6的一个或多个⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs)的轻链和含有SEQ ID NO :19的一个或多个CDRs (例如，所有三个CDRs)的重链；含有SEQ ID NO :7的一个或 多个⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs)的轻链和含有SEQ ID N0 :20的一个或多个⑶Rs (例如， 所有三个⑶Rs)的重链；含有SEQ ID N0 :8的一个或多个⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs)的 轻链和含有SEQ ID N0:21的一个或多个⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs)的重链；含有SEQ ID NO :9的一个或多个⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs)的轻链和含有SEQ ID NO :22的一个或多 个⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs)的重链；含有SEQ ID NO :10的一个或多个⑶Rs (例如，所 有三个⑶Rs)的轻链和含有SEQ ID N0 :23的一个或多个⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs)的 重链；含有SEQ ID N0:11的一个或多个⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs)的轻链和含有SEQ ID NO :24的一个或多个⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs)的重链；含有SEQ ID NO :12的一个或多 个CDRs (例如，所有三个CDRs)的轻链和含有SEQ ID NO :25的一个或多个CDRs (例如，所 有三个⑶Rs)的重链；含有SEQ ID N0 :12的一个或多个⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs)的轻 链和含有SEQ ID N0:137的一个或多个⑶Rs(例如，所有三个⑶Rs)的重链；或含有SEQ ID NO :13的一个或多个⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs)的轻链和含有SEQ ID NO :26的一个或多 个⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs)的重链。
[0065] 在其它实施方式中，重组载体包含编码人源化轻链的核酸，其中该人源化轻链包 含选自 SEQ ID N0 :27、SEQ ID N0 :28、SEQ ID N0 :29、SEQ ID N0 :30、SEQ ID N0 :31、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO :33、SEQ ID NO :34、SEQ ID NO :35、SEQ ID NO :36、SEQ ID NO :37、 SEQ ID NO ：38, SEQ ID N0：39,SEQ ID N0：40,SEQ ID NO ：4U SEQ ID N0：42,SEQ ID NO： 43、SEQ ID NO :44、SEQ ID NO :45、SEQ ID NO :46、SEQ ID NO :47、和 SEQ ID NO :48、或其 组合的一个或多个CDRs,其中该人源化轻链不是Campath?的人源化轻链。
[0066] 在其它实施方式中，重组载体包含编码人源化重链的核酸，其中该人源化重链包 含选自 SEQ ID N0 :49、SEQ ID N0 :50、SEQ ID N0 :51、SEQ ID N0 :52、SEQ ID N0 :53、SEQ ID NO :54、SEQ ID NO :55、SEQ ID NO :56、SEQ ID NO :57、SEQ ID NO :58、SEQ ID NO :59、 SEQ ID N0:60、SEQ ID N0:61、SEQ ID N0:62、SEQ ID N0:63、SEQ ID N0:64、SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO ：66, SEQ ID NO ：67, SEQ ID NO ：68, SEQ ID NO ：69, SEQ ID NO ：70, SEQ ID NO:71、SEQIDNO:72、SEQIDNO:73、SEQIDNO :74、和SEQIDNO:294、或其组合的一个 或多个CDRs，其中该人源化轻链不是C._'ampuih」< 的人源化轻链。
[0067] 在一些实施方式中，本发明提供包含一个核酸分子的一个重组载体，或包含多个 核酸分子的一对重组载体，其编码人源化重链和人源化轻链（其结合在一起而形成对人 CD52具有结合特异性的人源化免疫球蛋白），其中该人源化免疫球蛋白结合至与小鼠单克 隆抗体所结合的人CD52上的表位相同的表位，该小鼠单克隆抗体包含SEQ ID N0 :3的轻链 可变区和SEQ ID N0 :16的重链可变区；SEQ ID N0 :4的轻链可变区和SEQ ID N0 :17的重 链可变区；SEQ ID N0 :5的轻链可变区和SEQ ID N0 :18的重链可变区；SEQ ID N0 :6的轻 链可变区和SEQ ID N0 :19的重链可变区；SEQ ID N0 :7的轻链可变区和SEQ ID N0 :20的 重链可变区；SEQ ID N0 :8的轻链可变区和SEQ ID N0 :21的重链可变区；SEQ ID N0 :9的 轻链可变区和SEQ ID N0 :22的重链可变区；SEQ ID N0 :10的轻链可变区和SEQ ID N0 :23 的重链可变区；SEQ ID NO :11的轻链可变区和SEQ ID NO :24的重链可变区；SEQ ID NO: 12的轻链可变区和SEQ ID NO :25的重链可变区；或SEQ ID NO :13的轻链可变区和SEQ ID NO :26的重链可变区。在其它实施方式中，本发明提供包含一个核酸分子的一个重组载体， 或包含多个核酸分子的一对重组载体，其编码人源化重链和人源化轻链（其结合在一起而 形成对人CD52具有结合特异性的人源化免疫球蛋白），其中该人源化免疫球蛋白结合至人 CD52上的表位，此表位与这样的小鼠单克隆抗体所结合的表位重叠。
[0068] 在其它实施方式中，该重组载体包含一个核酸分子，或一对重组载体包含多个核 酸分子，这些核酸分子编码人源化重链和人源化轻链（其结合在一起而形成对人CD52具 有结合特异性的人源化免疫球蛋白），其中该人源化免疫球蛋白结合至包含至少成熟人类 ⑶52的残基1的表位；结合至包含至少成熟人类⑶52的残基1、3、4和5的表位；结合至包 含至少成熟人类⑶52的残基1、2、3、4和5的表位；或结合至包含至少成熟人类⑶52的残 基7、8和9的表位。在一些实施方式中，该表位包含至少成熟人类⑶52序列的残基7、8和 11。在一些实施方式中，该表位包含至少成熟人类⑶52序列的残基4和11。
[0069] 在一些实施方式中，该重组载体包含一个核酸分子，或一对重组载体包含多个核 酸分子，这些核酸分子编码人源化重链和人源化轻链（其结合在一起而形成对人CD52具 有结合特异性的人源化免疫球蛋白），其中该人源化免疫球蛋白包含含有选自SEQ ID N0: 115、SEQIDN0:118、和SEQIDN0:121的一个或多个CDRs(例如，所有三个该CDRs)的一 种轻链，和/或含有选自SEQIDN0 :124、SEQIDN0:127、和SEQIDN0:130的一个或多个 CDRs(例如，所有三个该CDRs)的一种重链；含有选自SEQ ID N0:116、SEQ ID N0:119、和 SEQ ID NO :122的一个或多个CDRs (例如，所有三个该CDRs)的一种轻链，和/或含有选自 SEQIDN0:125、SEQIDN0:128、和SEQIDN0:131的一个或多个CDRs(例如，所有三个该 CDRs)的一种重链；或含有选自 SEQ ID N0 :117、SEQ ID N0 :120、和 SEQ ID N0 :123 的一 个或多个⑶Rs (例如，所有三个该⑶Rs)的一种轻链，和/或含有选自SEQ ID N0:126、SEQ ID NO :129、和SEQ ID NO :132的一个或多个CDRs(例如，所有三个该CDRs)的一种重链。
[0070] 在某些实施方式中，该重组载体包含一个核酸分子，或一对重组载体包含多个核 酸分子，这些核酸分子编码人源化重链和人源化轻链（其结合在一起而形成对人CD52具有 结合特异性的人源化免疫球蛋白），其中该人源化免疫球蛋白包含含有SEQ ID N0:115、SEQ ID NO :118 和 SEQ ID NO :121 的 CDRs 的轻链，和含有 SEQ ID NO :124、SEQ ID NO :127 和 SEQ ID NO :130 的 CDRs 的重链；含有 SEQ ID NO :116、SEQ ID NO :119 和 SEQ ID NO :122 的 CDRs 的轻链，和含有 SEQ ID NO : 125、SEQ ID NO :128 和 SEQ ID NO :131 的 CDRs 的重链； 或含有 SEQ ID NO :117、SEQ ID NO :120 和 SEQ ID NO :123 的 CDRs 的轻链，和含有 SEQ ID NO : 126、SEQ ID NO :129 和 SEQ ID NO :132 的 CDRs 的重链。
[0071] 在本发明的重组载体中的该一个或多个核酸不编码人源化免疫球蛋白 Campath?〇
[0072] 在其它实施方式中，该重组载体包含一个核酸分子，或一对重组载体包含多个核 酸分子，这些核酸分子编码人源化重链和人源化轻链（其结合在一起而形成对人CD52具有 结合特异性的人源化免疫球蛋白），其中该人源化免疫球蛋白对糖基化的人CD52相比于对 非糖基化或去糖基化的人CD52具有更大的结合亲和性，例如，显现出特异于糖基化人CD52 的结合。人源化免疫球蛋白可结合至包含其N-连接碳水化合物部分的成熟人类CD52上的 表位。此表位也可包含至少成熟人类CD52序列的残基1，至少成熟人类CD52序列的残基 3,至少成熟人类⑶52序列的残基1、3、4和5,或至少成熟人类⑶52序列的残基1、2、3、4和 5 〇
[0073] 在其它实施方式中，该重组载体包含一个核酸分子，其编码包含SEQ ID NO :3、SEQ ID NO ：4, SEQ ID NO ：5, SEQ ID NO ：6, SEQ ID NO ：7, SEQ ID NO ：8, SEQ ID NO ：9, SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :12 或 SEQ ID NO :13 的一个或多个 CDRs(例如，所有三 个该CDRs)的人源化轻链，其中该人源化轻链不是Campath?的人源化轻链。
[0074] 在其它实施方式中，该重组载体包含一个核酸分子，其编码包含SEQ ID N0 :16、 SEQ ID NO ：17, SEQ ID NO： 18, SEQ ID NO： 19, SEQ ID N0：20,SEQ ID N0：2USEQ ID NO： 22、SEQIDN0:23、SEQIDN0:24、SEQIDN0:25、SEQIDN0 :26、或SEQIDN0:137的一个 或多个⑶Rs(例如，所有三个该⑶Rs)的人源化重链，其中该人源化重链不是C'ampiUtr思 的人源化重链。
[0075] 在其它实施方式中，该重组载体包含一个核酸分子，其编码包含选自SEQ ID N0 : 115、SEQ ID N0:118、和SEQ ID N0:121的一个或多个CDRs(例如，所有三个该CDRs)的 人源化轻链；包含选自SEQ ID NO :116、SEQ ID NO :119、和SEQ ID NO :122的一个或多个 CDRs(例如，所有三个该CDRs)的人源化轻链；或包含选自SEQ ID NO :117、SEQ ID NO :120、 和SEQ ID NO :123的一个或多个CDRs (例如，所有三个该CDRs)的人源化轻链，其中该人源 化轻链不是CampadT?的人源化轻链。
[0076] 在其它实施方式中，该重组载体包含一个核酸分子，其编码包含选自SEQ ID N0 : 124、SEQ ID NO :127、和SEQ ID NO :130的一个或多个CDRs(例如，所有三个该CDRs)的 人源化重链；包含选自SEQ ID NO : 125、SEQ ID NO : 128、和SEQ ID NO :131的一个或多个 CDRs (例如，所有三个该CDRs)的人源化重链；或包含选自SEQ ID NO :126、SEQ ID NO :129 和SEQ ID NO :132的一个或多个⑶Rs (例如，所有三个该⑶Rs)的人源化重链，其中该人源 化重链不是Campath?的人源化重链。
[0077] 在特定的实施方式中，本发明的重组载体为表达载体，例如哺乳动物细胞表达载 体。在某些实施方式中，该载体是一种质粒或是病毒载体（例如，腺病毒或AAV载体）。
[0078] 本发明还涉及一种包含编码本发明的人源化免疫球蛋白（人源化轻链和人源化 重链）、人源化轻链或人源化重链的（一个或多个）核酸（例如，重组）的宿主细胞。在一 些实施方式中，宿主细胞包含一种本发明的重组载体（例如，表达载体，包括哺乳动物细胞 表达载体）。
[0079] 在特定的实施方式中，该宿主细胞包含一种编码人源化轻链和人源化重链的核酸 (一个或多个核酸），其中人源化轻链和人源化重链结合在一起而形成对人CD52具有结合 特异性的人源化免疫球蛋白，并且其中该人源化免疫球蛋白包含含有SEQ ID N0 :3的一个 或多个⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs)的轻链和含有SEQ ID N0 :16的一个或多个⑶Rs (例 如，所有三个⑶Rs)的重链；含有SEQ ID N0 :4的一个或多个⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs) 的轻链，和含有SEQ ID NO :17的一个或多个⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs)的重链；含有SEQ ID NO :5的一个或多个⑶Rs(例如，所有三个⑶Rs)的轻链，和含有SEQ ID NO :18的一个或 多个CDRs (例如，所有三个CDRs)的重链；含有SEQ ID NO :6的一个或多个CDRs (例如，所 有三个⑶Rs)的轻链，和含有SEQ ID N0:19的一个或多个⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs)的 重链；含有SEQ ID N0:7的一个或多个⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs)的轻链，和含有SEQ ID NO :20的一个或多个⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs)的重链；含有SEQ ID NO :8的一个或多个 ⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs)的轻链，和含有SEQ ID N0:21的一个或多个⑶Rs (例如，所有 三个⑶Rs)的重链；含有SEQ ID N0 :9的一个或多个⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs)的轻链， 和含有SEQ ID N0:22的一个或多个⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs)的重链；含有SEQ ID N0: 10的一个或多个⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs)的轻链，和含有SEQ ID NO :23的一个或多个 ⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs)的重链；含有SEQ ID NO :11的一个或多个⑶Rs (例如，所有 三个⑶Rs)的轻链，和含有SEQ ID N0:24的一个或多个⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs)的重 链；含有SEQ ID N0:12的一个或多个⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs)的轻链，和含有SEQ ID NO :25的一个或多个CDRs (例如，所有三个CDRs)的重链；含有SEQ ID NO :12的一个或多 个⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs)的轻链，和含有SEQ ID NO :137的一个或多个⑶Rs(例如， 所有三个⑶Rs)的重链；或含有SEQ ID N0 :13的一个或多个⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs) 的轻链，和含有SEQ ID NO :26的一个或多个⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs)的重链序列。
[0080] 在一些实施方式中，该宿主细胞包含编码人源化重链和人源化轻链的一个或多个 核酸分子，其中人源化轻链和人源化重链结合在一起而形成对人CD52具有结合特异性的 人源化免疫球蛋白，其中该人源化免疫球蛋白结合至与小鼠单克隆抗体所结合的人CD52 上的表位相同的表位，该小鼠单克隆抗体包含SEQ ID N0 :3的轻链可变区和SEQ ID N0 :16 的重链可变区；SEQ ID NO :4的轻链可变区和SEQ ID NO :17的重链可变区；SEQ ID NO :5 的轻链可变区和SEQ ID NO :18的重链可变区；SEQ ID NO :6的轻链可变区和SEQ ID NO: 19的重链可变区；SEQ ID NO :7的轻链可变区和SEQ ID NO :20的重链可变区；SEQ ID NO : 8的轻链可变区和SEQ ID NO :21的重链可变区；SEQ ID NO :9的轻链可变区和SEQ ID NO: 22的重链可变区；SEQ ID NO :10的轻链可变区和SEQ ID NO :23的重链可变区；SEQ ID NO: 11的轻链可变区和SEQ ID NO :24的重链可变区；SEQ ID NO :12的轻链可变区和SEQ ID NO :25的重链可变区；或SEQ ID NO :13的轻链可变区和SEQ ID NO :26的重链可变区。在 其它实施方式中，该宿主细胞包含编码人源化重链和人源化轻链的一个或多个核酸分子， 其中人源化轻链和人源化重链结合在一起而形成对人CD52具有结合特异性的人源化免疫 球蛋白，其中该人源化免疫球蛋白结合至人CD52上的与此种小鼠单克隆抗体所结合的表 位重叠的表位。
[0081] 在其它实施方式中，该宿主细胞包含编码人源化重链和人源化轻链的一个或多个 核酸分子，其中人源化轻链和人源化重链结合在一起而形成对人CD52具有结合特异性的 人源化免疫球蛋白，其中该人源化免疫球蛋白结合至包含至少成熟人类CD52的残基1的 表位；结合至包含至少成熟人类CD52的残基1、3、4和5的表位；结合至包含至少成熟人类 ⑶52的残基1、2、3、4和5的表位；或者结合至包含至少成熟人类⑶52的残基7、8和9的 表位。在一些实施方式中，该表位包含至少成熟人类⑶52序列的残基7、8和11。在一些实 施方式中，该表位包含至少成熟人类⑶52序列的残基4和11。
[0082] 在一些实施方式中，该宿主细胞包含编码人源化重链和人源化轻链的一个或多个 核酸分子，其中人源化轻链和人源化重链结合在一起而形成对人CD52具有结合特异性的 人源化免疫球蛋白，其中该人源化免疫球蛋白包含一种轻链，其含有选自SEQ ID N0 :115、 SEQIDN0:118、和SEQIDN0:121的一个或多个CDRs(例如，所有三个该CDRs)，和/或 一种重链，其含有选自SEQ ID NO: 124、SEQ ID NO: 127、和SEQ ID NO :130的一个或多个 CDRs(例如，所有三个该CDRs); -种轻链，其含有选自SEQ ID N0:116、SEQ ID N0:119、和 SEQ ID NO :122的一个或多个CDRs (例如，所有三个该CDRs)，和/或一种重链，其含有选自 SEQ ID N0:125、SEQ ID N0:128、和 SEQ ID N0:131 的一个或多个 CDRs (例如，所有三个该 CDRs);或一种轻链，其含有选自 SEQ ID NO :117、SEQ ID NO :120、和 SEQ ID NO :123 的一 个或多个⑶Rs (例如，所有三个该⑶Rs)，和/或一种重链，其含有选自SEQ ID N0:126、SEQ ID NO: 129、和SEQ ID NO :132的一个或多个CDRs (例如，所有三个该CDRs)。
[0083] 在一些实施方式中，该宿主细胞包含编码人源化重链和人源化轻链的一个或多个 核酸分子，其中人源化轻链和人源化重链结合在一起而形成对人CD52具有结合特异性的 人源化免疫球蛋白，其中该人源化免疫球蛋白包含含有SEQ ID N0:115、SEQ ID N0:118和 SEQ ID NO :121 的 CDRs 的轻链和含有 SEQ ID NO : 124、SEQ ID NO :127 和 SEQ ID NO :130 的 CDRs 的重链；含有 SEQ ID NO :116、SEQ ID NO :119、和 SEQ ID NO :122 的 CDRs 的轻链 和含有 SEQ ID NO :125、SEQ ID NO :128 和 SEQ ID NO :131 的 CDRs 的重链；或含有 SEQ ID NO :117、SEQ ID NO :120 和 SEQ ID NO :123 的 CDRs 的轻链和含有 SEQ ID NO : 126、SEQ ID NO :129 和 SEQ ID NO :132 的 CDRs 的重链。
[0084] 在其它实施方式中，该宿主细胞包含编码人源化重链和人源化轻链的一个或多个 核酸分子，其中人源化轻链和人源化重链结合在一起而形成对人CD52具有结合特异性的 人源化免疫球蛋白，其中该人源化免疫球蛋白对糖基化的人CD52相比于对非糖基化或去 糖基化的人CD52具有更大的结合亲和性，例如，显现出对糖基化的人CD52特异性结合。人 源化免疫球蛋白可结合至包含其N-连接的碳水化合物部分的成熟人CD52上的表位。此表 位也可包含至少成熟人类CD52序列的残基1，至少成熟人类CD52序列的残基3,至少成熟 人类⑶52序列的残基1、3、4和5,或至少成熟人类⑶52序列的残基1、2、3、4和5。
[0085] 在一些实施方式中，该宿主细胞包含编码人源化轻链的一种核酸分子，该人源化 轻链包含 SEQ ID N0 :3、SEQ ID N0 :4、SEQ ID N0 :5、SEQ ID N0 :6、SEQ ID N0 :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO : 10、SEQ ID NO : 11、SEQ ID NO :12 或 SEQ ID NO :13 的一 个或多个cdrs (例如，所有三个cdrs)。该人源化轻链不是Campath?的人源化轻链。
[0086] 在其它实施方式中，该宿主细胞包含编码人源化重链的一种核酸分子，该人源化 重链包含SEQ ID N0:16、SEQ ID N0:17、SEQ ID N0:18、SEQ ID N0:19、SEQ ID N0:20、SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:22、SEQ ID N0:23、SEQ ID N0:24、SEQ ID N0:25、SEQ ID N0:26、或 seq id no :137的一个或多个cdrs(例如，所有三个cdrs)。该人源化重链不是Campath? 的人源化重链。
[0087] 在一些实施方式中，该宿主细胞包含编码人源化轻链的一种核酸，其中该人源化 轻链包含选自 SEQ ID N0 :27、SEQ ID N0 :28、SEQ ID N0 :29、SEQ ID N0 :30、SEQ ID N0 : 31、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO :33、SEQ ID NO :34、SEQ ID NO :35、SEQ ID NO :36、SEQ ID NO：37,SEQ ID NO：38,SEQ ID NO ：39,SEQ ID NO：40,SEQ ID NO ：4U SEQ ID NO ：42,SEQ ID N0:43、SEQ ID N0:44、SEQ ID N0:45、SEQ ID N0:46、SEQ ID N0:47、和 SEQ ID N0:48 或其组合的一个或多个CDRs,其中该人源化轻链不是Campath?的人源化轻链。
[0088] 在其它实施方式中，该宿主细胞包含编码人源化重链的一种核酸，其中该人源化 重链包含选自 SEQ ID N0 :49、SEQ ID N0 :50、SEQ ID N0 :51、SEQ ID N0 :52、SEQ ID N0 : 53、SEQ ID NO :54、SEQ ID NO :55、SEQ ID NO :56、SEQ ID NO :57、SEQ ID NO :58、SEQ ID NO :59、SEQ ID NO :60、SEQ ID NO :61、SEQ ID NO :62、SEQ ID NO :63、SEQ ID NO :64、SEQ ID NO ：65, SEQ ID NO ：66, SEQ ID NO ：67, SEQ ID NO ：68, SEQ ID NO ：69, SEQ ID NO ：70, SEQIDN0:71、SEQIDN0:72、SEQIDN0:73、SEQIDN0 :74、和SEQIDN0:294 或其组合 的一个或多个⑶Rs,其中该人源化重链不是Campath?的人源化重链。
[0089] 本发明还涉及一种对人CD52具有结合特异性的人源化免疫球蛋白的制备方法， 其包括将本发明的宿主细胞（例如，包含编码本发明人源化免疫球蛋白（例如，本发明的人 源化轻链和人源化重链）的一个或多个重组核酸的宿主细胞）维持在适合人源化免疫球蛋 白表达的条件下，借以表达人源化免疫球蛋白链并产生人源化免疫球蛋白。在一些实施方 式中，该方法还包括纯化或分离人源化免疫球蛋白。在一些实施方式中，该方法还包括将纯 化或分离的人源化免疫球蛋白与生理上可接受的媒介物或载体结合以制备药物组合物。
[0090] 本发明还涉及一种对人CD52具有结合特异性的人源化轻链的制备方法，其包括 将本发明的宿主细胞（例如，包含编码本发明人源化轻链的一个或多个重组核酸的宿主细 胞）维持在适合人源化轻链表达的条件下，借以表达人源化轻链并产生人源化轻链。在一 些实施方式中，该方法进一步包括纯化或分离人源化轻链。
[0091] 本发明还涉及一种对人⑶52具有结合特异性的人源化重链的制备方法，其包括 将本发明的宿主细胞（例如，包含编码本发明人源化重链的一个或多个重组核酸的宿主细 胞）维持在适合人源化重链表达的条件下，借以表达人源化重链并产生人源化重链。在一 些实施方式中，该方法进一步包括纯化或分离人源化重链。
[0092] 本发明还涉及一种药物组合物，其包含本发明的人源化免疫球蛋白（例如，包含 本发明的人源化轻链和/或本发明的人源化重链）和生理学上可接受的媒介物或载体。在 一些实施方式中，该药物组合物包含一种单位剂量组合物。
[0093] 本发明还涉及一种会分泌对人CD52具有结合特异性的单克隆抗体的杂交瘤的生 产方法，其包括将人CD52转基因小鼠的淋巴细胞施用至品系与人CD52转基因小鼠相同或 类似的（例如，CD1)的非转基因小鼠，由此得到免疫的非转基因小鼠。该免疫的非转基因小 鼠的脾细胞与永生细胞融合，从而制得杂交瘤。将该杂交瘤保持在其会分泌对人CD52具有 结合特异性的单克隆抗体的条件下。在一些实施方式中，使用FACS分析以检测会分泌对人 CD52具有结合特异性的单克隆抗体的杂交瘤。在其它实施方式中，转基因小鼠的品系和非 转基因小鼠的品系是相同的。在某些实施方式中，⑶52是野生型人⑶52。在一些实施方式 中，CD52转基因小鼠和非转基因小鼠是CD1鼠。在一些实施方式中，用于免疫的淋巴细胞 是从人CD52转基因小鼠的脾脏中得到的。在一些实施方式中，永生细胞选自SP2/0Agl4细 胞和NS1骨髓瘤细胞。本发明还涉及一种通过本发明的方法所生产的杂交瘤。选择性地， 由杂交瘤所分泌的单克隆抗体被收集，并可被进一步纯化（例如，大体上纯化的，分离的）。 在其它实施方式中，该方法进一步包括确定由杂交瘤所分泌的单克隆抗体的核苷酸序列。
[0094] 本发明还涉及一种治疗需要治疗的病人中的自体免疫疾病（例如，多发性硬化症 (MS)、类风湿性关节炎（RA)(参见例如，Nature Reviews Drug Discovery6:75_92(2007))、 血管炎（参见例如，Rheumatology39:229_237(2000))、贝西氏病（Behcet's disease) (BD) (参见例如，Rheumatology42:1539-1544 (2003))、狼疮及乳糜泻（Vivas, S.，等人，N. Engl. J. Med.，354(23) :2514-2515(2006))、血管炎、干癣、肌炎、硬皮病、再生障碍性贫血、及结肠 炎）的方法，其包括对病人施用有效量的本发明的人源化免疫球蛋白。
[0095] 在另一方面，有效量的本发明的人源化免疫球蛋白可与一种或多种免疫抑制剂 一起施用以使需要此种治疗的病人准备进行实体器官移植（Agarwal等人，Transplant Immunol. ,20:6-11 (2008))或 CD34+干细胞移植（Burt 等人，The Lancet, published online January30, 2009)〇
[0096] 本发明还涉及一种治疗需要治疗的病人中的癌症的方法，其包括对病人施用有效 量的本发明的人源化免疫球蛋白。
[0097] 本发明还涉及一种治疗需要治疗的病人中的多发性硬化症的方法，其包括对病人 施用有效量的本发明的人源化免疫球蛋白。
[0098] 本发明还涉及一种治疗需要治疗的病人中的慢性淋巴细胞白血病的方法，其包括 对病人施用有效量的本发明的人源化免疫球蛋白。
[0099] 本发明的人源化免疫球蛋白的给药可包括人源化免疫球蛋白本身的给药（例如， 以药物组合物形式），编码人源化免疫球蛋白的一个或多个重组载体的给药，或是包含编码 人源化免疫球蛋白的一个或多个核酸（例如，一个或多个重组载体）和表达人源化免疫球 蛋白的宿主细胞的给药。
[0100] 本发明还涉及一种诊断选自自体免疫疾病（例如，多发性硬化症、狼疮、血管炎）、 癌症（例如白血病（例如慢性淋巴细胞白血病），和淋巴瘤（例如，非何杰金氏淋巴瘤））、 移植（例如实体器官移植（例如肾脏移植）和干细胞移植）的疾病的方法，其包括使用本 发明的人源化免疫球蛋白在体外检定病人样品。
[0101] 本发明还涉及一种本发明的人源化免疫球蛋白（例如，包含本发明的人源化轻链 和/或本发明的人源化重链）、本发明的重组载体、或是本发明的宿主细胞，用于药物，例如 用于疾病治疗和/或诊断，例如用于治疗本文所叙述的疾病或病症比如自体免疫疾病（例 如，多发性硬化症、类风湿性关节炎、和狼疮）、癌症、淋巴细胞过度增殖症状（例如T或B 细胞恶性肿瘤，包括例如B细胞慢性淋巴细胞白血病的白血病和例如非何杰金氏淋巴瘤 的淋巴瘤）。参见，例如，Lundin，J·，等人，Blood, 101:4267-4272 (2003) ;Rodig，SJ·，等 人，Clinical Cancer Research, 12 (23) :7174-7179 (2006)。本发明还涉及本发明的人源 化免疫球蛋白、人源化轻链或人源化重链、本发明的重组载体、或本发明的宿主细胞用于制 造用来治疗本文所述的疾病或病症（例如，自体免疫疾病（例如，多发性硬化症、狼疮、血管 炎）、癌症（例如白血病（例如慢性淋巴细胞白血病），和淋巴瘤（例如，非何杰金氏淋巴 瘤））、和移植（例如实体器官移植（例如肾脏移植）和干细胞移植））的药物中的用途。
[0102] 本发明还提供一种人源化抗人⑶52抗体，包括人轻链骨架区，其利用残基36 (Y) 和46 (L) (Kabat编号）已被替代的人Vk2-A18b基因。在一些实施方式中，残基36为V或L 且残基46为R。本发明还提供人源化抗人CD52抗体，包括人重链骨架区，其利用残基47 (W) (Kabat编号）已被替代的人VH3-23基因。在一些实施方式中，残基47 (W)和49 (S) (Kabat 编号）均被替代。在一些实施方式中，残基47为L且残基49为S。在其它实施方式中，残 基47为L且残基49为A。
[0103] 在一些实施方式中，本发明的人源化抗人CD52抗体的EC5(I值，如在细胞结合检定 (例如在实施例29中描述的检定）中所确定，两倍低于Campath-1抗体的EC 5Q值。在 多个实施方式中，人源化抗人CD52抗体的EC5(I值为llnM或更低。
[0104] 在一些实施方式中，在来源于经Campath-1H?治疗的病人的血清的抗 Canipath- ΠΙ'.--.抗体的存在下，本发明的人源化抗人⑶52抗体结合至细胞上的⑶52。也 就是说，在这样的抗Campath-IH?抗体的存在下，本发明的人源化抗人CD52抗体在细 胞上与⑶52的结合相比于Campath-1H?与⑶52的结合并未降低，或者其在这样的抗 Campath-ΙΗ?抗体的存在下相比于Campath-1H :R_;与CD52的结合更少降低。
[0105] 本发明还提供一种人源化抗人CD52抗体以及本文提供的人源化抗人CD52抗体的 血液和/或脾脏中淋巴细胞消减概况。
[0106] 在一些实施方式中，本发明的人源化抗人⑶52抗体使受试者的血清中TNFa、 IL-6和MCP-1中的一个或多个的循环水平增加。
[0107] 在一些实施方式中，本发明的人源化抗人CD52抗体降低受试者中的淋巴细胞水 平至少30天、至少50天、至少60天、至少70天、至少80天、或80天以上。
[0108] 在一些实施方式中，本发明的人源化抗人CD52抗体延迟疾病发病和/或降低疾病 的严重度，如在小鼠 EAE模型中通过临床评分所测定。
[0109] 在一些实施方式中，在免疫原性检定例如在实施例69或70中所描述的检定中，本 发明的人源化抗人⑶52抗体的免疫原性比Campath-丨H?低。
[0110] 小鼠单克降免疫球蛋白
[0111] 本发明还涉及对人CD52具有结合特异性的小鼠单克隆抗体（小鼠单克隆免疫球 蛋白）。在一个实施方式中，本发明涉及对人CD52具有结合特异性的小鼠单克隆抗体，其 包含含有SEQ ID N0 :3的轻链和含有SEQ ID N0 :16的重链；含有SEQ ID N0 :4的轻链和 含有SEQ ID N0 :17的重链；含有SEQ ID N0 :5的轻链和含有SEQ ID N0 :18的重链；含有 SEQIDN0:6的轻链和含有SEQIDN0:19的重链；含有SEQIDN0 :7的轻链和含有SEQID N0 :20的重链；含有SEQ ID N0 :8的轻链和含有SEQ ID N0 :21的重链；含有SEQ ID N0 :9 的轻链和含有SEQ ID NO :22的重链；含有SEQ ID NO :10的轻链和含有SEQ ID NO :23的 重链；含有SEQ ID NO :11的轻链和含有SEQ ID NO :24的重链；含有SEQ ID NO :12的轻链 和含有SEQ ID NO :25的重链；或含有SEQ ID NO :13的轻链和含有SEQ ID NO :26的重链。
[0112] 在一个实施方式中，对人CD52具有结合特异性的小鼠单克隆抗体包含选自SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :12、和 SEQ ID NO :13 的轻链可变区，或选自 SEQ ID NO ：16, SEQ ID NO： 17, SEQ ID NO： 18, SEQ ID NO： 19, SEQ ID N0：20,SEQ ID NO： 21、SEQIDN0:22、SEQIDN0:23、SEQIDN0 :24、SEQIDN0:25、和SEQIDN0:26的重链 可变区，或者此种轻链可变区和此种重链可变区二者。
[0113] 本发明还涉及一种小鼠免疫球蛋白轻链，其包含SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :12、或 SEQ ID NO :13 的可变区。
[0114] 本发明还涉及一种小鼠免疫球蛋白重链，其包含SEQ ID NO :16、SEQ ID NO :17、 SEQ ID NO ：18, SEQ ID N0：19,SEQ ID N0：20,SEQ ID N0：2USEQ ID N0：22,SEQ ID NO： 23、SEQIDN0:24、SEQIDN0:25、或SEQIDN0 :26的可变区。
[0115] 优选地，本发明的小鼠单克隆抗体包含本发明的鼠抗体轻链和本发明的鼠抗体重 链。在一些实施方式中，本发明提供一种小鼠单克隆免疫球蛋白，其结合至与一种小鼠单克 隆抗体所结合的人CD52上的表位相同的表位，该小鼠单克隆抗体包含SEQ ID N0 :3的轻链 可变区和SEQ ID N0 :16的重链可变区；SEQ ID N0 :4的轻链可变区和SEQ ID N0 :17的重 链可变区；SEQ ID N0 :5的轻链可变区和SEQ ID N0 :18的重链可变区；SEQ ID N0 :6的轻 链可变区和SEQ ID N0 :19的重链可变区；SEQ ID N0 :7的轻链可变区和SEQ ID N0 :20的 重链可变区；SEQ ID N0 :8的轻链可变区和SEQ ID N0 :21的重链可变区；SEQ ID N0 :9的 轻链可变区和SEQ ID N0 :22的重链可变区；SEQ ID N0 :10的轻链可变区和SEQ ID N0 :23 的重链可变区；SEQ ID NO :11的轻链可变区和SEQ ID NO :24的重链可变区；SEQ ID NO: 12的轻链可变区和SEQ ID NO :25的重链可变区；或SEQ ID NO :13的轻链可变区和SEQ ID NO :26的重链可变区。在其它实施方式中，本发明提供一种小鼠单克隆免疫球蛋白，其结合 至人⑶52上的表位，该表位与这样的小鼠单克隆抗体所结合的表位重叠。
[0116] 在其它实施方式中，本发明提供一种小鼠单克隆免疫球蛋白，其结合至人CD52上 的包含至少成熟人类⑶52序列的残基1的表位。该小鼠单克隆免疫球蛋白可结合至包含 至少成熟人类⑶52序列的残基1、3、4和5的表位，可结合至包含至少成熟人类⑶52序列 的残基1、2、3、4和5的表位，或者可结合至包含至少成熟人类⑶52序列的残基7、8和9的 表位。在一些实施方式中，该表位包含至少成熟人类⑶52序列的残基7、8和11。在一些实 施方式中，该表位包含至少成熟人类⑶52序列的残基4和11。
[0117] 本发明还涉及分离的核酸分子，其编码本发明的小鼠单克隆免疫球蛋白、小鼠免 疫球蛋白轻链或小鼠免疫球蛋白重链。在一些实施方式中，本发明为一种分离的核酸分子， 其编码小鼠免疫球蛋白重链和小鼠免疫球蛋白轻链，它们结合在一起而形成对人CD52具 有结合特异性的小鼠单克隆免疫球蛋白，其中该小鼠免疫球蛋白轻链包含选自SEQ ID N0: 3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、 SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :12、和 SEQ ID NO :13 的可变区，或者该小鼠免 疫球蛋白重链包含选自 SEQ ID N0:16、SEQ ID N0:17、SEQ ID N0:18、SEQ ID N0:19、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :25、 和SEQ ID NO :26的可变区，或者此种轻链和此种重链二者。
[0118] 在一些实施方式中，该分离的核酸编码小鼠免疫球蛋白轻链，其包含选自SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID NO: 9、SEQIDN0:10、SEQIDN0:11、SEQIDN0:12、和SEQIDN0 :13的可变区。
[0119] 在其它实施方式中，该分离的核酸编码小鼠免疫球蛋白重链，其包含选自SEQ ID NO ：16, SEQ ID N0：17,SEQ ID N0：18,SEQ ID N0：19,SEQ ID NO ：20, SEQ ID NO ：2U SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :25、和 SEQ ID NO :26 的可变区。
[0120] 本发明还涉及一种重组载体（例如，表达载体，包括哺乳动物细胞表达载体），其 包含编码本发明的小鼠单克隆免疫球蛋白（例如，小鼠免疫球蛋白轻链和小鼠免疫球蛋白 重链）、小鼠免疫球蛋白轻链、或小鼠免疫球蛋白重链的核酸。在一些实施方式中，本发明为 包含一个编码小鼠单克隆免疫球蛋白的核酸的一个重组载体，或包含多个编码小鼠单克隆 免疫球蛋白的核酸的一对重组载体，该小鼠单克隆免疫球蛋白包含选自SEQ ID NO :3、SEQ ID NO ：4, SEQ ID NO ：5, SEQ ID NO ：6, SEQ ID NO ：7, SEQ ID NO ：8, SEQ ID NO ：9, SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :12、和 SEQ ID NO :13 的轻链可变区，或选自 SEQ ID NO : 16、SEQ ID NO : 17、SEQ ID NO : 18、SEQ ID NO : 19、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :25、和 SEQ ID NO :26 的重链可变区，或 者此种轻链可变区和此种重链可变区二者。
[0121] 在其它实施方式中，该重组载体包含编码小鼠免疫球蛋白轻链的核酸，其中该小 鼠免疫球蛋白轻链包含 SEQ ID N0 :3、SEQ ID N0 :4、SEQ ID N0 :5、SEQ ID N0 :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :12、或 SEQ ID NO :13。
[0122] 在其它实施方式中，该重组载体包含编码小鼠免疫球蛋白重链的核酸，其中该小 鼠免疫球蛋白重链包含 SEQ ID N0:16、SEQ ID N0:17、SEQ ID N0:18、SEQ ID N0:19、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :25、 或 SEQ ID NO :26。
[0123] 在其它实施方式中，该重组载体包含编码小鼠免疫球蛋白轻链和小鼠免疫球蛋白 重链的核酸，其中该小鼠免疫球蛋白轻链和小鼠免疫球蛋白重链结合在一起而形成对人 CD52具有结合特异性的小鼠单克隆免疫球蛋白。在一个实施方式中，该小鼠免疫球蛋白轻 链包含选自 SEQ ID N0 :3、SEQ ID N0 :4、SEQ ID N0 :5、SEQ ID N0 :6、SEQ ID N0 :7、SEQ IDN0:8、SEQIDN0:9、SEQIDN0:10、SEQIDN0 :11、SEQIDN0:12、和SEQIDN0:13的 可变区，且该小鼠免疫球蛋白重链包含选自SEQ ID N0:16、SEQ ID N0:17、SEQ ID N0:18、 SEQ ID NO ：19, SEQ ID N0：20,SEQ ID N0：2USEQ ID N0：22,SEQ ID N0：23,SEQ ID NO： 24、SEQ ID NO :25、和 SEQ ID NO :26 的可变区。
[0124] 在特定的实施方式中，本发明的重组载体为一种表达载体，例如哺乳动物细胞表 达载体。在某些实施方式中，载体为一种质粒或是病毒载体（例如，腺病毒或AAV载体）。
[0125] 本发明还涉及一种宿主细胞，其包含一个或多个编码本发明的小鼠单克隆免疫球 蛋白（小鼠免疫球蛋白轻链和小鼠免疫球蛋白重链）、小鼠免疫球蛋白轻链或小鼠免疫球 蛋白重链的核酸。例如，在一些实施方式中，该宿主细胞包含一种本发明的重组载体（例 如，表达载体，哺乳动物细胞表达载体）。
[0126] 在一些实施方式中，该宿主细胞包含一种编码小鼠免疫球蛋白轻链和小鼠免疫球 蛋白重链的核酸，其中该小鼠免疫球蛋白轻链和该小鼠免疫球蛋白重链结合在一起而形成 对人CD52具有结合特异性的小鼠单克隆免疫球蛋白，并且其中该小鼠免疫球蛋白轻链包 含选自 SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0: 8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :12、和 SEQ ID NO :13 的可变 区，且/或该小鼠免疫球蛋白重链包含选自SEQ ID N0:16、SEQ ID N0:17、SEQ ID N0:18、 SEQ ID NO ：19, SEQ ID N0：20,SEQ ID N0：2USEQ ID N0：22,SEQ ID N0：23,SEQ ID NO： 24、SEQ ID NO :25、和SEQ ID NO :26的可变区，或二者皆具。
[0127] 在一些实施方式中，该宿主细胞包含一种编码小鼠免疫球蛋白轻链的核酸，其中 该小鼠免疫球蛋白轻链包含选自SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、 SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、 和SEQ ID NO :13的轻链可变区。
[0128] 在一些实施方式中，该宿主细胞包含一种编码小鼠免疫球蛋白重链的核酸，其中 该小鼠免疫球蛋白重链包含选自SEQ ID N0:16、SEQ ID N0:17、SEQ ID N0:18、SEQ ID N0: 19、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :25、和SEQ ID NO :26的重链可变区。
[0129] 本发明还涉及一种小鼠单克隆免疫球蛋白的制备方法，其包括将本发明的宿主细 胞（例如，包含编码本发明的小鼠单克隆免疫球蛋白（例如，小鼠免疫球蛋白轻链和小鼠免 疫球蛋白重链）的一个或多个重组核酸（例如，重组载体）的宿主细胞）维持在适合小鼠 单克隆免疫球蛋白表达的条件下，借以表达小鼠单克隆免疫球蛋白链并制备小鼠单克隆免 疫球蛋白。在一些实施方式中，该方法进一步包括纯化或分离小鼠单克隆免疫球蛋白。
[0130] 本发明还涉及一种小鼠单克隆免疫球蛋白轻链的制备方法，其包括将本发明的宿 主细胞（包含编码本发明的小鼠免疫球蛋白轻链的核酸）维持在适合该小鼠免疫球蛋白轻 链表达的条件下，借以表达轻链。在一些实施方式中，该方法进一步包括纯化或分离该轻 链。
[0131] 本发明还涉及一种小鼠单克隆免疫球蛋白重链的制备方法，其包括将本发明的宿 主细胞（包含编码本发明的小鼠免疫球蛋白重链的核酸）维持在适合该小鼠免疫球蛋白重 链表达的条件下，借以表达小鼠免疫球蛋白重链。在一些实施方式中，该方法进一步包括纯 化或分离该小鼠免疫球蛋白重链。
[0132] 本发明还涉及一种疾病（例如，自体免疫疾病（例如，多发性硬化症、狼疮、血 管炎），癌症（例如白血病（例如慢性淋巴细胞白血病），和淋巴瘤（例如，非何杰金氏 淋巴瘤）），移植（例如实体器官移植（例如肾脏移植）和干细胞移植））的诊断方法， 其包括使用本发明的小鼠单克隆免疫球蛋白在体外分析病人样品（例如，Lundin，J. 等人，Blood, 101:4267-4272(2003) ;Rodig，SJ 等人，Clin. Cancer res. ,12(23); 7174-717179(2006))。
[0133] 嵌合免疫球蛋白
[0134] 本发明还涉及一种对人CD52具有结合特异性的嵌合免疫球蛋白。此种嵌合免疫 球蛋白可包含本发明的任何小鼠单克隆免疫球蛋白的可变区。在一个实施方式中，本发明 的嵌合免疫球蛋白包含SEQ ID N0:3的轻链可变区和SEQ ID N0:16的重链可变区；SEQ ID NO :4的轻链可变区和SEQ ID NO :17的重链可变区；SEQ ID NO :5的轻链可变区和SEQ ID NO :18的重链可变区；SEQ ID NO :6的轻链可变区和SEQ ID NO :19的重链可变区；SEQ ID NO :7的轻链可变区和SEQ ID NO :20的重链可变区；SEQ ID NO :8的轻链可变区和SEQ ID NO :21的重链可变区；SEQ ID NO :9的轻链可变区和SEQ ID NO :22的重链可变区；SEQ ID NO :10的轻链可变区和SEQ ID NO :23的重链可变区；SEQ ID NO :11的轻链可变区和SEQ ID NO :24的重链可变区；SEQ ID NO :12的轻链可变区和SEQ ID NO :25的重链可变区；或 SEQ ID NO :13的轻链可变区和SEQ ID NO :26的重链可变区。
[0135] 本发明还涉及一种对人⑶52具有结合特异性的嵌合抗体，其包含选自：SEQ ID NO :3的轻链可变区、SEQ ID NO :4的轻链可变区、SEQ ID NO :5的轻链可变区、SEQ ID NO : 6的轻链可变区、SEQ ID NO :7的轻链可变区、SEQ ID NO :8的轻链可变区、SEQ ID NO :9的 轻链可变区、SEQ ID NO :10的轻链可变区、SEQ ID NO :11的轻链可变区、SEQ ID NO :12的 轻链可变区和SEQ ID NO :13的轻链可变区的轻链可变区序列，和/或选自：SEQ ID NO :16 的重链可变区、SEQ ID NO :17的重链可变区、SEQ ID NO :18的重链可变区、SEQ ID NO :19 的重链可变区、SEQ ID NO :20的重链可变区、SEQ ID NO :21的重链可变区、SEQ ID NO :22 的重链可变区、SEQ ID NO :23的重链可变区、SEQ ID NO :24的重链可变区、SEQ ID NO :25 的重链可变区和SEQ ID NO :26的重链可变区的重链可变区序列。
[0136] 本发明还涉及一种嵌合轻链，其包含选自SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID N0 : 5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:10、SEQ ID N0:11、 SEQ ID NO :12、和 SEQ ID NO :13 的可变区。
[0137] 本发明还涉及一种嵌合重链，其包含选自SEQ ID NO :16、SEQ ID NO :17、SEQ ID NO ：18, SEQ ID N0：19,SEQ ID NO ：20, SEQ ID NO ：2U SEQ ID NO ：22, SEQ ID NO ：23, SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :25、和 SEQ ID NO :26 的可变区。
[0138] 优选地，本发明的嵌合免疫球蛋白包含本发明的嵌合轻链和本发明的嵌合重链二 者。
[0139] 在一些实施方式中，本发明提供一种结合至与小鼠单克隆抗体所结合的人CD52 上的表位相同的表位的嵌合免疫球蛋白，该小鼠单克隆抗体包含SEQ ID N0 :3的轻链可变 区和SEQ ID N0 :16的重链可变区；SEQ ID N0 :4的轻链可变区和SEQ ID N0 :17的重链可 变区；SEQ ID N0 :5的轻链可变区和SEQ ID N0 :18的重链可变区；SEQ ID N0 :6的轻链可 变区和SEQ ID N0 :19的重链可变区；SEQ ID N0 :7的轻链可变区和SEQ ID N0 :20的重链 可变区；SEQ ID N0 :8的轻链可变区和SEQ ID N0 :21的重链可变区；SEQ ID N0 :9的轻链 可变区和SEQIDN0:22的重链可变区；SEQIDN0:10的轻链可变区和SEQIDN0 :23的重 链可变区；SEQ ID N0 :11的轻链可变区和SEQ ID N0 :24的重链可变区；SEQ ID N0 :12的 轻链可变区和SEQIDN0:25的重链可变区；或SEQIDN0 :13的轻链可变区和SEQIDN0: 26的重链可变区。在其它实施方式中，该嵌合免疫球蛋白结合至人CD52上的表位，此表位 与这样的小鼠单克隆抗体所结合的表位重叠。
[0140] 在其它实施方式中，本发明提供一种嵌合免疫球蛋白，其结合至人CD52上的表 位，该表位包含至少成熟人类CD52序列的残基1。该嵌合免疫球蛋白可结合至包含至少成 熟人类⑶52序列的残基1、3、4和5的表位，可结合至包含至少成熟人类⑶52序列的残基 I、 2、3、4和5的表位，或者可结合至人⑶52上的包含至少成熟人类⑶52序列的残基7、8和 9的表位。在一些实施方式中，该表位包含至少成熟人类⑶52序列的残基7、8和11。在一 些实施方式中，该表位包含至少成熟人类CD52序列的残基4和11。
[0141] 本发明还涉及一种分离的核酸分子，其编码本发明的嵌合免疫球蛋白、嵌合轻链 或嵌合重链。在一些实施方式中，本发明为一种编码嵌合重链和嵌合轻链的分离的核酸分 子（一个或多个核酸分子），嵌合重链和嵌合轻链结合在一起而形成对人CD52具有结合特 异性的嵌合免疫球蛋白，其中该嵌合轻链包含选自SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0: 5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:10、SEQ ID N0:11、 SEQ ID NO :12、和SEQ ID NO :13的可变区；且/或该嵌合重链包含选自SEQ ID NO :16、SEQ ID NO : 17、SEQ ID NO : 18、SEQ ID NO : 19、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22、 SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :25、和 SEQ ID NO :26 的可变区。
[0142] 在一些实施方式中，本发明为一种编码嵌合轻链的分离的核酸分子，该嵌合轻链 包含 SEQ ID N0 :3、SEQ ID N0 :4、SEQ ID N0 :5、SEQ ID N0 :6、SEQ ID N0 :7、SEQ ID N0 : 8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :12、或 SEQ ID NO :13 的可变 区。
[0143] 在一些实施方式中，本发明为一种编码嵌合重链的分离的核酸分子，该嵌合重链 包含 SEQ ID N0:16、SEQ ID N0:17、SEQ ID N0:18、SEQ ID N0:19、SEQ ID N0:20、SEQ ID N0:21、SEQIDN0:22、SEQIDN0:23、SEQIDN0 :24、SEQIDN0:25、或SEQIDN0:26的 可变区。
[0144] 本发明还涉及一种重组载体（例如，表达载体，哺乳动物细胞表达载体），其包含 编码本发明的嵌合免疫球蛋白（嵌合轻链和嵌合重链）、嵌合轻链、或嵌合重链的核酸。在 一些实施方式中，本发明为一种包含编码嵌合免疫球蛋白的核酸的重组载体（或包含多个 核酸的一对重组载体），该嵌合免疫球蛋白包含选自SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID NO ：5,SEQ ID NO ：6,SEQ ID NO ：7,SEQ ID NO ：8,SEQ ID NO ：9,SEQ ID NO ： 10,SEQ ID NO： II、 SEQ ID NO :12 和 SEQ ID NO :13 的轻链可变区；或选自 SEQ ID NO :16、SEQ ID NO :17、 SEQ ID NO ：18, SEQ ID N0：19,SEQ ID N0：20,SEQ ID N0：2USEQ ID N0：22,SEQ ID NO： 23、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :25、和SEQ ID NO :26的重链可变区；或此种轻链和重链二 者。
[0145] 在其它实施方式中，该重组载体包含编码嵌合轻链的核酸，其中该嵌合轻链包含 SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :12、或 SEQ ID NO :13 的可变区。
[0146] 在其它实施方式中，该重组载体包含编码嵌合重链的核酸，其中该嵌合重链包含 SEQ ID N0：16,SEQ ID N0：17,SEQ ID N0：18,SEQ ID N0：19,SEQ ID N0：20,SEQ ID NO： 21、SEQIDN0:22、SEQIDN0:23、SEQIDN0 :24、SEQIDN0:25、或SEQIDN0:26的可变 区。
[0147] 在特定的实施方式中，本发明的重组载体为一种表达载体，例如哺乳动物细胞表 达载体。在某些实施方式中，载体为一种质粒或病毒载体（例如，腺病毒或AAV载体）。
[0148] 本发明还涉及一种包含编码本发明的嵌合免疫球蛋白（嵌合轻链和嵌合重链）、 嵌合轻链或嵌合重链的一个或多个核酸（例如，一个或多个重组载体）的宿主细胞。例如， 在一些实施方式中，宿主细胞包含一种本发明的重组载体（例如，表达载体，哺乳动物细胞 表达载体）。
[0149] 在一些实施方式中，该宿主细胞包含编码嵌合轻链和嵌合重链的一个重组核酸 (或一对重组核酸），其中该嵌合轻链和该嵌合重链结合在一起而形成对人类CD52具有结 合特异性的嵌合免疫球蛋白，并且其中该嵌合轻链包含选自SEQ ID NO :3、SEQ ID N0 :4、 SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:10、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :12、和SEQ ID NO :13的可变区；且/或该嵌合重链包含选自SEQ ID NO ：16, SEQ ID N0：17,SEQ ID N0：18,SEQ ID N0：19,SEQ ID NO ：20, SEQ ID NO ：2U SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :25 和 SEQ ID NO :26 的可变区。
[0150] 在一些实施方式中，该宿主细胞包含编码嵌合轻链的重组核酸，其中该嵌合轻链 包含选自 SEQ ID N0 :3、SEQ ID N0 :4、SEQ ID N0 :5、SEQ ID N0 :6、SEQ ID N0 :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO : 10、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO: 12、和 SEQ ID NO :13 的轻 链可变区。
[0151] 在一些实施方式中，该宿主细胞包含编码嵌合重链的重组核酸，其中该嵌合重链 包含选自 SEQ ID N0:16、SEQ ID N0:17、SEQ ID N0:18、SEQ ID N0:19、SEQ ID N0:20、SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:22、SEQ ID N0:23、SEQ ID N0:24、SEQ ID N0:25、和 SEQ ID N0:26 的重链可变区。
[0152] 本发明还涉及一种嵌合免疫球蛋白的制备方法，其包括将本发明的宿主细胞（例 如，包含一个或多个编码本发明的嵌合免疫球蛋白（例如，嵌合轻链和嵌合重链）的分离的 核酸的宿主细胞）维持在适合嵌合免疫球蛋白表达的条件下，借以表达嵌合免疫球蛋白链 并制备嵌合免疫球蛋白。在一些实施方式中，该方法进一步包括纯化或分离嵌合免疫球蛋 白。
[0153] 本发明还涉及一种嵌合轻链的制备方法，其包括将本发明的宿主细胞（例如，包 含编码本发明的嵌合轻链的核酸的宿主细胞）维持在适合该嵌合轻链表达的条件下，借以 表达嵌合轻链并制备嵌合轻链。在一些实施方式中，该方法进一步包括纯化或分离该嵌合 轻链。
[0154] 本发明还涉及一种嵌合重链的制备方法，其包括将本发明的宿主细胞（例如，包 含编码本发明的嵌合重链的核酸的宿主细胞）维持在适合该嵌合重链表达的条件下，借以 表达嵌合重链并制备嵌合重链。在一些实施方式中，该方法进一步包括纯化或分离该嵌合 重链。
[0155] 本发明还涉及一种选自自体免疫疾病（例如，多发性硬化症、狼疮、血管炎）、癌症 (例如白血病（例如慢性淋巴细胞白血病），和淋巴瘤（例如，非何杰金氏淋巴瘤））、和移 植（例如实体器官移植（例如肾脏移植）和干细胞移植）的疾病的诊断方法，其包括使用 本发明的嵌合免疫球蛋白在体外分析病人样品。
[0156] 本发明的进一步实施方式在以下描述。一方面，本发明涉及一种单克隆抗人CD52 抗体或其抗原结合部分，其中该抗体的轻链和重链分别包含：在SEQ ID N0 :3和SEQ ID N0: 16中找到的三个互补决定区（CDRs);在SEQ ID NO :4和SEQ ID NO :17中找到的三个互补 决定区（CDRs);在SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :18中找到的三个互补决定区（CDRs);在SEQ IDN0:6和SEQIDN0:19中找到的三个互补决定区（CDRs);在SEQIDN0 :7和SEQID NO :20中找到的三个互补决定区（⑶Rs);在SEQ ID NO :8和SEQ ID NO :21中找到的三个 互补决定区（CDRs);在SEQIDN0:9和SEQIDN0 :22中找到的三个互补决定区（CDRs); 在SEQ ID NO :10和SEQ ID NO :23中找到的三个互补决定区（CDRs);在SEQ ID NO :11和 SEQIDN0:24中找到的三个互补决定区（CDRs);在SEQIDN0:12和SEQIDN0 :25中找 到的三个互补决定区（CDRs);在SEQ ID NO :12和SEQ ID NO :137中找到的三个互补决定 区（CDRs);或在SEQ ID NO :13和SEQ ID NO :26中找到的三个互补决定区（CDRs)。在一 些实施方式中，本发明涉及一种结合至与上述单克隆抗体或抗原结合部分所结合的人CD52 上的表位相同的表位的抗体。在一些实施方式中，本发明涉及一种与上述的单克隆抗体或 抗原结合部分竞争的抗体。在一些实施方式中，本发明涉及一种与上述的单克隆抗体或抗 原结合部分交叉竞争的抗体。
[0157] 在一些实施方式中，任何上述抗体或抗原结合部分结合至包含SEQ ID N0:104的 氨基酸序列。在一些相关的实施方式中，该抗体或部分至SEQ ID NO :104的结合可通过在 SEQ ID N0:104的残基4、7、8、或11中的一个或多个处的丙氨酸取代而减少。
[0158] 在一些实施方式中，抗体为一种人源化抗体、小鼠抗体、或嵌合抗体。在某些实施 方式中，该抗体重链的骨架区利用VH3-72或VH3-23人类生殖系序列，且该抗体轻链的骨架 区利用VK2A18b人类生殖系序列。
[0159] 在一些实施方式中，本发明涉及一种单克隆抗人CD52抗体或其抗原结合部分，其 中该抗体包含重链（H)-CDR1、H-CDR2、H-CDR3,以及轻链（L)-CDR1、L-CDR2、和 L-CDR3,其氨 基酸序列分别为SEQIDN0s:51、59、69、29、36、和43;分别为SEQIDN0s :50、60、69、29、 37jP43 41ijSSEQIDN0s:50、61、68、29、38jP43A1ijSSEQIDN0s:50、61、69、29、 36jP43 41ijSSEQIDN0s:50、62、69、29、39jP43A1ijSSEQIDN0s:52、61、70、30、 40jP43 41ijSSEQIDN0s:53、63、71、31、36jP44A1ijSSEQIDN0s:54、64、71、31、 36jP45 41ijSSEQIDN0s:55、63、72、31、36jP46A1ijSSEQIDN0s:56、65、73、32、 41、和 47 ;分别为 SEQ ID NOs :56、65、294、32、41、和47;或分别为SEQIDN0s:56、66、74、 33、41、和 48。
[0160] 在一些实施方式中，本发明涉及一种单克隆抗人CD52抗体或其抗原结合部分，其 中该抗体的轻链和重链分别包含SEQ ID NOs :3和16的氨基酸序列；分别包含SEQ ID NOs : 4和17的氨基酸序列；分别包含SEQ ID NOs :5和18的氨基酸序列；分别包含SEQ ID NOs : 6和19的氨基酸序列；分别包含SEQ ID NOs :7和20的氨基酸序列；分别包含SEQ ID NOs : 8和21的氨基酸序列；分别包含SEQ ID NOs :9和22的氨基酸序列；分别包含SEQ ID NOs : 10和23的氨基酸序列；分别包含SEQ ID NOs :11和24的氨基酸序列；分别包含SEQ ID NOs :12和25的氨基酸序列；或者分别包含SEQ ID NOs :13和26的氨基酸序列。
[0161] 在一些实施方式中，本发明涉及一种单克隆抗体或其抗原结合部分，其中该抗体 的重链和轻链分别包含SEQ ID NOs : 103和102的氨基酸序列；分别包含SEQ ID NOs : 136 和138的氨基酸序列；分别包含SEQ ID NOs :137和138的氨基酸序列；分别包含SEQ ID NOs :139和147的氨基酸序列；分别包含SEQ ID NOs :149和155的氨基酸序列；分别包含 SEQ ID NOs : 149和156的氨基酸序列；分别包含SEQ ID NOs : 158和165的氨基酸序列；分 别包含SEQ ID NOs : 158和166的氨基酸序列；分别包含SEQ ID NOs : 159和165的氨基酸 序列；分别包含SEQ ID NOs :159和166的氨基酸序列；分别包含SEQ ID NOs :161和166 的氨基酸序列；或分别包含SEQ ID NOs :163和166的氨基酸序列。在一些实施方式中，本 发明涉及一种结合至与上述单克隆抗体或其抗原结合部分所结合的人CD52上的表位相同 的表位的抗体。在一些实施方式中，本发明涉及一种与上述单克隆抗体或抗原结合部分竞 争的抗体。在一些实施方式中，本发明涉及一种与上述单克隆抗体或抗原结合部分交叉竞 争的抗体。
[0162] 在某些实施方式中，本发明涉及一种单克隆人源化抗人CD52抗体或其抗原结合 部分，其中该抗体的重链和轻链分别包含SEQ ID NOs :272和273的氨基酸序列，且无信号 序列。在某些实施方式中，本发明涉及一种单克隆抗人CD52抗体或其抗原结合部分，其中 该抗体的重链和轻链分别包含SEQ ID NOs :274和275的氨基酸序列，且无信号序列。在某 些实施方式中，本发明涉及一种单克隆抗人CD52抗体或其抗原结合部分，其中该抗体的重 链和轻链分别包含SEQ ID NOs :276和278的氨基酸序列，且无信号序列。在某些实施方式 中，本发明涉及一种单克隆抗人CD52抗体或其抗原结合部分，其中该抗体的重链和轻链分 别包含SEQ ID NOs :277和278的氨基酸序列，且无信号序列。在某些实施方式中，本发明 涉及一种单克隆抗人CD52抗体或其抗原结合部分，其中该抗体的重链和轻链分别包含SEQ ID NOs :279和280的氨基酸序列，且无信号序列。在某些实施方式中，本发明涉及一种单克 隆抗人⑶52抗体或其抗原结合部分，其中该抗体的重链和轻链分别包含SEQ ID NOs :281 和282的氨基酸序列，且无信号序列。本发明还提供结合至与这些人源化抗体的其中之一 所结合的CD52上的表位相同的表位的抗体，和与这些人源化抗体的其中之一竞争或交叉 竞争的抗体。在相关的实施方式中，本发明提供包含一种这些人源化抗体的组合物和药学 上可接受的载体。
[0163] 在一些实施方式中，本发明涉及一种单克隆抗人CD52抗体或其抗原结合部分，其 中该抗体的轻链包含选自SEQ ID NOs : 102、138、145-148、153-157、和164-168的氨基酸序 列。在某些实施方式中，本发明涉及一种单克隆抗人CD52抗体或其抗原结合部分，其中该 抗体的轻链包含选自SEQ ID NOs :273、275、278、280、和282的氨基酸序列，且无信号序列。 在某些实施方式中，本发明涉及一种抗体轻链或其部分，其包含选自SEQ ID NOs :102、138、 145-148、153-157、164-168、273、275、278、280、和282的氨基酸序列，且无信号序列若其存 在。
[0164] 在一些实施方式中，本发明涉及一种单克隆抗人CD52抗体或其抗原结合部分，其 中该抗体的重链包含选自SEQ ID勵8:103、136、137、139-144、149-152、和158-163的氨 基酸序列。在某些实施方式中，本发明涉及一种单克隆抗人CD52抗体或其抗原结合部分， 其中该抗体的重链包含选自SEQ ID勵8:272、274、276、277、279、和281的氨基酸序列，且 无信号序列。在某些实施方式中，本发明涉及一种抗体重链或其部分，其包含选自SEQ ID NOs :103、136、137、139-144、149-152、158-163、272、274、276、277、279、和281的氨基酸序 列，且无信号序列若其存在。
[0165] 在一些实施方式中，任何上述抗体可以为IgG、IgM、IgA、IgD或IgE分子。在某些 实施方式中，该IgG为IgGl、IgG2、IgG3、或IgG4。
[0166] 在一些实施方式中，任何上述抗原结合部分可为单链抗体、Fv、Fab、Fab'、 F(ab'）2、Fd、单链Fv分子（scFv)、双特异性单链Fv二聚体、双抗体（diabody)、区域缺失 抗体或单域抗体（dAb)。
[0167] 本发明还涉及任何上述抗体或抗原结合部分，其中该抗体或抗原结合部分消减T 或B淋巴细胞，或其二者；与B淋巴细胞相较，优先消减T淋巴细胞；增加 TNF-α、IL-6、 或MCP-1的循环血清水平（例如，以至少5%、至少10%、至少50%、至少100%、或至少 200%的水平）；介导CD52表达细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC);介导CD52 表达细胞的补体依赖性细胞毒性（CDC);尽管在阿仑单抗的中和抗体存在于病人中的情 况下，结合至人CD52 ;并且/或促进人类T和/或B细胞的细胞内信号传导（参见例如， Hederer 等人，International Immunologyl2:505-616 (2000) ;Watanabe 等人，Clinical Immunologyl20:247-259(2006))。
[0168] 本发明还涉及一种编码任何上述抗体的重链或其抗原结合部分或任何上述抗体 的轻链或其抗原结合部分的分离的核酸。在一些实施方式中，该分离的核酸包含选自SEQ ID NOs :283、285、287、288、290、和292的重链核苷酸序列，或不具有编码信号肽的序列的 该核苷酸序列；选自SEQ ID NOs :284、286、289、291、和293的轻链核苷酸序列，或是不具 有编码信号肽的序列的该核苷酸序列；或该重链核苷酸序列和该轻链核苷酸序列皆包含。 在某些实施方式中，该分离的核酸包含重链核苷酸序列与轻链核苷酸序列，其分别选自SEQ ID N0:283和SEQ ID N0:284,二者皆不具有编码信号肽的序列；分别选自SEQ ID N0:285 和SEQ ID NO :286,二者皆不具有编码信号肽的序列；分别选自SEQ ID NO :287和SEQ ID NO :289,二者皆不具有编码信号肽的序列；分别选自SEQ ID NO :288和SEQ ID NO :289,二 者皆不具有编码信号肽的序列；分别选自SEQ ID NO :290和SEQ ID NO :291，二者皆不具有 编码信号肽的序列；以及分别选自SEQ ID NO :292和SEQ ID NO :293,二者皆不具有编码信 号肽的序列。
[0169] 本发明还涉及包含重链核苷酸序列的分离核酸以及包含轻链核苷酸序列的分离 核酸用于制造治疗需要此种治疗的病人的药物中的用途，其中该重链核苷酸序列和该轻链 核苷酸序列分别选自SEQ ID N0:283和SEQ ID N0:284,二者皆不具有编码信号肽的序列； 分别选自SEQ ID N0:285和SEQ ID N0:286,二者皆不具有编码信号肽的序列；分别选自 SEQ ID N0:287和SEQ ID N0:289,二者皆不具有编码信号肽的序列；分别选自SEQ ID N0: 288和SEQ ID NO :289,二者皆不具有编码信号肽的序列；分别选自SEQ ID NO :290和SEQ ID NO :291，二者皆不具有编码信号肽的序列；以及分别选自SEQ ID NO :292和SEQ ID NO: 293,二者皆不具有编码信号肽的序列。
[0170] 本发明还涉及一种重组载体，其包含（1)编码任何上述抗体的重链或其抗原结合 部分的核酸序列，（2)编码任何上述抗体的轻链或其抗原结合部分的核酸序列，或（3)二 者。本发明还涉及一种宿主细胞，其包含编码任何上述抗体的重链或其抗原结合部分的第 一核酸序列，该第一核酸序列可操作地连接至表达控制元件，和编码该抗体的轻链或其抗 原结合部分的第二核酸序列，该第二核酸序列可操作地连接至表达控制元件。本发明涉及 一种抗人⑶52抗体或其抗原结合部分的制造方法，其包括将该宿主细胞维持在适合该抗 体或部分表达的条件下，并且还涉及进一步包括分离该抗体或部分的步骤的该方法。
[0171] 本发明涉及一种组合物，其包含根据权利要求第1-24项中任一项的单克隆抗体 或抗原结合部分以及药学上可接受的媒介物或载体。
[0172] 在一些实施方式中，本发明涉及一种对需要的病人进行治疗的方法，其包括对病 人施用有效量的任何上述的抗体或抗原结合部分，或上述组合物。在某些实施方式中，该病 人正接受移植。
[0173] 在一些实施方式中，本发明涉及一种对需要自体免疫疾病治疗的病人进行治疗的 方法，其包括对病人施用有效量的任何上述的抗体或抗原结合部分，或上述组合物。在某 些实施方式中，该自体免疫疾病为，例如，多发性硬化症、类风湿性关节炎、或系统性红斑狼 疮。
[0174] 在一些实施方式中，本发明涉及一种对需要癌症治疗的病人进行治疗的方法，其 包括对病人施用有效量的任何上述抗体或抗原结合部分，或上述组合物。在某些实施方式 中，该癌症为，例如，淋巴瘤比如非何杰金氏淋巴瘤；白血病比如B细胞慢性淋巴细胞白血 病；T细胞恶性肿瘤，其中与B细胞相较，该抗体或部分优先地消减T细胞；或实体肿瘤。
[0175] 在一些实施方式中，任一种上述治疗方法进一步包括对病人施用嗜中性细胞刺激 剂或NK细胞刺激剂。在某些实施方式中，该刺激剂为G-CSF或GM-CSF。在一些实施方式 中，任一种上述治疗方法进一步包括对病人施用T调节细胞刺激剂。在某些实施方式中，该 刺激剂为雷帕霉素（rapamycin)。
[0176] 在一些实施方式中，本发明涉及一种对需要的病人抑制血管生成的方法，其包括 对病人施用有效量的任何上述抗体或抗原结合部分。在某些实施方式中，该病人有实体肿 瘤。在某些实施方式中，该病人有新血管形成。在某些实施方式中，该新血管形成在眼睛中。
[0177] 本发明还涉及任何上述抗体或抗原结合部分用于制造用来治疗有需要病人中的 自体免疫疾病的药物中的用途。而且，本发明涉及任何上述抗体或抗原结合部分用于制造 用来治疗有需要病人中的癌症的药物中的用途。本发明涉及任何上述抗体或抗原结合部分 用于制造用来治疗需要移植的病人的药物中的用途。本发明涉及任何上述抗体或抗原结合 部分用于制造在需要的病人中治疗新血管形成的药物中的用途。
[0178] 本发明还涉及任何上述抗体或抗原结合部分作为药物的用途。

【专利附图】

【附图说明】
[0179] 图1A-1B是一种新的抗⑶52单克隆抗体的发展的不意表不。一般方案描述于图 1A中，且鼠抗人⑶52抗体克隆及其同种型（isotype)的名称显示于图1B中。
[0180] 图2是多个鼠抗人⑶52 κ轻链序列（SEQ ID NOS :1-13)的氨基酸序列的排列。 Campath-1G是一种大鼠单克隆抗体，由此得到人源化Campath-ΙΗ抗体。
[0181] 图3是多个鼠抗人⑶52重链序列（SEQ ID NOS :14-26)的氨基酸序列的排列。
[0182] 图4是野生型CD52和10种突变的CD52蛋白（SEQ ID NOS :104-114,自上到下） 的排列。
[0183] 图5A说明抗体4B10和7F11在表达⑶52丙氨酸扫描突变体的细胞上的基于FACS 的N端结合概况。
[0184] 图5B说明抗体0?比12、367、909、5?7、467、和11(：11在表达〇)52丙氨酸扫描突变 体的细胞上的基于FACS的中间区域结合概况。
[0185] 图 5C 说明抗体Campath-IH? ( "CampathlH"）、2C3、12G6、和 23E6 在表达 CD52 丙氨酸扫描突变体的细胞上的基于FACS的结合概况。
[0186] 图?描述使用嵌合单克隆抗体组探查的⑶52+/-N-连接糖基化的免疫印迹。 "cm" 表示 Carnpath-m?。
[0187] 图6是显示对于在CH0-K1⑶52#67细胞上筛选的各种嵌合抗⑶52抗体的1. 5小 时⑶C检定结果的图。结果显示嵌合抗体4B10和7F11与Campath-丨1丨泜可比较或者优于 Campath-IH⑩（"CampathlH"）。
[0188] 图7是显示对于在CH0-K1⑶52#67细胞上筛选的针对⑶52的各种嵌合IgGl抗体 的14小时ADCC检定结果的图。结果显示嵌合抗体2C3和12G6与C'ainpath-丨1U·可比较 或者优于 Campath-1H? ( "CampathlH"）。
[0189] 图8A-8C说明各种抗CD52抗体与Campath-丨H? ( "C-1H"）抗体至规定的人类 淋巴细胞群的比较结合。这些图显示通过FACS检定所筛选的嵌合抗体的结合能力的级别。 向最右端的曲线显示最高结合能力，而向最左端的曲线则具有较低亲和性。
[0190] 图 9A-9C 是说明在用嵌合抗体 7F11、8G3、23E6、12G6、4B10、或 5F7、或 Campath- i 11!. ? ("Cam"）给药之后72小时在血液中的CD4T细胞（图9A)、CD8T细胞（图 9B)和⑶19B细胞（图9C)的水平的图。
[0191] 图 10A-10C 是说明在用嵌合抗体 7F11、8G3、23E6、12G6、4B10、或 5F7、或 Campath- Ι Η.? ( "Cam"）给药之后72小时在脾脏中的CD4T细胞（图10A)、CD8T细胞 (图10B)和⑶19B细胞（图10C)的水平的图。
[0192] 图11A-11C是显示在用嵌合抗体2C3、9D9、4B10、3G7、或11C11、或 Campath-1H? ( "Cam"）给药之后72小时在血液中的CD4T细胞（图11A)、CD8T细胞 (图11B)和CD19B细胞（图11C)的水平的图。
[0193] 图12是说明在使用7F1U4B10、或12G6嵌合单克隆抗体、或Campath-m? ("Campath"）处理之后的存活小鼠百分比的Kaplan Meier存活图。
[0194] 图13是说明在使用2C3、8G3、或23E6嵌合单克隆抗体、或Cnmpaih... Π 1'丨 ("Campath"）处理之后的存活小鼠百分比的Kaplan Meier存活图。
[0195] 图14是说明在使用9D9或4B10嵌合单克隆抗体、或Campath-IH? ("Campath") 处理之后的存活小鼠百分比的Kaplan Meier存活图。
[0196] 图15是说明在使用2C3或11C11嵌合单克隆抗体、或Campath-ll-l·^ ("Campath"）处理之后的存活小鼠百分比的Kaplan Meier存活图。
[0197] 图16是鼠抗人CD52抗体4B10重链可变区（SEQ ID NO :96)序列以及最接近匹配 的人类生殖系序列（SEQ ID NO :97)和人源化重链可变区序列（SEQ ID NO :98)的排列。还 示出鼠抗人⑶52抗体4B10轻链可变区（SEQ ID NO :99)序列以及最接近匹配的人类生殖 系序列（SEQ ID N0:100)和人源化轻链可变区序列（SEQ ID N0:101)的排列。
[0198] 图17显示人源化4B10重链（SEQ ID NO :103)和轻链（SEQ ID NO :102)可变区的 序列。
[0199] 图18是显示人源化抗体4B10-H1/K1 ( "4B10-人源化"）和嵌合抗体4B10同等地 结合至表达⑶52的细胞的图。
[0200] 图19是显示人源化抗体4B10-H1/K1 ( "4B10-人源化"）和嵌合抗体4B10对表达 CD52的细胞介导同等的ADCC活性的图。
[0201] 图20是显示人源化抗体4B10-H1/K1 ( "4B10-人源化"）和嵌合抗体4B10对表达 CD52的细胞介导同等的CDC活性的图。
[0202] 图 21 是说明嵌合抗 CD52 抗体（12G6、7F11 和 4B10)、Campath-IH# ("Campath"）、和人源化抗CD52抗体4B10-H1/K1( "4B10人源化（H1/K1)"）在杂合的 huCD52转基因小鼠中的药物动力学特性的图。
[0203] 图22A-22C是显示在使用嵌合抗体4B10或人源化抗体4B10-H1/K1 ( "4B10-HU"） 或Campath-1H? ( "Campath"）给药之后72小时血液中的CD4T细胞（图22A)、CD8T细 胞（图22B)及CD19B细胞（图22C)的水平的图。
[0204] 图23是显示抗CD52单克隆抗体的相对结合亲和性的概括图。
[0205] 图24显示人源化7F11重和轻（κ)链可变区序列。回复突变为鼠残基的氨基酸 残基其下面划线，且⑶Rs以粗体表示。
[0206] 图25是显示嵌合和人源化7F11抗体同等地结合至表达⑶52的细胞的统计图。X 轴表示由结合的抗CD52抗体所放出的荧光，其中每一个峰的面积表示总细胞群。
[0207] 图26A显示人源化2C3重链可变区序列。回复突变为鼠残基的氨基酸残基其下面 划线，且⑶Rs以粗体表示。图26B显示人源化2C3轻（κ)链可变区序列。回复突变为鼠 残基的氨基酸残基其下面划线，且CDRs以粗体表示。
[0208] 图27A为显示人源化和嵌合2C3抗体结合至表达⑶52的细胞的统计图。X轴表示 由结合的抗CD52抗体所放出的荧光，其中每一个峰的面积表示总细胞群。图27B是显示嵌 合2C3抗体和一部分（subset)人源化2C3抗体同等地结合至表达⑶52的细胞的统计图。 X轴表示由结合的抗CD52抗体所放出的荧光，其中每一个峰的面积表示总细胞群。
[0209] 图28A显示人源化12G6重链可变区序列。回复突变为小鼠残基的氨基酸残基其 下面划线，且⑶Rs以粗体表示。图28B显示人源化12G6轻（κ)链可变区序列。回复突变 为鼠残基的氨基酸残基其下面划线，且CDRs以粗体表示。
[0210] 图29是显示嵌合12G6抗体和一部分人源化12G6抗体同等地结合至表达⑶52的 细胞的统计图。X轴表示由结合的抗CD52抗体所放出的荧光，其中每一个峰的面积表示总 细胞群。
[0211] 图30A显示人源化9D9重链可变区序列。回复突变为鼠残基的氨基酸残基其下面 划线，且⑶Rs以粗体表示。图30B显示人源化9D9轻（κ)链可变区序列。回复突变为鼠 残基的氨基酸残基其下面划线，且CDRs以粗体表示。
[0212] 图31是显示嵌合的9D9抗体和一部分人源化9D9抗体同等地结合至表达⑶52的 细胞的统计图。X轴表示由结合的抗CD52抗体所放出的荧光，其中每一个峰的面积表示总 细胞群。
[0213] 图 32A 显示 Campath-11隣（"C1H")、嵌合 2C3 抗体、及人源化 2C3-SFD1/K12 抗 体至初始人类T细胞和hu⑶52转基因小鼠 T细胞的结合曲线。图32B显示Campath-1H? ("C1H"）、嵌合9D9抗体、及人源化9D9抗体至初始人类T细胞和huCD52转基因小鼠 T细 胞的结合曲线。图32C显示Campath-m? ( "C1H"）、嵌合12G6抗体、及人源化12G6抗 体至初始人类T细胞和huCD52转基因小鼠 T细胞的结合曲线。
[0214] 图33是显示(.'ampath. 1丨丨卞、嵌合2C3及12G6抗体、和人源化2C3及12G6抗体 至huCD52表达的人类和转基因小鼠 T细胞的相对结合效率的表。
[0215] 图34通过流式细胞术说明人源化抗CD52 Campath-1H?、2C3U2G6、和9D9抗 体至人类外周血单核细胞群的规定亚型的相对结合形式（pattern)。这些统计图显示，对于 各种表达⑶52的人PBMC亚型，人源化抗⑶52抗体结合与Campath-1 Η--的结合相当。X 轴表示由结合的抗CD52抗体所放出的荧光，其中每一个峰的面积表示总细胞群。
[0216] 图35是显示嵌合及人源化7F11抗体对表达⑶52的细胞介导同等的ADCC活性的 图。
[0217] 图36是显示嵌合及人源化7F11抗体对表达⑶52的细胞介导⑶C活性的图。
[0218] 图37是显示嵌合及人源化2C3抗体对表达⑶52的细胞介导ADCC活性的图。
[0219] 图38是显示嵌合及人源化2C3抗体对表达⑶52的细胞介导⑶C活性的图。
[0220] 图39是显示嵌合及人源化12G6抗体对表达⑶52的细胞介导ADCC活性的图。
[0221] 图40是显示嵌合及人源化12G6抗体对表达⑶52的细胞介导⑶C活性的图。
[0222] 图41是显示嵌合及人源化9D9抗体对表达⑶52的细胞介导ADCC活性的图。
[0223] 图42是显示嵌合及人源化9D9抗体对表达⑶52的细胞介导⑶C活性的图。
[0224] 图43是显示人源化抗⑶52抗体在初始Τ细胞上的ADCC活性的图。
[0225] 图44是显示人源化抗⑶52抗体在初始Τ细胞上的⑶C活性的图。
[0226] 图45是显示Campath-ΙΗ而非其它抗⑶52抗体的中和的图，其使用包含抗 Campath-ΙΗ?中和抗体的CAMMS223研究人类血清样品。血清样品在第12个月（M12)和 第13个月（M13)取自代表性病人（MS-1)。
[0227] 图 46A-46E 显示在使用（:ampaih-lH?（"Campath"）和人源化 4B10-H1/ K1 ( "4B10"）抗体给药之后72小时血液中的CD4+T细胞、CD8+T细胞、B220+B细胞、NK细 胞、骨髓样细胞、和嗜中性粒细胞的水平。
[0228] 图 47A-47E 显示在使用 Campath-1H? ( "Campath"）和人源化 4B10-H1/ K1 ( "4B10"）抗体给药之后72小时脾脏中的CD4+T细胞、CD8+T细胞、B220+B细胞、NK细 胞、骨髓样细胞、嗜中性粒细胞、和巨噬细胞的水平。
[0229] 图 48A-48E 显示在使用 Campath-1H? ( "Campath"）和人源化 4B10-H1/ Kl( "4B10"）抗体给药之后2小时的循环细胞因子的水平。
[0230] 图 49Α 和 49Β 显示在使用（ΛιΠφ--Ην I iU ( "Campath"）和人源化 4Β10-Η1/ Kl( "4B10"）抗体（mg/kg)给药之后一段时期内的循环淋巴细胞的再增殖。
[0231] 图 5〇A_5〇E 显示在使用人源化 7F11-SFD1/K2( "7F11SFD1"）和 7F11-SFD2/ K2( "7F11SFD2"）抗体给药之后72小时血液中的CD4+T细胞、CD8+T细胞、B220+B细胞、 ΝΚ细胞、骨髓样细胞、和嗜中性粒细胞的水平。
[0232] 图 51Α-51Ε 显示在使用人源化 7F11-SFD1/K2( "7F11SFD1"）和 7F11-SFD2/ K2( "7F11SFD2"）抗体给药之后72小时脾脏中的CD4+T细胞、CD8+T细胞、B220+B细胞、 ΝΚ细胞、骨髓样细胞、和嗜中性粒细胞的水平。
[0233] 图 52A_52F 显示在使用人源化 7F11-SFD1/K2( "7F11SFD1"）和 7F11-SFD2/ K2( "7F11SFD2"）抗体给药之后2小时的循环细胞因子的水平。
[0234] 图 53Α 和 53Β 显示在使用人源化 7F11-SFD1/K2( "7F11SFD1"）和 7F11-SFD2/ K2( "7F11SFD2"）抗体给药（mg/kg)之后循环淋巴细胞在一段时间内的再增殖。
[0235] 图54A和54B显示在使用Campath-ΙΗ?（"Campath"）、7Fn-嵌合抗体、和人 源化7F11-SFD1/K2及7F11-SFD2/K2抗体给药之后72小时血液中的CD4+T细胞、CD8+T细 胞和B220+B细胞的水平。
[0236] 图55显示给药之后血液中Campath-IH? ( "Campath"）、7F11_嵌合抗体和人 源化7F11-SFD1/K2及7F11-SFD2/K2抗体在一段时间内的水平。
[0237] 图56A-56E显示在使用2C3-SFD1/K12抗体给药之后72小时血液中的CD4+T细胞、 CD8+T细胞、B220+B细胞、NK细胞、和嗜中性粒细胞的水平。
[0238] 图57A-57E显示在使用2C3-SFD1/K12抗体给药之后72小时脾脏中的CD4+T细胞、 CD8+T细胞、B220+B细胞、NK细胞、和嗜中性粒细胞的水平。
[0239] 图58A-58F显示在使用2C3-SFD1/K12 ( "2C3"）抗体给药之后2小时的循环细胞 因子的水平。
[0240] 图59显示在使用2C3-SFD1/K12抗体给药（mg/kg)之后循环的淋巴细胞在一段时 间内的再增殖。
[0241] 图60A-60E显示在使用12G6-SFD1/K11抗体给药之后72小时血液中的CD4+T细 胞、CD8+T细胞、B220+B细胞、NK细胞、骨髓样细胞、巨噬细胞、和嗜中性粒细胞的水平。
[0242] 图61A-61E显示在使用12G6-SFD1/K11抗体给药之后72小时脾脏中的CD4+T细 胞、CD8+T细胞、B220+B细胞、NK细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、和骨髓样细胞的水平。
[0243] 图62A-62F显示在使用12G6-SFD1/K11 ( "12G6hu"）抗体给药之后2小时的循环 细胞因子的水平。
[0244] 图63显示在使用12G6-SFD1/K11抗体给药（mg/kg)之后循环的淋巴细胞在一段 时间内的再增殖。
[0245] 图64A-64C显示给药之后血液中2C3-嵌合、2C3-SFD1/K12U2G6-嵌合、 12G6-SFD1/K1U9D9-嵌合、及9D9-H10/K12抗体在一段时间内的水平。
[0246] 图65A-65E显示在使用9D9-H10/K12( "9D9"）抗体给药之后72小时血液中的 CD4+T细胞、CD8+T细胞、B220+B细胞、NK细胞、骨髓样细胞、巨噬细胞、和嗜中性粒细胞的 水平。
[0247] 图66A-66E显示在使用9D9-H10/K12( "9D9"）抗体给药之后72小时脾脏中的 CD4+T细胞、CD8+T细胞、B220+B细胞、NK细胞、骨髓样细胞、嗜中性粒细胞、和巨噬细胞的 水平。
[0248] 图67A-67F显示在使用9D9-H10/K12("9D9"）抗体给药之后2小时循环细胞因子 的水平。
[0249] 图68显示在使用9D9_H10/K12( "9D9"）抗体（mg/kg)给药之后循环的淋巴细胞 在一段时间内的再增殖。
[0250] 图 69A-69D 显示在使用 Campath-iH? ( "Campath"）、2C3-SFD1/K12 ( "2C3"）、 12G6-SFD1/K11( "12G6"）、和9D9-H10/K12( "9D9"）抗体给药之后72小时血液中的整体 (bulk)淋巴细胞群（⑶4+T细胞、⑶8+T细胞、和B细胞）和⑶4+T细胞、⑶8+T细胞、B220+B 细胞及NK细胞亚型的水平。
[0251] 图 70A-70D 显示在使用 Campath... 1 丨...丨'丨（（"Campath"）、2C3-SFD1/K12 ( "2C3"）、 12G6-SFD1/K11( "12G6"）、及9D9-H10/K12( "9D9"）抗体给药之后72小时脾脏中的整体 淋巴细胞群（⑶4+T细胞、⑶8+T细胞、及B细胞）和⑶4+T细胞、⑶8+T细胞、B220+B细胞 及NK细胞亚型的水平。
[0252] 图 71A-71F 显示在使用 Campath-1H?、2C3-SFD1/K12、12G6-SFD1/K11、和 9D9-H10/K12抗体给药之后2小时循环细胞因子的水平。
[0253] 图72显示在使用9D9-H10/K12及9D9-H11/K12抗体给药之后72小时血液中的 CD4+T细胞、CD8+T细胞、B220+B细胞、和NK细胞的水平。
[0254] 图73显示在使用9D9-H10/K12及9D9-H11/K12抗体给药之后72小时脾脏中的 CD4+T细胞、CD8+T细胞、B220+B细胞、和NK细胞的水平。
[0255] 图 74A-74D 显示在使用 12G6-SFD1/K11( "12G6K11"）和 12G6-SFD1/ K12( "12G6K12"）抗体给药之后72小时血液中的CD4+T细胞、CD8+T细胞、B220+B细胞、 ΝΚ细胞、和骨髓样细胞的水平。
[0256] 图 75Α-7? 显示在使用 12G6-SFD1/K11( "12G6K11"）和 12G6-SFD1/ K12( "12G6K12"）抗体给药之后72小时脾脏中的CD4+T细胞、CD8+T细胞、B220+B细胞、 ΝΚ细胞、和骨髓样细胞的水平。
[0257] 图76显示在使用909-!111/1(12、909-!116/1(13、和909-!118/1(13抗体给药之后72小 时血液中的整体淋巴细胞群（⑶4+Τ细胞、⑶8+Τ细胞、和Β220+Β细胞）的水平。
[0258] 图 77A-77D 显示在使用 9D9-H11/K12、9D9-H16/K13、及 9D9-H18/K13 抗体给药之 后72小时血液中的CD4+T细胞、CD8+T细胞、B220+B细胞、NK细胞、和骨髓样细胞亚型的水 平。
[0259] 图78显示在使用909-!111/1(12、909-!116/1(13、及909-!118/1(13抗体给药之后72小 时脾脏中的整体淋巴细胞群（⑶4+T细胞、⑶8+T细胞、和B220+B细胞）的水平。
[0260] 图 79A-79D 显示在使用 9D9-H11/K12、9D9-H16/K13、及 9D9-H18/K13 抗体给药之 后72小时脾脏中的⑶4+T细胞、⑶8+T细胞、B220+B细胞、NK细胞、和骨髓样细胞亚型的水 平。
[0261] 图 80A-80F 显示在使用 909-!111/1(12、909-!116/1(13、及909-!118/1(13抗体给药之后 2小时循环细胞因子的水平。
[0262] 图 81A 和 81B 显示给药之后血液中 2C3-SFD1/K12、12G6-SFD1/K11、12G6-SFD1/ K12、9D9-H16/K13和9D9-H18/K13抗体在一段时间内的水平。
[0263] 图 82A-82F 显示在使用 Campath-IH? ( "Campath"）、2C3-SFD1/K11、 12G6-SFD1/K11、12G6-SFD1/K12、9D9-H16/K13 或 9D9-H18/K13 抗体给药之后血液中的细胞 因子在48小时时间内的水平。
[0264] 图 83A-83E 显示在使用 Campath-丨Η? ( "Campath"）、2C3_SFD1/K11、 12G6-SFD1/K11、12G6-SFD1/K12、9D9-H16/K13 或 9D9-H18/K13 抗体给药之后 72 小时脾脏中 的整体淋巴细胞、⑶4+T细胞、⑶8+T细胞、B220+B细胞、NK细胞、和骨髓样细胞的水平。
[0265] 图 84A-84G 显示在使用 C.:;.in)path... m .K) ( "Campath"）、2C3-SFD1/K12、9D9-H16/ K13及12G6-SFD1/K12抗体给药之后循环的CD4+和CD8+T细胞、调节T细胞、B细胞、NK细 胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞在一段时间内的再增殖。
[0266] 图 85 显示 FITC 标记的 Campath-IH? ("Campath"）、2C3_SFD1/K12 ("2C3K12"）、 12G6-SFD1/K11( "12G6K11"）、12G6-SFD1/K12( "12G6K12"）、9D9-H16/K13( "9D9H16"）、及 9D9-H18/K13( "9D9H18"）抗体在脾脏中特异性地结合至hu⑶52淋巴细胞群的能力。
[0267] 图 86A-86E 显示在使用 Campath-ΙΗ?（"Campath"）、2C3-SFD1/K12、12G6-SFD1/ K11、12G6-SFD1/K12、9D9-H16/K13、及9D9-H18/K13抗体给药之后72小时血液中的整体淋 巴细胞群（CD4+T细胞、CD8+T细胞、和B220+B细胞）和CD4+T细胞、CD8+T细胞、B220+B细 胞、NK细胞及骨髓样细胞亚型的水平。
[0268] 图 87A-87E 显示在使用 Campath-1H? ( "Campath"）、2C3_SFD1/K12、 12G6-SFD1/K11、12G6-SFD1/K12、9D9-H16/K13、及 9D9-H18/K13 抗体给药之后 72 小时脾脏 中的整体淋巴细胞群（⑶4+T细胞、⑶8+T细胞、和B220+B细胞）和⑶4+T细胞、⑶8+T细 胞、B220+B细胞、NK细胞及骨髓样细胞亚型的水平。
[0269] 图 88A-88F 显示在使用 Campatll-1H? ( "Campath"）、2C3_SFD1/K12、 12G6-SFD1/K11、12G6-SFD1/K12、9D9-H16/K13、及 9D9-H18/K13 抗体给药之后 2 小时循环细 胞因子的水平。
[0270] 图 89A-89D 显示在使用 Campath-1H? ( "Campath"）、2C3-SFD1/K12、9D9-H16/ K13及12G6-SFD1/K12抗体给药之后72小时血液中的CD4+T细胞、CD8+T细胞、B220+B细 胞、及NK/骨髓样细胞亚型的水平。
[0271] 图 90A-90D 显示在使用 Campaih-jH.Ki ( "Campath"）、2C3-SFD1/K12、9D9-H16/ K13及12G6-SFD1/K12抗体给药之后72小时脾脏中的CD4+T细胞、CD8+T细胞、B220+B细 胞、及NK/骨髓样细胞亚型的水平。
[0272] 图 91A-91D 显示在使用 Campath-] ( "Campath"）、2C3-SFD1/K12、9D9-H16/ K13及12G6-SFD1/K12抗体给药之后72小时淋巴结中的CD4+T细胞、CD8+T细胞、B220+B 细胞、及NK/骨髓样细胞亚型的水平。
[0273] 图92A显示huCD52-KI/K0和非转基因对照小鼠中CD4+T细胞、CD8+T细胞、B220+B 细胞、及NK/骨髓样细胞亚型上的hu⑶52表达水平。图92B显示hu⑶52-KI/K0和hu⑶52⑶1 转基因小鼠中⑶4+T细胞、⑶8+T细胞、及B细胞上的hu⑶52表达水平。
[0274] 图93显示相对于Campath-ΙΗ?对照组的来自各种制造来源（"小规模"和"大 规模"）的 12G6-SFD1/K12 与 2C3-SFD1/K12 抗体对 huCD52 的结合。
[0275] 图94显示在使用来自各种制造来源（"小规模"和"大规模"）的12G6-SFD1/K12 和2C3-SFD1/K12抗体给药之后72小时血液中的整体淋巴细胞群（⑶4+T细胞、⑶8+T细胞、 Β220+Β细胞和ΝΚ细胞）的水平。
[0276] 图 95 显示在给药之后血液中的 2C3-SFD1/K12、9D9-H16/K13 和 12G6-SFD1/K12 抗 体在一段时间内的水平。
[0277] 图96显示在疾病进展时期内的2C3-SFD1/K12和12G6-SFD1/K12的EAE临床评分。
[0278] 图 97A 和 97B 显示 CampathlH? ( "Campath"）、2C3-SFD1/K12( "2C3"）、 His435Ala2C3-SFDl/K12( "H435A2C3"）和 His310Ala/His435Gln2C3-SFDl/K12( "H310A/ H435Q2C3"）结合至小鼠 FcRn分子和人类FcRn分子的能力。
[0279] 图98显示在非转基因小鼠中2C3-SFD1/K12( "2C3未修饰"）、2C3-SFD1/K12-修 饰1 ( "2C3-Fc突变体1"）和2C3-SFD1/K12-修饰2( "2C3-Fc突变体2"）的体内清除。
[0280] 图 99 显示在 huCD52 转基因小鼠中 2C3-SFD1/K12( "2C3"）、2C3-SFD1/K12-修饰 1 ( "2C3-Fc突变体1"）和2C3-SFD1/K12-修饰2( "2C3-Fc突变体2"）的体内清除。
[0281] 图 100A 和 100B 显示在使用 2C3-SFD1/K12( "2C3"）、2C3-SFD1/K12-修饰 1 ( "2C3-Fc突变体1"）、和2C3-SFD1/K12-修饰2( "2C3-Fc突变体2"）抗体给药之后72 小时血液和脾脏中的整体淋巴细胞群（⑶4+T细胞、⑶8+T细胞、B220+B细胞、和NK细胞） 的水平。
[0282] 图101A和101B是Biacore T100检定的代表性传感图（sensorgrams)以确定人 源化12G6-SFD1/K12抗体和通过丙氨酸扫描而产生的突变肽的表位特异性。图101A显示 12G6-SFD1/K12与MUT8肽之间没有结合，而图101B显示12G6-SFD1/K12与MUT9肽之间存 在结合。
[0283] 图102显示对供体BMS486的TCR νβ分析。使用Campath-ΙΗ?肽组986-989 驯化（educated)的CD4+T细胞表现出单一 VMVP3)的优先增加。
[0284] 图 103 显示对供体 BMS928 的 TCR νβ 分析。使用 12G6-SFD1/K12 肽组 1066-67-68 和1083-84-85驯化的⑶4+Τ细胞表现出单一 νβ (νβ 20)的优先增加。
[0285] 图104A-104J显示Campath-丨Η?免疫原性评估。对于单独供体Α-j的增殖反应 以CPM显示。X轴描述用于刺激自体CD4+T细胞三次的肽组。各组T细胞使用以驯化抗原 /肽组（特异性反应，左边条状物，白色）、不相关的DR结合肽（中间条状物，加条纹的）、或 介质（右边条状物，黑色）脉冲的自体DCs重复检定三次。
[0286] 图105A-105J显示12G6-SFD1/K12免疫原性评估。对于单独供体Α-J的增殖反应 以CPM显示。X轴描述用于刺激自体CD4+T细胞三次的肽组。各组T细胞使用以驯化肽组 (特异性反应，左边条状物，白色）、不相关的DR结合肽（中间条状物，加条纹的）、或介质 (右边条状物，黑色）脉冲的自体DCs重复检定三次。在没有介质对照检定的小组中，左边 条状物（白色）表示用驯化肽脉冲的DCs，右边条状物（加条纹的）表示用不相关肽脉冲的 DCs。
[0287] 图106显示2C3-SFD1 (SEQ ID NO :272)的全长人源化重链氨基酸序列和 2C3-K12(SEQ ID N0:273)的全长人源化轻链氨基酸序列。信号序列以粗体及斜体表示，且 ⑶Rs下面划线。
[0288] 图107显示7F11-SFD1 (SEQ ID NO :274)的全长人源化重链氨基酸序列和 7F11-K2(SEQ ID NO :275)的全长人源化轻链氨基酸序列。信号序列以粗体及斜体表示，且 ⑶Rs下面划线。
[0289] 图 108 显示 9D9-H16(SEQ ID NO :276)和 9D9-H18(SEQ ID NO :277)的全长人源化 重链氨基酸序列，以及9D9-K13(SEQ ID NO :278)的全长人源化轻链氨基酸序列。信号序列 以粗体及斜体表示，且⑶Rs下面划线。
[0290] 图109显示12G6-SFD1 (SEQ ID NO :279)的全长人源化重链氨基酸序列和 12G6-K12(SEQ ID N0:280)的全长人源化轻链氨基酸序列。信号序列以粗体及斜体表示， 且⑶Rs下面划线。
[0291] 图110显示4B10-H1 (SEQ ID NO :281)的全长人源化重链氨基酸序列和 4B10-K1(SEQ ID N0:282)的全长人源化轻链氨基酸序列。信号序列以粗体及斜体表示，且 ⑶Rs下面划线。
[0292] 图111显示2C3-SFD1 (SEQ ID NO :283)的全长人源化重链核酸序列和 2C3-K12(SEQ ID N0:284)的全长人源化轻链核酸序列。信号序列下面划线，可变区为粗体， 恒定区为斜体。
[0293] 图112显示7F11-SFD1 (SEQ ID NO :285)的全长人源化重链核酸序列和 7F11-K2(SEQ ID N0:286)的全长人源化轻链核酸序列。信号序列下面划线，可变区为粗体， 恒定区为斜体。
[0294] 图 113 显示 9D9-H16(SEQ ID NO :287)和 9D9-H18(SEQ ID NO :288)的全长人源化 重链核酸序列。信号序列下面划线，可变区为粗体，恒定区为斜体。
[0295] 图114显示9D9-K13(SEQ ID NO :289)的全长人源化轻链核酸序列。信号序列下 面划线，可变区为粗体，恒定区为斜体。
[0296] 图115显示12G6-SFD1 (SEQ ID NO :290)的全长人源化重链核酸序列和 12G6-K12(SEQ ID N0:291)的全长人源化轻链核酸序列。信号序列下面划线，可变区为粗 体，恒定区为斜体。
[0297] 图116显示4B10-H1 (SEQ ID NO :292)的全长人源化重链核酸序列和4B10-K1 (SEQ ID NO :293)的全长人源化轻链核酸序列。信号序列下面划线，可变区为粗体，恒定区为斜 体。

【具体实施方式】
[0298] CD52是一种糖基化的、GPI锚定的细胞表面富含蛋白（每个细胞约5x10s个抗体结 合部位），其存在于至少95%的所有人类外周血淋巴细胞和单核细胞/巨噬细胞（Hale G， 等人"The CAMPATH-lantigen(CD52), ''Tissue Antigens, 35:178-327 (1990))，但是不存在 于造血干细胞。本发明涉及对人CD52或其部分具有结合特异性（例如，表位特异性）或者 选择性地结合至人CD52或其部分的免疫球蛋白（抗CD52)。这些免疫球蛋白特异性地结合 至⑶52,并且不会特异性地结合至非⑶52分子。抗⑶52免疫球蛋白和⑶52之间的特异性 结合可通过，例如，使用流式细胞术测定免疫球蛋白结合至CD52+细胞的EC 5(I而确定。特异 性结合可通过EC5(I范围例如0. 5-10 μ g/ml所表明。本文所叙述的免疫球蛋白可对所有或 部分的人CD52具有结合特异性，其中人CD52是分离的和/或重组的人CD52,或是在表达 人CD52的细胞表面上。此外，免疫球蛋白可对一种或多种形式的人CD52(例如，糖基化的 人⑶52 ;去糖基化的人⑶52 ;非糖基化的人⑶52 ;和等位基因变体（allelic variants)) 具有结合特异性。在一个实施方式中，免疫球蛋白对自然生成的、内源的或野生型的人CD52 具有结合特异性。野生型人CD52的氨基酸序列说明于图4中（SEQ ID N0:104)。
[0299] 本文所述的免疫球蛋白可使用已知技术纯化或分离。"纯化"或"分离"的免疫球蛋 白已与其来源（例如，细胞上层清液；在混合物中，例如在文库的免疫球蛋白混合物中）的 分子（例如，肽）分开，并且包含由本文所述方法或其它合适的方法所得到的免疫球蛋白。 分离的免疫球蛋白包含大体上纯的（基本上纯的）免疫球蛋白，和通过化学合成、重组技术 及其组合所制备的免疫球蛋白。
[0300] 更具体而言，本发明涉及抗人CD52免疫球蛋白、免疫球蛋白的抗原结合片段（即， 部分）、免疫球蛋白的轻链、免疫球蛋白的重链、和这些轻链或重链的片段。本发明还涉及成 熟的免疫球蛋白或其链，例如糖基化免疫球蛋白。本发明还涉及未成熟的或前体免疫球蛋 白（蛋白）。本发明还涉及编码这些未成熟或成熟蛋白的核酸分子（例如，载体），涉及包 含此种核酸的载体及宿主细胞，涉及未成熟和成熟蛋白的制备方法，并且涉及免疫球蛋白 的使用方法。
[0301] 本发明的免疫球蛋白可用于治疗需要的受试者（例如，病人），以根据需要消减受 试者的淋巴细胞和其它CD52+细胞（例如，CD52+癌细胞）。本文所用的"淋巴细胞消减" 是一种通过减少循环的淋巴细胞群（例如，T细胞和/或B细胞）而造成淋巴细胞减少的 免疫抑制类型。本发明的免疫球蛋白还可用于抑制血管生成，如下文进一步所叙述。本发 明的免疫球蛋白还可用于，例如，在先体外后体内（ex vivo)应用中使造血干细胞增加（参 见，例如，Lim 等人，J Hematology&Oncologyl :19(2008))。
[0302] 自然产生的免疫球蛋白具有共同的核心结构，其中两个相同轻链（约24kD)和 两个相同重链（约55或70kD)形成一个四聚物。已知每一个链的氨基端部分是可变（V) 区，并可以区分于各个链其余部分的更保守的恒定（C)区。在轻链的可变区（也称为\ 域）内是已知为J区的C端部分。在重链的可变区（也称SV H域）内，除了 J区还有D 区。免疫球蛋白中的大部分氨基酸序列变异限制在V区域中三个单独的位置，其称为高 可变区或互补决定区（CDRs)，其直接涉及抗原结合。自氨基端开始，这些区域分别命名为 ⑶R1、⑶R2和⑶R3。这些⑶Rs由更保守的骨架区（FR)保持于所在处。自氨基端开始， 这些区域分别命名为FR1、FR2、FR3和FR4。⑶R和FR区的位置以及编号系统已由Kabat 等人（Kabat, Ε· A.，等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U. S. Department of Health and Human Services, U. S. Government Printing Office (1991)，Chothia&Lesk，Canonical Structures for the Hypervariable Regions of Immunoglobulins，J· Mol· Biol·，196, 901-917(1987))，和 IMGT? 编号系统（The International ImMunoGeneTics I information Ssystem?, Lefranc, Μ. -P.，The Immunologist7, 132-136(1999)定义。可进行视觉检查和序列分析以鉴定⑶R边界 (boundaries)。对于本发明，⑶R序列通过使用Kabat系统和IMGT系统而定义；也就是说， 当由该两个系统定义的CDRs没有完全重叠时，我们包括来自通过该两个系统所定义的序 列的所有残基。
[0303] 依据重链的同种型，人类免疫球蛋白可分为类（classes)及亚类（subclasses)。 类包括 IgG、IgM、IgA、IgD 和 IgE,其中重链分别为 gamma ( γ )、mu (μ )、alpha ( α )、 delta( δ )或 epsilon( ε )型。亚类包括 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl 和 IgA2， 其中重链分别为Y 1、Y 2、γ 3、γ 4、a 1和a 2型。选择的类或亚类的人类免 疫球蛋白分子可包含kappa( κ )或lambda( λ )轻链。参见例如Cellular and Molecular Immunology,ffonsiewicz,M.J. , Ed. , Chapter45, pp. 41-50, ff. B. Saunders Co., Philadelphia, PA91991) ；Nisonoff, A. , Introduction to Molecular Immunology, 2nd Ed. , Chapter4, pp. 45-65, Sinauer Associates, Inc. , Sunderland, MA(1984)〇
[0304] 本文所用的术语"免疫球蛋白"和"抗体"，其可互换使用，表示整体抗体和抗原结 合片段（即，"抗原结合部分"--除非另外指出，否则这两个术语在本文中可互换使用）。 抗体的抗原结合片段可以是以，例如，单链抗体、Fv片段、Fab片段、Fab'片段、F(ab'） 2片 段、Fd片段、单链Fv分子（scFv)、双特异性单链Fv二聚体（PCT/US92/09665)、双抗体、区 域缺失抗体和单域抗体（dAbs)的形式。参见，例如，Nature Biotechnology22(9) :1161-1 165(2004)。包含VH和/或VL的抗原结合分子也在本发明之内。在VH的情况下，该分子还 可包含一个或多个CH1、铰链（hinge)、CH2和CH3区。此种单链抗体也意在被包括在抗体 的"抗原结合部分"该术语以内。
[0305] 抗体部分或片段可通过酶催化裂解或通过重组技术而制备。例如，可使用木瓜 蛋白酶或胃蛋白酶裂解以分别产生Fab或F(ab'） 2片段。也可使用在天然终止部位的上 游已引入一个或多个终止密码子的抗体基因将抗体制备为各种截短形式。例如，可将编码 F(ab'）2片段的重链的重组构建体设计为包含编码重链的(?域和铰链区的DNA序列。优 选的抗原结合片段对野生型人CD52具有结合特异性。
[0306] 在另一方面，本发明提供一种本文所述的抗体或其部分的变体，其中该变体特异 性地结合至人⑶52,但以1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代（例如，在^1?区、？1?区、 或恒定区中）而与参考抗体或其部分不同。例如，变体抗体在重链、重链可变区、轻链、或轻 链可变区以至少90 %、至少91 %、至少93 %、至少95 %、至少97 %或至少99 %与参考抗体 相同。
[0307] 多肽的序列相似性或一致性，其也称为序列一致性，通常使用序列分析软件来对 其测定。蛋白分析软件使用分配为各种取代、缺失和其它修饰（包括保守型氨基酸取代） 的相似性度量来匹配类似序列。举例而言，GCG包含诸如"Gap"及"Bestfit"的程序，其可 以以预设参数使用，以确定紧密相关的多肽（例如来自不同生物体种类的同源多肽）之间 或是野生型蛋白与其突变蛋白之间的序列同源性或序列一致性。参见例如GCG6.1版。也 可使用FASTA(GCG6. 1版中的程序）利用预设或推荐参数来比较多肽序列。FASTA(例如， FASTA2和FASTA3)提供查询序列与搜寻序列之间最佳重叠区域的比对（alignment)和序 列一致性百分比（Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98 (1990) ;Pearson, Methods Mol. Biol. 132:185-219(2000))。当将本发明的序列与包含大量来自不同生物体的序列的数据 库比较时，另一种较佳的算法是计算机程序BLAST,特别是blastp或tblastn,其使用预设 参数。参见例如 Altschul 等人，J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990) ;Altschul 等人，Nucleic Acids Res. 25:3389-402(1997);本文中将其引入作为参考。
[0308] 根据本发明，可进行的一种类型的氨基酸取代是将抗体中的一个或多个半胱氨酸 (其可为化学反应性的）变成另一种残基（例如，但不限于丙氨酸或丝氨酸）。在一个实施 方式中，存在非经典（non-canonical)半胱氨酸的取代。取代可在抗体的可变区中的⑶R 或骨架区中，或在抗体的恒定域中进行。在一些实施方式中，半胱氨酸为经典的。可进行的 另一种类型的氨基酸取代是将抗体中的潜在蛋白分解部位移除。此种部位可出现于抗体的 可变区中的CDR或骨架区中或出现于抗体的恒定区中。半胱氨酸残基的取代和蛋白分解部 位的移除会降低抗体产物中不均一性的风险，从而增加其均一性。另一种类型的氨基酸取 代是通过改变残基的一个或其二者而消除天门冬酰胺-甘氨酸对，其形成潜在的去酰胺化 部位。在本发明的另一方面，可使用叙述于例如PCT公开W098/52976和W000/34317中的 技术将抗体去免疫化，以降低其免疫原性。
[0309] 可在根据本发明的一个变型中进行的另一种类型的氨基酸取代为保守型氨基酸 取代。"保守型氨基酸取代"是一种氨基酸残基被具有类似化学性质（例如，电荷或疏水性） 的侧链R基的另一个氨基酸残基所取代的取代。一般而言，保守型氨基酸取代大体上不会 改变蛋白的功能性质。在两个或更多个氨基酸序列因保守型取代而彼此不同的情况下，可 向上调整序列一致性百分率或相似度，以修正取代的保守本质。进行此调整的方法是本领 域内技术人员所公知的。参见，例如 Pearson, Methods Mol. Biol. 243:307-31 (1994)。
[0310] 具有类似化学性质侧链的氨基酸组的实例包括1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、 缬氨酸、亮氨酸、和异亮氨酸；2)脂肪族-羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；3)含酰胺侧链：天 门冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳香族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸、和色氨酸；5)碱性侧链：赖氨酸、 精氨酸、和组氨酸；6)酸性侧链：天门冬氨酸和谷氨酸；及7)含硫侧链：半胱氨酸和蛋氨 酸。优选的保守型氨基酸取代组为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨 酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸、以及天门冬酰胺-谷氨酰胺。或者，保守 型置换是在于Science256:1443-45(1992) (Gonnet等人）中所公开的PAM250对数似然矩 阵（log-likelihood matrix)中具有正值的任何改变。"中度保守型"置换是在PAM250对 数似然矩阵中具有非负值的任何改变。
[0311] 在某些实施方式中，本发明的抗体或抗原结合部分的氨基酸取代为以下那些：（1) 降低对蛋白质水解的敏感性，（2)减少对氧化反应的敏感性，（3)改变对于形成蛋白复合物 的结合亲和性，例如，以增强抗体的ADCC和CDC活性，（4)赋予或修饰此种类似物的其它物 理化学或功能性质，但仍保留有对人CD52的特异性结合，（5)移除C端赖氨酸，以及（6)增 加或移除糖基化部位。
[0312] 在一方面，本发明提供一种新型和新颖多肽，其是本发明的抗体的重链或轻链，或 者其是重链或轻链的含可变区的部分。此种多肽由于其可与相对（轻或重）抗体链配对以 形成⑶52-结合分子而是有用的。
[0313] 人源化免疫球蛋白
[0314] 本文所述的是包含新颖的鼠抗人CD52抗体的CDRs的人源化免疫球蛋白。在一个 实施方式中，该人源化免疫球蛋白包含人源化轻链和人源化重链，其具有不同于抗CD52抗 体的其它人源化类型（例如，Campath?)的氨基酸序列的CDR氨基酸序列。
[0315] 本文所用的术语"人源化免疫球蛋白"表示一种免疫球蛋白，其包含含有非人类 来源的抗CD52抗体（此处也称为供体抗体（例如，鼠的抗CD52抗体））的一个或多个轻 链⑶Rs (⑶R1、⑶R2和⑶R3)和一个或多个重链⑶Rs (⑶R1、⑶R2和⑶R3)的链，以及至 少一部分人类来源的免疫球蛋白（例如，来自人类来源的轻链和/或重链的骨架区，或骨 架区与恒定区，例如具有或不具有骨架改变的CDR移植抗体）。本发明的人源化免疫球 蛋白包含至少一个⑶R,该⑶R不同于Campath?中存在的至少一个⑶r(例如，不同于 相对应的〇?)。参见，例如，0&1^117等人，美国专利第4,816,567号 ；0&1^117等人，欧 洲专利第〇, 125, 023B1号；Boss等人，美国专利第4, 816, 397号；Boss等人，欧洲专利第 0, 120, 694B1 号；Neuberger, M. S.等人，WO 86/01533 ;Neuberger, M. S.等人，欧洲专利第 0, 194, 276B1 号；Winter，美国专利第 5, 225, 539 号；Winter，欧洲专利第 0, 239, 400B1 号； Padlan, E. A.等人，欧洲专利申请第0, 519, 596A1号。关于单链抗体，还可参见：Ladner等 人，美国专利第4, 946, 778号；Huston，美国专利第5, 476, 786号；以及Bird, R. E.等人， Science，242:423-426(1988)。在一些实施方式中，人源化免疫球蛋白是一种去免疫化的抗 体。参见，例如Carr等人，美国专利第7, 264, 806号，其关于已被修饰以减少潜在T细胞 表位的数量的去免疫化免疫球蛋白，由此减少免疫球蛋白在对人施用时引发免疫反应的倾 向。
[0316] 在特定的实施方式中，该人源化免疫球蛋白包含一个或多个下列鼠单克隆抗体的 一个或多个轻链CDRs和一个或多个重链CDRs :小鼠8G3. 25. 3. 5、小鼠4G7. F3、小鼠9D9. A2、小鼠 11C11.C5、小鼠 3G7.E9、小鼠 5F7. 1. 1.4、小鼠 12G6. 15. 1.2、小鼠 23E6.2.2. 1、小鼠 2C3. 3. 8. 1、小鼠 7F11. 1. 9. 7、和小鼠 4B10. 1. 2. 4。
[0317] 在另一实施方式中，该人源化免疫球蛋白以相似于或者优于Campath?的亲和性 结合至人CD52。在一个特定的实施方式中，本发明的人源化免疫球蛋白具有本发明的鼠抗 人CD52抗体的结合特异性（例如，具有对人CD52的特异性，具有相同或相似的表位特异 性），并且/或者其具有相同的抑制作用。人源化免疫球蛋白可具有本文所述的鼠抗人CD52 抗体或人源化抗人CD52抗体的结合特异性和/或抑制活性，以及/或本文所述的鼠抗人 CD52抗体或人源化抗人CD52抗体的表位特异性（例如，其可与鼠抗人CD52抗体竞争，或另 一种人源化抗⑶52抗体（例如，CampaUrK:)竞争以结合至⑶52,且/或其可具有鼠或人 源化抗人CD52抗体的抑制作用）。在一个特定的实施方式中，人源化免疫球蛋白具有鼠抗 体 8G3、4G7、9D9、11C11、3G7、5F7、12G6、23E6、2C3、7F11、和4B10中任一个的结合特异性、表 位特异性和/或抑制活性。
[0318] 人类来源的人源化免疫球蛋白部分或免疫球蛋白链的部分（例如，骨架区；恒定 区）可从任何合适的人免疫球蛋白或免疫球蛋白链获得。例如，在人源化或嵌合抗体中的 人类恒定区或其部分可从人类κ或λ轻链基因获得，和/或从人类γ (例如，γ 1、γ 2、 Υ 3、Υ 4)、μ、α (例如，α 1、α 2)、δ或ε重链基因获得，包括等位基因变体。特定的恒 定区（例如，IgGl)，其变体或其部分可被选择以适合效应功能（effector function)。例 如，突变的恒定区（变体）可被引入免疫球蛋白或免疫球蛋白链中从而使得对Fc受体的结 合和/或固定补体的能力最小化。（参见，例如，Winter等人，GB 2, 209, 757B ;Morrison等 人，W0 89/07142 ;Morgan 等人，W0 94/29351，December22, 1994)。在一个实施方式中，人 类骨架区在其结构或序列中没有变异或突变。在一个特定的实施方式中，骨架区为一种其 序列中不具有突变或变异的生殖系骨架序列。
[0319] 本文所用的术语"生殖系"（germline)表示在抗体基因和基因片段经由生殖细胞 从母代传至子代时抗体基因和基因片段的核苷酸序列和氨基酸序列。此生殖系序列与编码 成熟B细胞中抗体的核苷酸序列不同，成熟B细胞中抗体的核苷酸序列在B细胞成熟期间 已被重组和超突变事件改变。"利用"特定生殖系的抗体具有与该生殖系核苷酸序列或是与 其指定的氨基酸序列最相配的核苷酸或氨基酸序列。与生殖系序列相比，此种抗体经常是 突变的。
[0320] 在其它实施方式中，人类骨架在其结构或序列上具有来自生殖系序列的最少变异 或突变（例如，少于3、4、5、6、7、8、9、或10个受体骨架残基已被供体骨架残基取代，以改善 结合亲和性，参见Queen等人，美国专利第5, 530, 101号）。在一个特定的实施方式中，人源 化免疫球蛋白链的骨架中有限数量的氨基酸（例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个氨基酸） 被选择为与供体序列中这些位置的氨基酸相同（即，"回复突变")，而不是与受体序列相同， 以增加包含人源化免疫球蛋白链的抗体对人类CD52的亲和力。
[0321] 人类骨架区（例如，重链可变区和/或轻链可变区的）优选得自或衍生自与供 体免疫球蛋白（鼠抗CD52抗体）的抗原结合区域的类似或相当区域（例如，重链可变 区或轻链可变区）具有序列相似性的人类抗体可变区。人源化免疫球蛋白的人类来源 部分的骨架区其它来源包括人类可变区一致性序列（参见例如，Kettleborough，C.A.等 人，Protein Engineering4:773_783(1991) ;Carter 等人 W0 94/04679 ;Carter 美国专利 第6, 407, 213号））。例如，用于得到非人类部分的抗体供体序列的区域（例如，可变区的序 列）可与人类序列相比较，如 Kabat，E.A.等人 Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,U. S. Government Printing Office (1991)中所述，以选择人源化免疫球蛋白的人类部分的特 定来源，例如，骨架区来源。
[0322] 在一个实施方式中，人源化免疫球蛋白链的骨架区得自，或衍生自与非人类供体 的可变区具有至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约 75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%或至少约95%的总序列一致性的人类Ig可变 区。在一个特定的实施方式中，人源化免疫球蛋白链的骨架区得自或衍生自与非人类供体 免疫球蛋白可变区的骨架区具有至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少约65%、至少 约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、或至少约95%的总序列一致 性的人类可变区骨架区。
[0323] 在一个实施方式中，人源化免疫球蛋白的至少一个骨架区（FR)从人类来源抗体 的一个或多个链获得或由其衍生。于是，FR可包含由人类来源的一个或多个抗体（例如，由 人类免疫球蛋白链，由人类一致性序列）获得或衍生的FR1和/或FR2和/或FR3和/或 FR4。
[0324] 用于本发明的免疫球蛋白部分具有与它们的衍生来源免疫球蛋白或其变体相同 或类似的序列。此种变体包含因一个或多个残基的加入、缺失或取代（例如，保守型取代） 而不同的突变体，例如，通过一个或多个加入、缺失或取代而与亲本序列相差多至3、4、5、6、 7、8、9、或10个残基。如上文所指出，本发明的人源化免疫球蛋白包含来自本文所述的一个 或多个鼠抗CD52抗体（供体抗体）的一个或多个CDRs。可产生骨架区中的变化，例如用来 自供体抗体相对应位置的残基来取代人类来源骨架区的残基的那些变化。可产生一个或多 个突变，其包括骨架区中的一个或多个氨基酸的缺失、插入和取代。如果需要，可使用任何 合适的方法（例如在W0 98/06248中所述，其整个教导并入本文做为参考）使人源化抗体 或链中包含骨架突变，以及选择突变部位。
[0325] 本领域的技术人员将会理解，在一些情况下，鼠抗⑶52抗体的一个或多个⑶Rs侧 面相接的残基可能起作用，在一些情况下，可能直接或间接地为功能（例如，结合）所需要。 因此，在一些实施方式中，与鼠骨架的一个或多个CDRs侧面相接的一个或多个氨基酸（例 如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个侧翼氨基酸）也包含于人源化免疫球蛋白中。
[0326] 在一些实施方式中，本发明的人源化抗体的人类重链骨架区利用人类VH3-72或 VH3-23生殖系序列。在一些实施方式中，本发明的人源化抗体的人类轻链骨架区利用人类 Vk2-A18b生殖系序列。可在这些FR区域中一个或多个残基处选择性地作出回复突变，如在 下文工作实施例中所述，以改善人源化抗体的CD52结合亲和性。
[0327] "亲和性"是一种专业术语，其描述结合相互作用的强度，并且通常是指免疫球蛋 白对人类⑶52的结合整体强度。
[0328] 在一个特定的实施方式中，免疫球蛋白具有测得EC5(I值为小于10μ g/ml(例如，通 过流式细胞术所确定）的结合活性。在另一实施方式中，免疫球蛋白具有测得ec5(i值小于 5. 0 μ g/ml，或小于1. 0 μ g/ml (例如，通过流式细胞术所确定）的结合活性。
[0329] 在一些实施方式中，免疫球蛋白以300nM至ΙρΜ(即，3xl(T至1χ1(Γ12Μ)，优选 为50nM至ΙρΜ，更优选为5nM至ΙρΜ且最优选为InM至ΙρΜ的亲和性（K D ;KD = K。^(kd)/ Kon(ka))结合至人⑶52,例如，1x10_7M或更小、优选为1x10_8M或更小、更优选为1x10_ 9M或 更小、有利地是ΙχΚΓ、或更小且最优选为lxl(TnM或1χ1(Γ12Μ或更小的K D ;和/或5χ1〇? 至ΙχΚΤ?Γ1、优选为ΙχΚΓΥ1至ΙχΙΟΛ'更优选为5x10^至ΙχΙΟ^Γ 1的1(。"速率常数，例 如5χ1〇?或更小、优选为ΙχΚΓΥ1或更小、有利地是ΙχΙΟ?或更小、更优选为ΙχΙΟΛΓ 1 或更小、更优选为1χ1〇_5^或更小，且最优选为ΙχΙΟ?或更小，如通过表面等离子共振 (surface plasmon resonance)所石角定。
[0330] 显然对于本领域的技术人员而言，可使用各种方法以确定根据本文所提供的和本 领域内已知的方法所制备的免疫球蛋白具有必要的特异性（例如，结合特异性，表位特异 性）。例如，对人CD52具有结合特异性的本发明的人源化抗CD52免疫球蛋白的结合功能 可使用任何合适的方法检测，例如，监测人源化免疫球蛋白与人类CD52之间复合物的形成 (例如，包含人类CD52的膜部分；携带人类CD52的细胞，例如人类T细胞、人类B细胞；包含 并表达编码人类CD52的核酸的CH0细胞或重组宿主细胞；具有CD52氨基酸序列的肽（例 如，合成肽）；包含人类⑶52的实体支撑（support))的检定。
[0331] 本发明的免疫球蛋白（例如，本发明的人源化免疫球蛋白）结合至与特定的鼠、嵌 合或人源化单克隆抗体所结合的人CD52上的表位相同的表位，或是结合至与特定的鼠、嵌 合、或人源化单克隆抗体所结合的人类CD52上的表位重叠的人类CD52上表位的能力，可使 用本领域的技术人员所知的各种技术（包括，例如竞争性结合检定）而容易地确定。这些 可能涉及使用该特定抗体的标记形式的使用，以及在本发明的免疫球蛋白存在和不存在的 情况下对标记的抗体对于人CD52的结合的检测。
[0332] 本文所用的"表位"包含能够特异性结合至免疫球蛋白的任何蛋白决定基。表位决 定基一般由分子例如氨基酸或碳水化合物或糖侧链的化学活性表面基（groupings)组成， 并且一般具有特定的三维结构特征，以及特定的电荷特征。表位可以是"线性的"或"构象 性的"。在线性表位中，在蛋白和相互作用分子（例如抗体）之间的所有相互作用点沿蛋白 的一级氨基酸序列线性地出现。在构象表位中，相互作用点跨越蛋白上彼此分开的氨基酸 残基而出现。一旦确定了抗原上的期望表位，例如使用本发明所描述的技术，可以产生针对 该表位的抗体。或者，在发现过程中，抗体的产生和特征化可说明关于期望表位的信息。由 此信息，可以接着竞争性地筛选结合至相同表位的抗体。达到此目的的一个方法是，进行竞 争性研究以发现彼此竞争性结合的抗体，即，竞争结合至抗原的抗体。
[0333] 在一个实施方式中，为确定测试抗体是否结合至本发明人源化抗体的相同或重叠 表位，我们使得本发明的抗⑶52抗体在饱和条件下结合至⑶52,接着测定测试抗体结合至 CD52的能力。如果测试抗体能够与参考抗CD52抗体在同时间结合至CD52,则测试抗体相 对于参考抗CD52抗体结合至不同的表位。然而，如果测试抗体不能在同时间结合至CD52， 则测试抗体结合至相同表位、重叠表位、或是紧邻由本发明抗CD52抗体所结合的表位的表 位。此实验可使用ELISA、RIA、BIAC0RE?、或流式细胞术来进行。为测试抗⑶52抗体是否 与其它抗CD52抗体交叉竞争，我们可在两个方向使用上文所述的竞争方法，S卩，确定参考 抗体是否阻碍测试抗体，以及反之。在某个实施方式中，实验使用BIAC0RE?进行。
[0334] 表位分级（epitope binning)也可用于特征化本发明的抗体。术语"分级"是指基 于抗体的抗原结合特征以将抗体分组的方法。一种基于其交叉竞争而"分级"抗体的高通 量方法在国际专利申请第W003/48731号中描述。可以通过允许未标记形式的抗⑶52抗体 "A"结合至对应于⑶52序列的合成肽或⑶52阳性细胞而对"表位分级"进行调查研究。接 着加入标记的第二抗CD52抗体"B"，我们可评价相对于其中细胞或合成肽未预先暴露于抗 ⑶52抗体"A"的对照样品的标记抗体量。或者，抗⑶52抗体"A"和"B"均可标记有不同的 荧光染料或能够检测的化学剂，我们可使用能够检测标记的设备来测定能够同时吸引CD52 肽的两种标记抗体的量，或通过流式细胞术测定同时吸引CD52阳性细胞的两种抗体的量。 Biacore和Octet技术使我们可以研究未标记形式抗体的竞争性结合。未标记抗体的这种 利用是希望的，因为某些抗体的化学修饰可折中结合活性。还可参见，Jia等人，J Immunol Methods28891-98 (2004)中所描述的技术，其在进行抗体分级中也有用。
[0335] 本文还提供人源化免疫球蛋白的部分，例如轻链、重链以及轻和重链的部分。这些 免疫球蛋白部分可得自或衍生自免疫球蛋白（例如，通过还原和/或裂解），或由编码具有 期望性质（例如，结合人类CD52,序列相似性）的免疫球蛋白或其链的部分的核酸来制备 或表达。它们可由，例如，相关部分的重新合成而制备。包含人类和非人类来源的期望部分 (例如，抗原结合区、CDR、FR、C区）的人源化免疫球蛋白可使用合成和/或重组核酸来制 备，以制得编码期望的人源化链的构建体（例如，cDNA)。例如，为制备一部分免疫球蛋白 (例如，一部分链），可在期望的位置引入一个或多个终止密码子。为人源化可变区编码的 核酸（例如，DNA)序列可使用PCR突变诱发方法来构建，以改变现有的DNA序列（参见例 如，Kamman，M·，等人，Nucl. Acids Res. 17:5404(1989))。为新 CDRs 编码的 PCR 引物可杂 交至先前人源化可变区的DNA模板，其基于相同的或非常相似的人类可变区（Sato, K.，等 人，Cancer Research53:851_856(1993))。如果没有相似的DNA序列用做模板，可由合成 的寡核苷酸来构建包含编码可变区序列的序列的核酸（参见例如，Kolbinger, F.，Protein Engineering8:971-980(1993))。编码信号肽的序列也可引入核酸（例如，在合成时，在插 入载体时）。如果没有信号肽序列（例如，通常而言不存在），可使用来自其它抗体的信号 肤序列（参见例如，Kettleborough，C.A.，Protein Engineering4:773_783(1991))。使用 这些方法、本文所述的方法或其它合适方法，变体可容易地被制造。
[0336] 本发明涉及一种人源化免疫球蛋白，其对人类CD52具有结合特异性，且包含人源 化轻链和人源化重链和/或其部分。在一个实施例中，人源化免疫球蛋白包含一种含有 SEQ ID N0 :3的一个或多个CDRs (例如，所有三个CDRs)的轻链和一种含有SEQ ID N0 :16 的一个或多个⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs)的重链；一种含有SEQ ID NO :4的一个或多个 ⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs)的轻链和一种含有SEQ ID N0:17的一个或多个⑶Rs (例如，所 有三个⑶Rs)的重链；一种含有SEQ ID N0:5的一个或多个⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs)的 轻链和一种含有SEQ ID N0 :18的一个或多个⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs)的重链；一种含 有SEQ ID N0:6的一个或多个⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs)的轻链和一种含有SEQ ID N0: 19的一个或多个⑶Rs(例如，所有三个⑶Rs)的重链；一种含有SEQ ID NO :7的一个或多个 ⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs)的轻链和一种含有SEQ ID NO :20的一个或多个⑶Rs (例如，所 有三个⑶Rs)的重链；一种含有SEQ ID N0:8的一个或多个⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs)的 轻链和一种含有SEQ ID N0 :21的一个或多个⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs)的重链；一种含 有SEQ ID N0 :9的一个或多个⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs)的轻链和一种含有SEQ ID N0 : 22的一个或多个⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs)的重链；一种含有SEQ ID NO :10的一个或多 个⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs)的轻链和一种含有SEQ ID NO :23的一个或多个⑶Rs (例 如，所有三个⑶Rs)的重链；一种含有SEQ ID N0 :11的一个或多个⑶Rs(例如，所有三个 ⑶Rs)的轻链和一种含有SEQ ID N0:24的一个或多个⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs)的重链； 一种含有SEQ ID N0:12的一个或多个⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs)的轻链和一种含有SEQ ID N0 :25的一个或多个CDRs (例如，所有三个CDRs)的重链；或一种含有SEQ ID N0 :13的 一个或多个⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs)的轻链和一种含有SEQ ID N0 :26的一个或多个 ⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs)的重链。
[0337] 在一个实施例中，本发明的人源化免疫球蛋白包含重链（H)-⑶R1、H_⑶R2、 H-CDR3,轻链（L)-CDRl、L-CDR2、和 L-CDR3,其氨基酸序列：a)分别是 SEQ ID NOs :51、59、 69、29、36、和43;b)分别是SEQIDN0s:50、60、69、29、37、和43 ;c)分别是SEQIDN0s:50、 61、68、29、38、和43;d)分别是SEQIDN0s :50、61、69、29、36、和43;e)分别是SEQIDN0s: 50、62、69、29、39、和43;f)分别是SEQIDN0s:52、61、70、30、40、和43 ;g)分别是SEQID NOs :53、63、71、31、36、和44;h)分别是SEQIDN0s:54、64、71、31、36、和45 ;i)分别是SEQ ID NOs :55、63、72、31、36、和46;j)分别是SEQIDN0s:56、65、73、32、41、和47 ;k)分别是 SEQIDN0s:56、65、294、32、41、和47，或l)分别是SEQIDN0s:56、66、74、33、41、和48。
[0338] 在另一实施例中，本发明的人源化免疫球蛋白包含H-⑶R3和L-⑶R3,其序列a) 分别是 SEQ ID NOs :69 和 43 ;b)分别是 SEQ ID NOs :68 和 43 ;c)分别是 SEQ ID NOs :70 和 43 ;d)分别是 SEQ ID NOs :71 和 44 ;e)分别是 SEQ ID NOs :71 和 45 ;f)分别是 SEQ ID NOs :72 和 46 ;g)分别是 SEQ ID NOs :73 和 47 ;h)分别是 SEQ ID NOs :294 和 47 ;或 i)分 别是 SEQ ID NOs :74 和 48。
[0339] 在另一实施方式中，人源化免疫球蛋白对人类CD52具有结合特异性，且包含一种 轻链，该轻链包含选自 SEQ ID N0 :27、SEQ ID N0 :28、SEQ ID N0 :29、SEQ ID N0 :30、SEQ ID NO :31、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO :33、SEQ ID NO :34、SEQ ID NO :35、SEQ ID NO :36、 SEQ ID NO ：37, SEQ ID NO ： 38, SEQ ID N0：39,SEQ ID N0：40,SEQ ID NO ：4U SEQ ID NO： 42、SEQ ID N0:43、SEQ ID N0:44、SEQ ID N0:45、SEQ ID N0:46、SEQ ID N0:47、和 SEQ ID NO :48、或其组合的一个或多个CDRs ;和一种重链，其包含选自SEQ ID NO :49、SEQ ID NO : 50、SEQ ID NO :51、SEQ ID NO :52、SEQ ID NO :53、SEQ ID NO :54、SEQ ID NO :55、SEQ ID NO：56,SEQ ID NO ：57,SEQ ID NO：58, SEQ ID NO：59,SEQ ID NO：60,SEQ ID NO：6U SEQ ID NO :62、SEQ ID NO :63、SEQ ID NO :64、SEQ ID NO :65、SEQ ID NO :66、SEQ ID NO :67、 SEQ ID NO ：68, SEQ ID N0：69,SEQ ID N0：70,SEQ ID N0：7USEQ ID N0：72,SEQ ID NO： 73、SEQ ID NO :74、和SEQ ID NO :294、或其组合的一个或多个CDRs，其中该人源化免疫球 蛋白不是 CamPal.h_?
[0340] 在另一实施例中，对人类CD52具有结合特异性的人源化免疫球蛋白包含一种轻 链，该轻链包含SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO :12 或 SEQ ID NO :13 的 一个或多个⑶Rs (例如，所有三个⑶Rs)，和一种重链，该重链包含SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO : 17、SEQ ID NO : 18、SEQ ID NO : 19、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22、SEQ IDN0:23、SEQIDN0:24、SEQIDN0:25、SEQIDN0 :26、或SEQIDN0:137的一个或多个 CDRs (例如，所有三个CDRs)，其中该人源化免疫球蛋白不是Ca丨npatlTB)...
[0341] 本发明还涉及一种本文所述的人源化免疫球蛋白的人源化免疫球蛋白轻链。在一 个实施例中，该人源化免疫球蛋白轻链包含选自SEQ ID N0:27、SEQ ID N0:28、SEQ ID N0: 29、SEQ ID NO :30、SEQ ID NO :31、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO :33、SEQ ID NO :34、SEQ ID NO ：35, SEQ ID NO ：36, SEQ ID NO ：37, SEQ ID NO ：38, SEQ ID NO ：39, SEQ ID NO ：40, SEQ ID NO :41、SEQ ID NO :42、SEQ ID NO :43、SEQ ID NO :44、SEQ ID NO :45、SEQ ID NO :46、 SEQ ID NO :47、和SEQ ID NO :48、和其组合的一个或多个CDRs，其中该人源化免疫球蛋白 轻链不是Campath?的轻链。例如，该人源化抗体具有L-⑶Rl、L-⑶R2、和L-⑶R3,其氨基 酸序列：a)分别为 SEQ ID NOs :29、36、和 43 ;b)分别为 SEQ ID NOs :29、37、和 43 ;c)分别 为 SEQ ID NOs :29、38、和 43 ;d)分别为 SEQ ID NOs :29、36、和 43 ;e)分别为 SEQ ID NOs : 29、39、和 43 ;f)分别为 SEQ ID NOs :30、40、和 43 ;g)分别为 SEQ ID NOs :31、36、和 44 ;h) 分别为 SEQ ID NOs :31、36、和 45 ;i)分别为 SEQ ID NOs :31、36、和 46 ;j)分别为 SEQ ID NOs :32、41、和 47 ;或 k)分别为 SEQ ID NOs :33、41、和 48。
[0342] 本发明还涉及一种人源化重链，其包含选自SEQ ID N0:49、SEQ ID N0:50、SEQ ID NO :51、SEQ ID NO :52、SEQ ID NO :53、SEQ ID NO :54、SEQ ID NO :55、SEQ ID NO :56、SEQ ID NO ：57, SEQ ID NO ：58, SEQ ID NO ：59, SEQ ID NO ：60, SEQ ID NO ：6U SEQ ID NO ：62, SEQ ID N0:63、SEQ ID N0:64、SEQ ID N0:65、SEQ ID N0:66、SEQ ID N0:67、SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO ：69, SEQ ID NO ：70, SEQ ID NO ：7U SEQ ID NO ：72, SEQ ID NO ：73, SEQ ID NO :74、和SEQ ID NO :294、或其组合的一个或多个⑶Rs，其中该人源化免疫球蛋白重链不 是Campath.K的重链。例如，该人源化抗体具有H-⑶Rl、H-⑶R2、和H-⑶R3,其氨基酸序 列：a)分别为 SEQ ID NOs :51、59、和 69 ;b)分别为 SEQ ID NOs :50、60、和 69 ;c)分别为 SEQ ID NOs :50、61、和 68 ;d)分别为 SEQ ID NOs :50、61、和 69 ;e)分别为 SEQ ID NOs :50、62、 和 69 ;f)分别为 SEQ ID NOs :52、61、和 70 ;g)分别为 SEQ ID NOs :53、63、和 71 ;h)分别为 SEQ ID NOs :54、64、和 71 ;i)分别为 SEQ ID NOs :55、63、和 72 ; j)分别为 SEQ ID NOs :56、 65、和 73 ;k)分别为 SEQ ID NOs :56、65、和 294 ;或 1)分别为 SEQ ID NOs :56、66、和 74。
[0343] 在一个实施方式中，本发明的人源化抗体包含一种轻链，其包含SEQ ID NOs :102、 138、145-148、153-157、和164-168其中一个的可变区（')序列。在一个相关实施方式中， 该人源化抗体包含一种轻链，其氨基酸序列包含SEQ ID NOs :273、275、278、280、和282其 中之一或由其组成。
[0344] 在一个实施方式中，本发明的人源化抗体包含一种重链，其包含SEQ ID NOs :103、 136、137、139-144、149-152、和158-163其中一个的可变区（￥11)序列。在一个相关实施方 式中，该人源化抗体包含一种重链，其氨基酸序列包含SEQ ID N0s:272、274、276、277、279、 和281其中一个或由其组成。
[0345] 在一些实施方式中，本发明的人源化抗体包含V!^P'，其氨基酸序列包含或由下 列组成
[0346] a)分别为 SEQ ID NOs :103 与 102(4B10_H1/K1);
[0347] b)分别为 SEQ ID NOs :136 与 138(7F11-SFD1/K2);
[0348] c)分别为 SEQ ID NOs :137 与 138(7F11-SFD2/K2);
[0349] d)分别为 SEQ ID NO :139 与 SEQ ID NOs :145-148 其中一个（例如，分别为 SEQ ID NOs :139 与 146(2C3-SFD1/K11);和分别为 SEQ ID NOs :139 与 147(2C3-SFD1/K12));
[0350] e)分别为 SEQ ID NO :140 与 SEQ ID NOs :145-148 其中一个；
[0351] f)分别为 SEQ ID NO :141 与 SEQ ID NOs :145-148 其中一个；
[0352] g)分别为 SEQ ID NO :142 与 SEQ ID NOs :145-148 其中一个；
[0353] h)分别为 SEQ ID NO :143 与 SEQ ID NOs :145-148 其中一个；
[0354] i)分别为 SEQ ID NO :144 与 SEQ ID NOs :145-148 其中一个；
[0355] j)分别为 SEQ ID NO :149 与 SEQ ID NOs :153-157 其中一个（例如，分别为 SEQ ID NOs :149 与 155(12G6-SFD1/K11);分别为 SEQ ID NOs :149 与 156(12G6-SFD1/K12);和 分别为 SEQ ID NOs :149 与 157(12G6-SFD1/K13));
[0356] k)分别为 SEQ ID NO :150 与 SEQ ID NOs :153-157 其中一个；
[0357] 1)分别为 SEQ ID NO :151 与 SEQ ID NOs :153-157 其中一个；
[0358] m)分别为 SEQ ID NO :152 与 SEQ ID NOs :153-157 其中一个；
[0359] n)分别为 SEQ ID NO :158 与 SEQ ID NOs :164-168 其中一个（例如，分别为 SEQ ID NOs :158 与 165(9D9-H10/K12);和分别为 SEQ ID NOs :158 与 166(9D9-H10/K13));
[0360] o)分别为 SEQ ID NO :159 与 SEQ ID NOs :164-168 其中一个（例如，分别为 SEQ ID NOs :159 与 165(9D9-H11/K12);和分别为 SEQ ID NOs :159 与 166(9D9-H11/K13));
[0361] p)分别为 SEQ ID NO :160 与 SEQ ID NOs :164-168 其中一个；
[0362] q)分别为 SEQ ID NO :161 与 SEQ ID NOs :164-168 其中一个（例如，分别为 SEQ ID NOs :161 与 166(9D9-H16/K13));
[0363] r)分别为 SEQ ID NO :162 与 SEQ ID NOs :164-168 其中一个；或
[0364] s)分别为 SEQ ID NO :163 与 SEQ ID NOs :164-168 其中一个（例如，分别为 SEQ ID NOs : 163 与 166 (9D9-H18/K13))。
[0365] 包含于括号的抗体在下列工作实施例中进一步叙述。
[0366] 在一个实施方式中，本发明的人源化抗体包含轻链（LC)和重链（HC)，其氨基酸序 列包含或由下列组成a)分别为SEQ ID NOs :273和272 ;b)分别为SEQ ID NOs :275和274 ; C)分别为 SEQ ID NOs :278 和 276 ;d)分别为 SEQ ID NOs :278 和 277 ;e)分别为 SEQ ID NOs :280 和 279 ;或 f)分别为 SEQ ID NOs :282 和 281。
[0367] 本发明还提供一种抗人CD52抗体（除了在现有技术中已知的那些（如果有）），其 结合至与本文举例说明的抗体所结合的表位相同的表位，或与其竞争或交叉竞争。这些抗 体可以是，例如，人源化的、嵌合的、或鼠抗体。例如，本发明提供一种抗人CD52抗体，其结 合至与鼠抗体 8G3、4F7、9D9、11C11、3G7、5F7、12G6、23E6、2C3、7F11 和 4B10 以及这些鼠抗体 的人源化和嵌合抗体的其中一个所结合的表位相同的表位，或与其中一个抗体竞争或交叉 竞争。抗体结合至与参考抗体所结合的表位相同的表位的能力或与其竞争或交叉竞争的能 力可如上文所述而确定。例如，我们发现由人源化抗体2C3-SFD1/K12和12G6-SFD1/K12所 结合的CD52表位包含SEQ ID N0:104中的残基7、8、和11，且由人源化抗体9D9-H16/K13 所结合的表位包含SEQ ID NO :104中的残基4和11。因此，在一些实施方式中，本发明提 供一种抗CD52抗体，其结合至与那些人源化抗体所结合的表位相同的表位，或与其竞争或 交叉竞争。
[0368] 如果希望，例如，为诊断或检测目的（例如，成像以允许，比如治疗监测），人源化 免疫球蛋白（例如，其抗原结合片段）可包含可检测的标记。合适的可检测标记和人源化 免疫球蛋白或其抗原结合片段的标记方法为本领域所已知。合适的可检测标记包括，例如， 放射性同位素（例如，铟-111、锝-99m或碘-131)、正电子发射型标记（例如，氟-19)、顺磁 离子（例如，钆（III)、锰（II))、表位标记（标签）、亲和性标记（例如，生物素、抗生物素蛋 白）、自旋标记、酶、荧光基团或化学发光基团。当未使用标记时，复合物形成（例如，在人源 化免疫球蛋白和人类⑶52之间）可通过表面等离子共振、ELISA、FACS、或其它合适方法来 确定。
[0369] 用于本发明的抗⑶52抗体也可经由例如，化学反应或基因修饰而共轭至其它部 分（moieties)(例如，聚乙二醇化部分），上述部分改善抗体的药物动力学特性，例如半衰 期。在一些实施方式中，用于本发明的抗CD52抗体可经由例如，化学共轭或基因修饰（例 如，将框内细胞因子的编码序列附加至抗体编码序列，由此产生抗体：细胞因子融合蛋白） 而连接至合适的细胞因子。
[0370] 本发明还涉及一种免疫偶联，其中本发明的人源化免疫球蛋白（例如，其抗原结 合片段）偶合至另一治疗剂，例如生物活性化合物（例如，细胞因子、超抗原、细胞毒性剂和 毒素）。例如，对人类CD52具有结合特异性的人源化免疫球蛋白（例如，其抗原结合片段） 可偶合至生物蛋白，植物或细菌来源的分子（或其衍生物）、白介素-2抗体或白喉毒素抗 体。
[0371] 小鼠单克降免疫球蛋白
[0372] 如本文所述，已制造出对人类CD52具有结合特异性的小鼠单克隆免疫球蛋白。本 发明的人源化和嵌合抗体可衍生自本发明的小鼠单克隆抗体。也就是说，在一些实施方式 中，本发明的人源化和嵌合抗CD52抗体包含取自本发明小鼠单克隆抗体的序列，例如一个 或多个CDR序列。本发明的小鼠单克隆免疫球蛋白包含具有与已知的鼠抗CD52单克隆抗 体的CDR氨基酸序列（例如，与CF1D12)不同的CDR氨基酸序列的轻链和重链。
[0373] 本文所用的术语"小鼠单克隆免疫球蛋白"表示一种包含鼠抗人CD52抗体的轻链 CDRs (L-CDR1、L-CDR2 和 L-CDR3)和重链 CDRs (H-CDR1、H-CDR2 和 H-CDR3)以及鼠来源的骨 架区和恒定区的免疫球蛋白。小鼠单克隆免疫球蛋白是一种例如通过使用杂交瘤技术或重 组方法所制备的单一特异性的均质性（homogeneous)抗体。
[0374] 本发明涉及一种本文所述的小鼠单克隆免疫球蛋白，其包含小鼠单克隆免疫球 蛋白的抗原结合片段（即，部分）、小鼠单克隆免疫球蛋白的轻链、小鼠单克隆免疫球蛋 白的重链、以及这些重链和轻链的片段。在一个特定的实施方式中，小鼠单克隆抗体是 鼠 8G3. 25. 3. 5 (也称为 GENZ8G3. 25. 3. 5 或 8G3)、鼠 GMA4G7. F3 (也称为 4G7. F3 或 4G7)、 鼠 GMA9D9. A2(也称为 9D9. A2 或 9D9)、鼠 GMA11C11. C5(也称为 11C11. C5 或 11C11)、鼠 GMA3G7. E9 (也称为 3G7. E9 或 3G7)、鼠 5F7. 1. 1. 4 (也称为 GENZ5F7. 1. 1. 4 或 5F7)、鼠 12G6. 15. 1. 2 (也称为 GENZ12G6. 15. 1. 2 或 2G6)、鼠 23E6. 2. 2. 1 (也称为 GENZ23E6. 2. 2. 1 或 23E6)、鼠 2C3. 3. 8. 1 (也称为 GENZ2C3. 3. 8. 1 或 2C3)、鼠 7F11. 1. 9. 7 (也称为 GENZ7F1L L 9. 7 或 7F11)、或是鼠 4BKX L 2. 4(也称为 GENZ4B10. L 2. 4 或 4B10)。本发明 涉及一种成熟小鼠单克隆免疫球蛋白，例如经过处理以移除重链和轻链信号肽之后的小鼠 单克隆免疫球蛋白和/或涉及糖基化免疫球蛋白。本发明还涉及一种未成熟或前体蛋白， 例如包含信号肽的小鼠免疫球蛋白轻链或小鼠免疫球蛋白重链。本发明还涉及一种编码这 些未成熟或成熟蛋白的核酸分子（例如，载体），涉及包含此种核酸的宿主细胞，并涉及这 些未成熟和成熟蛋白的制造方法。
[0375] 对人类CD52具有结合特异性的小鼠单克隆免疫球蛋白的结合功能可使用任何合 适方法检测，例如，使用监测小鼠单克隆免疫球蛋白与人类CD52 (例如，包含人类CD52的膜 部分，或携带人类CD52的细胞，例如人类T细胞、人类B细胞、包含编码人类CD52的核酸的 CH0细胞或重组宿主细胞；具有CD52氨基酸序列的肽（例如，合成肽））之间复合物形成的 检定。
[0376] 本文还提供鼠免疫球蛋白的部分，其包含轻链、重链以及轻链和重链的部分。这些 免疫球蛋白部分可得自或衍生自免疫球蛋白（例如，通过还原和/或裂解），或者编码具有 期望性质（例如，结合人类CD52,序列相似性）的一部分免疫球蛋白或其链的核酸可被制备 或表达。它们可通过，例如相关部分的重新合成所制备。包含鼠来源的期望部分（例如，抗 原结合区域、CDR、FR、和/或C区）的小鼠单克隆免疫球蛋白可使用合成和/或重组的核 酸来制备，以制得编码期望的单克隆免疫球蛋白链的构建体（例如，cDNA)。为制备一部分 链，可在期望位置引入一个或多个终止密码子。也可将编码信号肽的序列引入核酸（例如， 在合成时，在插入载体中时）。如果没有天然信号肽序列，可使用来自其它抗体的信号肽序 列（参见例如，Kettleborough，C·A·，ProteinEngineering4:773-783(1991))。使用这些 方法、本文所述的方法或其它合适方法，可以很容易地制备出变体。
[0377] 在一个实施方式中，本发明的小鼠单克隆免疫球蛋白包含含有SEQ ID N0 :3的轻 链和含有SEQ ID N0 :16的重链；含有SEQ ID N0 :4的轻链和含有SEQ ID N0 :17的重链； 含有SEQ ID N0 :5的轻链和含有SEQ ID N0 :18的重链；含有SEQ ID N0 :6的轻链和含有 SEQIDN0:19的重链；含有SEQIDN0:7的轻链和含有SEQIDN0 :20的重链；含有SEQID N0 :8的轻链和含有SEQ ID N0 :21的重链；含有SEQ ID N0 :9的轻链和含有SEQ ID N0 :22 的重链；含有SEQ ID NO :10的轻链和含有SEQ ID NO :23的重链；含有SEQ ID NO : 11的轻 链和含有SEQ ID NO :24的重链；含有SEQ ID NO :12的轻链和含有SEQ ID NO :25的重链； 或含有SEQ ID NO :13的轻链和含有SEQ ID NO :26的重链。
[0378] 在另一实施方式中，本发明还涉及一种对人类CD52具有结合特异性的小鼠单克 隆抗体，其包含选自 SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0: 7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :12、和 SEQ ID NO :13 的轻链可变区；以及选自 SEQ ID NO :16、SEQ ID NO :17、SEQ ID NO :18、SEQ ID NO : 19、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :25、和SEQ ID NO :26的重链可变区。
[0379] 如果希望，例如，为诊断或检定目的（例如，成像），小鼠单克隆免疫球蛋白（例 如，其抗原结合片段）可包含可检测标记。合适的可检测标记和小鼠单克隆免疫球蛋白 的标记方法是本领域内所已知的。合适的可检测标记包括，例如，放射性同位素（例如， 铟-111、锝-99m或碘-131)、正电子放射型标记（例如，氟-19)、顺磁离子（例如，钆（III)、 锰（II))、表位标记（标签）、亲和性标记（例如，生物素、抗生物素蛋白）、自旋标记、酶、荧 光基团或化学发光基团。当未使用标记时，复合物形成（例如，在小鼠单克隆免疫球蛋白和 CD52之间）可通过表面等离子共振或其它合适的方法来确定。上述针对本发明的人源化抗 体的所有合适方法和技术也可在本文中使用。
[0380] 嵌合免疫球蛋白
[0381] 如本文所叙述，已制造对人类CD52具有结合特异性的嵌合免疫球蛋白。该嵌合免 疫球蛋白包含嵌合轻链和/或嵌合重链，其氨基酸序列不同于对人类CD52具有结合特异性 的已知嵌合抗体的氨基酸序列。
[0382] 本文所用的术语"嵌合免疫球蛋白"是指一种重组蛋白，其包含含有衍生自一种物 种的抗体的互补决定区（CDRs)的可变区，该抗体优选为鼠抗人CD52单克隆抗体，而抗体分 子的恒定区衍生自不同物种的抗体，例如来自人类抗体。
[0383] 本发明涉及本文所述的嵌合免疫球蛋白，其包含嵌合免疫球蛋白的抗原结合片段 (即，部分）、嵌合免疫球蛋白的嵌合轻链和嵌合重链以及这些嵌合轻链和重链的片段。本 发明涉及一种成熟嵌合免疫球蛋白，例如经过处理以移除重链和轻链信号肽之后的嵌合免 疫球蛋白和/或涉及糖基化免疫球蛋白。本发明还涉及一种未成熟或前体蛋白质，例如 包含信号肽的嵌合重链。本发明还涉及编码这些未成熟或成熟蛋白的核酸分子（例如，载 体），涉及包含此种核酸的宿主细胞，并且涉及这些未成熟及成熟蛋白的制备方法。
[0384] 对人类CD52具有结合特异性的嵌合免疫球蛋白的结合功能可使用任何合适方法 检测，例如使用监测嵌合免疫球蛋白与人类CD52 (例如，包含人类CD52的膜部分，或在携带 人类CD52的细胞上，例如人类T细胞、人类B细胞、包含编码人类CD52的核酸的CH0细胞 或重组宿主细胞、具有CD52氨基酸序列的肽（例如，合成肽））之间复合物形成的检定。
[0385] 本文还提供嵌合免疫球蛋白的部分，其包含轻链、重链以及轻链和重链的部分。这 些免疫球蛋白部分可得自或衍生自免疫球蛋白（例如，通过还原和/或裂解），或者编码具 有期望性质（例如，结合人类CD52,序列相似性）的一部分免疫球蛋白或其链的核酸可被制 造或表达。它们可通过例如一部分的重新合成所制备。包含人类及非人类来源的期望部分 (例如，抗原结合区、CDR、FR、和/或C区）的嵌合免疫球蛋白可使用合成和/或重组核酸 来制备，以制得编码期望的嵌合链的构建体（例如，cDNA)。为制备一部分链，可在期望位置 引入一个或多个终止密码子。也可将编码信号肽的序列引入核酸（例如，在合成时，在插入 载体中时）。如果没有天然信号肽序列（例如，通常不存在），可使用来自其它抗体的信号 肤序列（参见例如，Kettleborough，C. A·，Protein Engineering4:773_783(1991))。使用 这些方法、本文所述的方法或其它合适方法，可以容易地制造出变体。
[0386] 在一个实施方式中，本发明的嵌合免疫球蛋白包含SEQ ID N0 :3的轻链可变区和 SEQ ID N0 :16的重链可变区；SEQ ID N0 :4的轻链可变区和SEQ ID N0 :17的重链可变区； SEQ ID N0:5的轻链可变区和SEQ ID N0:18的重链可变区；SEQ ID N0:6的轻链可变区和 SEQ ID N0 :19的重链可变区；SEQ ID N0 :7的轻链可变区和SEQ ID N0 :20的重链可变区； SEQ ID N0 :8的轻链可变区和SEQ ID N0 :21的重链可变区；SEQ ID N0 :9的轻链可变区和 SEQIDN0:22的重链可变区；SEQIDN0:10的轻链可变区和SEQIDN0 :23的重链可变区； SEQ ID N0 :11的轻链可变区和SEQ ID N0 :24的重链可变区；SEQ ID N0 :12的轻链可变区 和SEQ ID N0 :25的重链可变区；或是SEQ ID N0 :13的轻链可变区和SEQ ID N0 :26的重 链可变区。
[0387] 本发明还涉及一种对人类CD52具有结合特异性的嵌合抗体，其包含选自以下部 分的轻链可变区序列：SEQ ID N0:3的轻链可变区、SEQ ID N0:4的轻链可变区、SEQ ID N0: 5的轻链可变区、SEQ ID NO :6的轻链可变区、SEQ ID NO :7的轻链可变区、SEQ ID NO :8的 轻链可变区、SEQ ID NO :9的轻链可变区、SEQ ID NO :10的轻链可变区、SEQ ID NO :11的 轻链可变区、SEQ ID NO :12的轻链可变区和SEQ ID NO :13的轻链可变区，以及选自以下部 分的重链可变区序列：SEQ ID N0 :16的重链可变区、SEQ ID N0 :17的重链可变区、SEQ ID NO :18的重链可变区、SEQ ID NO :19的重链可变区、SEQ ID NO :20的重链可变区、SEQ ID NO :21的重链可变区、SEQ ID NO :22的重链可变区、SEQ ID NO :23的重链可变区、SEQ ID NO :24的重链可变区、SEQ ID NO :25的重链可变区和SEQ ID NO :26的重链可变区。
[0388] 本发明还涉及一种嵌合轻链，其包含SEQ ID N0 :3、SEQ ID N0 :4、SEQ ID N0 :5、 SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO : 10、SEQ ID NO : 11、 SEQ ID NO :12、或 SEQ ID NO :13 的可变区。
[0389] 本发明还涉及一种嵌合重链，其包含SEQ ID NO : 16、SEQ ID NO : 17、SEQ ID NO : 18,SEQ ID NO：19,SEQ ID NO：20,SEQ ID NO ：2U SEQ ID NO：22,SEQ ID NO：23,SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :25 或 SEQ ID NO :26 的可变区。
[0390] 如果希望，例如，为诊断或检定目的（例如，成像），嵌合免疫球蛋白（例如，其抗 原结合片段）可包含可检测的标记。合适的可检测标记和嵌合免疫球蛋白的标记方法是本 领域内所已知的。合适的可检测标记包含，例如，放射性同位素（例如，铟-111、锝-99m或 碘-131)、正电子放射型标记（例如，氟-19)、顺磁离子（例如，钆（III)、锰（II))、表位标 记（标签）、亲和性标记（例如，生物素、抗生物素蛋白）、自旋标记、酶、荧光基团或化学发 光基团。当未使用标记时，复合物形成（例如，在嵌合免疫球蛋白和人类CD52之间）可通 过表面等离子共振或其它合适的方法而确定。上文针对本发明的人源化抗体所叙述的所有 合适方法和技术可在本文中使用。
[0391] 核酸和重纟目载体
[0392] 本发明还涉及一种分离的和/或重组的（包含，例如，基本上纯的）核酸，其包含 编码本发明的人源化免疫球蛋白、人源化轻链、人源化重链、小鼠单克隆免疫球蛋白、小鼠 免疫球蛋白轻链、小鼠免疫球蛋白重链、嵌合免疫球蛋白、嵌合轻链或嵌合重链的序列。
[0393] 本文称为"分离"或"纯化"的核酸是已从其起源的基因组DNA或细胞RNA的核酸 (例如，在它们存在于细胞中或存在于例如文库的核酸混合物中时）分离的核酸，并且包含 通过本文所述的方法或其它合适方法所得到的核酸，包括大体上纯的核酸，通过化学合成、 通过生物和化学方法的组合所制备的核酸，和分离的重组核酸（参见例如，Daugherty, B. L.等人，Nucleic Acids Res. ,19(9) :2471-2476 (1991) ;Lewis，A. Ρ· and J.S. Crowe, Gene ,101:297-302(1991)) 〇
[0394] 本文称为"重组"的核酸是通过重组DNA方法所制备的核酸，其包含通过依赖于人 工重组方法的步骤而产生的那些核酸（例如聚合酶链反应（PCR)和/或使用限制性酶克隆 至载体中）。"重组"核酸也为那些产生于在细胞自然机制过程中发生的重组事件，但在将 设计的核酸引至细胞之后对其进行选择，以允许并使得期望的重组事件可发生。
[0395] 本发明还更具体地涉及一种分离的和/或重组的核酸，其包含编码对人类CD52具 有结合特异性的人源化免疫球蛋白、小鼠免疫球蛋白或嵌合免疫球蛋白的核苷酸序列（例 如，本发明的人源化免疫球蛋白，其中非人类部分（例如，CDRs)衍生自鼠抗CD52单克隆抗 体；本发明的小鼠免疫球蛋白；或本发明的嵌合免疫球蛋白，其中非人类部分（例如，％和 ')衍生自鼠抗CD52单克隆抗体）或其（例如，其重链或轻链）部分（例如，抗原结合部 分））。
[0396] 本发明的核酸可用于制备对人类CD52具有结合特异性的人源化免疫球蛋白、对 人类CD52具有结合特异性的小鼠免疫球蛋白和对人类CD52具有结合特异性的嵌合免疫球 蛋白。例如，一种核酸（例如，DNA(例如cDNA)，或RNA)或一个或多个编码本发明的人源化 免疫球蛋白、小鼠免疫球蛋白或嵌合免疫球蛋白的核酸可引入合适的构建体（例如，重组 载体），以在合适的宿主细胞中进一步操作序列或制备所编码的免疫球蛋白。
[0397] 本发明还提供适合用于表达对人类⑶52具有结合特异性的人源化免疫球蛋白、 对人类CD52具有结合特异性的小鼠免疫球蛋白或对人类CD52具有结合特异性的嵌合免疫 球蛋白的构建体或载体（例如，表达载体）。多种载体为可得到的，其包括在宿主细胞中以 单拷贝或多拷贝维持的载体，或整合至宿主细胞的染色体的载体。可将构建体或载体引入 至合适的宿主细胞中，可制备出表达本发明的人源化免疫球蛋白、小鼠免疫球蛋白或嵌合 免疫球蛋白的细胞并将其保持在培养物中。单个载体或多个载体可用于表达对人类CD52 具有结合特异性的人源化免疫球蛋白、小鼠免疫球蛋白或嵌合免疫球蛋白。
[0398] 合适的表达载体，例如哺乳动物细胞表达载体，也可包含数个组成部分，包括，但 不限于下列的一种或多种：复制起点；选择性标记基因；一个或多个表达控制元件，例如转 录控制元件（例如，启动子、增强子、终止子）、和/或一个或多个翻译信号；用于膜靶向或 分泌的信号序列或前导序列。在一个构建体或载体中，信号肽序列可由构建体或载体或其 它来源提供。例如，可使用免疫球蛋白的转录和/或翻译信号来指导表达。
[0399] 可提供启动子用于在合适的宿主细胞中表达。启动子可以是组成型或是诱导型。 例如，启动子可以可操作地连接至编码人源化免疫球蛋白或免疫球蛋白链的核酸，使得其 指导所编码的多肽的表达。多种适合于原核生物宿主的启动子（例如，大肠杆菌的lac、 tac、T3、T7启动子）和多种适合于真核生物宿主的启动子（例如，酵母醇脱氢酶（ADH1)、 SV40、CMV)是可得到的。本领域的技术人员能够选择适当的启动子以表达本发明的抗CD52 抗体或其部分。
[0400] 此外，载体（例如，表达载体）通常包含选择性标记，以选择携带载体的宿主细胞， 并且在可复制载体的情况下，包含复制起点。编码赋予抗生素抗性或抗药性的产物的基 因是通常的选择性标记并且可用于原核生物中（例如，β-内酰胺酶基因（氨苄青霉素抗 性）、Tet基因（四环素抗性））和真核细胞中（例如,新霉素（neomycin) (G418或遗传霉素 (geneticin))、gpt (霉酚酸）、氨苄青霉素、或潮霉素抗性基因）。二氢叶酸还原酶标记基因 允许在多种宿主中的甲氨蝶呤选择。编码宿主的营养缺陷标记的基因产物的基因（例如， LEU2、URA3、HIS3)常用作酵母菌中的选择性标记。还包含病毒（例如，杆状病毒）或噬菌 体载体、和能够整合至宿主细胞基因组的载体（例如反转录病毒载体）的使用。
[0401] 因此，本发明涉及一种分离的核酸分子，其编码本发明的人源化免疫球蛋白、人源 化轻链、人源化重链、小鼠免疫球蛋白、小鼠免疫球蛋白轻链、小鼠免疫球蛋白重链、嵌合免 疫球蛋白、嵌合轻链或嵌合重链。本发明还涉及一种分离的核酸分子，其编码免疫球蛋白的 抗原结合部分及其链。由本发明的核酸所编码的多肽序列在上文和以下工作实施例中描 述。
[0402] 在一些实施方式中，本发明的核酸和载体编码本发明的重链（或其抗原结合部 分）或轻链（或其抗原结合部分）。可使用包含编码重链的核酸与编码轻链的核酸的宿主 细胞以制备包含重链和轻链（或抗体的抗原结合部分）的抗体。可将编码重链的核酸与编 码轻链的核酸置于单独的表达载体中。也可将它们置于单个表达载体，受相同或不同的表 达控制。参见例如，Cabilly美国专利第6, 331，415号；Fang美国专利第7, 662, 623号。
[0403] 对人类CD52具有特异件的免疫球蛋白的制诰方法
[0404] 本发明的另一方面涉及一种本发明的抗人CD52抗体的制造方法。本发明的抗 体可，例如通过在适合的宿主细胞中表达编码抗体的一个或多个重组核酸而制备。宿 主细胞可使用任何合适的方法制造。例如，可将本文所叙述的表达构建体（例如，该 一个或多个载体，例如，哺乳动物细胞表达载体）引入至合适的宿主细胞，并且可在适 合构建体或载体表达的条件下维持所产生的细胞（例如，在培养物中，在动物中，在植 物中）。合适的宿主细胞可以是原核生物的，包括细菌细胞例如大肠杆菌（例如，菌种 DH5 a ?(Invitrogen, Carlsbad, CA)),枯草杆菌（B. subtilis)和 / 或其它合适的细菌； 真核生物细胞，例如真菌或酵母菌细胞（例如，巴氏毕赤酵母菌（Pichia pastoris)、曲 霉菌（Aspergillus sp·)、酿酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母菌 (Schizosaccharomyces pombe)、粗糖脉抱菌（Neurospora crassa))，或其它低级真核细 胞，和高级真核细胞例如来自昆虫的那些细胞（例如，Drosophila Schnieder S2细胞、Sf9 昆虫细胞 W0 94/26087(0' Connor)、TN5B1-4(HIGH5)昆虫细胞（Invitrogen)，哺乳动物 (例如，C0S 细胞，例如 C0S-1(ATCC Accession No. CRL-1650)和 C0S-7(ATCC Accession No. CRL-1651)、CH0(例如，ATCC Accession No. CRL-9096)、CH0 DG44(Urlaub，G.和 Chasin,LA. , Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 77(7):4216-4220(1980)),293(ATCC Accession No.CRL-1573)、HeLa(ATCC Accession No. CCL-2)、CV1(ATCC Accession No.CCL-70)、 TOP(Dailey, L.，等人，J. Virol.，54:739-749(1985))、3T3、293T (Pear, W. S.，等人汁!·。。· Natl. Acad. Sci. U. S. A.，90:8392-8396 (1993))、NS0 细胞、SP2/0 细胞、HuT78 细胞和类似 细胞）），或植物（例如，烟草、浮萍属（浮萍）（Lemna(duckweed))、和藻类），（参见，例如， Ausubel, F. M.等人，eds. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley&Sons Inc. (1993))。在一些实施方式中，该宿主细胞不是多 细胞生物（例如，植物或动物）的一部分，例如，其是分离的宿主细胞或者是细胞培养物的 一部分。
[0405] 本发明还涉及包含本发明的核酸例如载体（例如，表达载体）的细胞。例如，可将 编码人源化免疫球蛋白的重链和轻链、小鼠免疫球蛋白的重链和轻链、或嵌合免疫球蛋白 的重链和轻链的核酸（即，一个或多个核酸），或包含此种核酸的构建体（即，一个或多个构 建体，例如，一个或多个载体）通过适合于所选择宿主细胞的方法（例如，转化、转染、电穿 孔法、感染）引入至合适的宿主细胞中（其中所编码的免疫球蛋白对人类CD52具有结合特 异性），且核酸被或变为可操作地连接至一个或多个表达控制元件（例如，在载体中，在通 过细胞中的处理所产生的构建体中，整合至宿主细胞基因组中）。可将宿主细胞维持在适合 表达的条件下（例如，在诱导物、添加有适当盐类、生长因子、抗生素、营养补充物等的合适 培养基的存在下），由此制备所编码的多肽。如果希望，可将所编码的蛋白（例如，人源化免 疫球蛋白、小鼠免疫球蛋白、嵌合免疫球蛋白）从，例如，宿主细胞、培养基、或乳液中分离。 此方法包含在转基因动物或植物（例如，烟草）的宿主细胞（例如，乳腺细胞）中的表达 (参见，例如，W0 92/03918)。
[0406] 可制备融合蛋白，其中免疫球蛋白部分（例如，人源化免疫球蛋白；免疫球蛋白 链）在N端位置、C端位置或融合蛋白内部连接至非免疫球蛋白部分（即，在自然界未发 现存在于免疫球蛋白的部分）。例如，一些实施方式中，可通过将编码免疫球蛋白序列的 核酸插入至合适的表达载体，例如PET载体（例如，pET-15b，Novagen)、噬菌体载体（例 如，pCANTAB5E, Pharmacia)、或其它载体（例如，pRIT2T蛋白A融合载体，Pharmacia)而 制备。可将得到的构建体引入合适的宿主细胞中以表达。在表达时，可通过合适的亲和 基质（affinity matrix)从细胞溶解产物分离或纯化一些融合蛋白（参见，例如，Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F. Μ·等人，Eds.，Vol. 2, Suppl. 26, ρρ· 16. 4· 1 -16. 7. 8(1991))。
[0407] 本发明涉及一种宿主细胞，其包含编码本文提供的免疫球蛋白（例如，本发明的 人源化免疫球蛋白、人源化轻链或人源化重链、小鼠免疫球蛋白、鼠轻链或鼠重链、嵌合免 疫球蛋白、嵌合重链、或嵌合轻链）的重组核酸。本发明还涉及一种宿主细胞，其包含编码 免疫球蛋白的抗原结合部分或其链的重组核酸。在一些实施方式中，该宿主细胞包含本文 所提及的本发明的重组载体（例如，表达载体，哺乳动物细胞表达载体）。
[0408] 本发明还涉及一种本发明的免疫球蛋白或免疫球蛋白多肽链的制备方法。在一个 实施方式中，该方法包括将本文所叙述的本发明的宿主细胞（例如，包含一个或多个编码 免疫球蛋白或多肽链（例如，本发明的轻链和重链、仅轻链、或仅重链）的分离的核酸的宿 主细胞）维持在适合免疫球蛋白或多肽链表达的条件下。例如，宿主细胞可培养于基质上 或于悬浮液中。在一些实施方式中，该方法进一步包含纯化或分离免疫球蛋白或多肽链的 步骤。
[0409] 本发明还涉及一种通过噬菌体呈现法来制备免疫球蛋白的方法。例如，可淘选 CD52抗原上的天然抗体噬菌体展示库。或者，可使用通过导向选择的免疫球蛋白制备方法 (美国专利申请US 2006-0251658A1.)。可产生围绕例如已知的抗⑶52抗体的固定重链 (和/或轻链）CDR3区域建立的定制库（custom library)。重链和轻链的CDR1和CDR2区 域可来源于天然集合（na'ive repertoire) (Osburn 等人，Methods, 36:61-68(2005))。在一 个实施方式中，抗⑶52ScFvs可由ScFv天然抗体库产生，此抗体库用于获得具有期望的结 合性质的鼠-人嵌合抗体。可对这些抗体库进行筛选以得到具有期望的结合性质的抗体。 可使用ScFv噬菌体库。例如，如在Vaughan等人（1996)中所述，可基本上依循一系列的重 组人类⑶52上的重复选择循环而从scFv引导选择库分离出识别人类⑶52的ScFvs。简而 言之，在与抗体库培养之后，预先偶合至顺磁珠的固定化抗原，以及结合的噬菌体可通过磁 分离而回收，而未结合的噬菌体则被冲掉。接着可将结合的噬菌体挽回，如在Vaughan等人 (1996)中所述，并重复选择过程。
[0410] 在一个特定的实施方式中，文库构建为，由以单链形式融合至天然人类轻链可变 区集合的鼠抗CD52抗体的整个重链可变区所组成。在选择之后，鉴定出互补于小鼠重链 可变区的人类轻链可变区池（pool)。接着构建文库，该文库由以上选择的人类轻链可变区 集合所组成，该人类轻链可变区集合以单链形式融合至由天然人类CDR1和CDR2区域以及 来自鼠抗CD52抗体重链可变区的固定CDR3区域所组成的嵌合重链可变区。在选择CD52 结合物之后，选择最佳结合克隆。6个CDR区域中的五个可以是人类来源，而重链可变区的 ⑶R-3可以与小鼠重链可变区的原先⑶R3相同。
[0411] 根据制造商建议，可使用偶合至DYNABEADS M-270胺（Dynal)的⑶52进行选择。 或者，使用生物素化CD52的选择可使用一级胺特定试剂琥珀酰亚胺基-6-(生物素氨基） 己酸酯（succinimidyl_6-(biotinamido)hexanoate)依循制造商说明书（EZ link NHS LC Biotin, Pierce)而制备。
[0412] 来自选择的输出可基于竞争检定在高通量筛选中以细胞周质制备品进行测试，此 竞争检定测量存在于细胞周质制备品中的scFvs竞争结合至CD52的能力。
[0413] 可将能够在高通量筛选中竞争的样品进行DNA测序，如在Vaughan等人（1996) 及Osburn等人（1996)所叙述。克隆接着将会被表达和纯化为scFvs或IgGs，并评估其 结合CD52、中和CD52或其组合的能力，例如，使用检定如抗体依赖性细胞介导的细胞毒 性（ADCC)检定和补体依赖性细胞毒性（CDC)检定。经纯化的scFv制备品可接着如W0 01/66754的实例3中所述来制备。纯化scFv制备品的蛋白浓度使用BCA方法（Pierce)来 测定。可使用类似方法以筛选固定免疫球蛋白重链或轻链（或％或')的最佳配对者（相 对链）。
[0414] 在一个特定的实施方式中，本发明涉及一种分泌对人类CD52具有结合特异性的 单克隆抗体的杂交瘤的制造方法，其包括将⑶52转基因小鼠的淋巴细胞施用至具有与人 类CD52转基因小鼠相同的品系（例如，CD1)的非转基因小鼠，由此产生免疫型非转基因小 鼠。该免疫型非转基因小鼠的脾细胞与永生细胞接触，由此产生融合细胞，并将该融合细胞 维持在产生分泌对人类CD52具有结合特异性的单克隆抗体的杂交瘤的条件下，由此产生 分泌对人类CD52具有结合特异性的单克隆抗体的杂交瘤。
[0415] 句,含毒素部分或毒素的免，疫.球蛋白
[0416] 本发明还涉及包含毒素部分或毒素的免疫球蛋白。合适的毒素部分包含毒素（例 如，表面活性毒素，细胞毒素）。毒素部分或毒素可使用任何合适的方法连接或结合至免疫 球蛋白。例如，毒素部分或毒素可直接或经由合适的连接体（linker)共价地结合至免疫球 蛋白。合适的连接体可包含不可裂解或可裂解的连接体，例如，pH可裂解的连接体或包含 细胞酶（例如，细胞酯酶、细胞蛋白酶例如组织蛋白酶B)裂解部位的连接体。此种可裂解 连接体可用于制备在免疫球蛋白内化后能释出毒素部分或毒素的免疫球蛋白。
[0417] 可使用多种方法以将毒素部分或毒素连接或结合至免疫球蛋白。所选择的特定 方法将取决于毒素部分或毒素以及所要连接或结合的免疫球蛋白。如果需要，可使用包含 末端官能团的连接体来连接免疫球蛋白与毒素部分或毒素。一般，结合是通过将包含反应 官能团（或被修饰以包含反应官能团）的毒素部分或毒素与连接体或是直接与免疫球蛋 白反应而完成。共价键通过使包含（或被修饰以包含）化学部分或官能团（其在适当的 条件下可与第二化学基团反应由此形成共价键）反应而形成。如果需要，可使用任何合适 的方法将适当的反应化学基团加至免疫球蛋白或至连接体。（参见，例如，Hermanson，G. T.，Bioconjugate Techniques，Academic Press:San Diego，CA(1996)·)。许多合适的 反应化学基团组合为本领域内所已知，例如胺基可与亲电子基团例如甲苯磺酸酯、甲磺 酸酯、卤素（氯、溴、氟、碘）、N-羟基琥珀酰亚胺酯（NHS)、及其类似物反应。硫醇可与 马来酰亚胺、碘乙酰（iodoacetyl)、丙烯酰、吡啶基二硫化物、5-硫代-2-硝基苯甲酸硫 醇（5-thiol-2_nitrobenzoic acid thio)(TNB_硫醇）、及其类似物反应。醒官能团可 偶合至含胺或含酰肼分子，且叠氮基可与三价磷基团反应以形成氨基磷酸酯或磷酰亚胺 连接。向分子中引入活化基团的合适方法为本领域内所已知（参见例如，Hermanson，G. T. , Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996))〇
[0418] 合适毒素部分和毒素包括，例如，类美坦素（maytansinoid)(例如，美登素 醇（maytansinol),例如，DM1，DM4)、紫杉烧、加利车霉素（calicheamicin)、倍癌霉素 (duocarmycin)、或其衍生物。类美坦素可以为，例如，美登素醇或美登素醇类似物。美登 素醇类似物的实例包含具有经修饰的芳香环（例如，C-19-去氯基（decl 〇r〇)、C-20-去 甲氧基、C-20-酰氧基）的那些和在其它位置具有修饰（例如，C-9-CH、C-14-烷氧基甲 基、C-14-羟甲基或乙酰氧基甲基、C-15-羟基/酰氧基、C-15-甲氧基、C-18-N-去甲基、 4, 5-脱氧基）的那些。美登素醇和美登素醇类似物叙述于，例如，美国专利第5, 208, 020 号和第6, 333, 410号中，其内容并入本文做为参考。美登素醇可使用，例如，N-琥珀酰亚 胺基3-(2-吡啶二硫基）丙酸酯（也已知为N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶二硫基）戊酸酯 (或SPP))、4_琥珀酰亚胺基-氧代羰基-a- (2-吡啶二硫基）-甲苯（SMPT)、N-琥珀酰亚胺 基-3-(2-批陡二硫基）丁酸酯（50?13)、2亚氨基硫烧（2;[111；[1101:11；[013116)、或5-乙酰基丁二 酸酐而偶合至抗体或抗体片段。紫杉烧可以是，例如，紫杉醇、泰索帝（taxotere)、或新颖紫 杉烷（参见，例如，W0 01/38318)。加利车霉素可以是，例如，一种溴-复合加利车霉素（例 如，α、β、或Y溴-复合）、一种碘-复合加利车霉素（例如，α、β、或 Y碘-复合），或 是其类似物和模拟物。溴-复合加利车霉素包含I1-BR、I2-BR、I3-BR、I4-BR、J1-BR、J2-BR 和K1-BR。碘-复合加利车霉素包含11-1、12-1、13-1、Jl-I、J2-I、Ll-Ι和K1-BR。加利 车霉素及其变体、类似物、模拟物在，例如美国专利第4, 970, 198 ;5, 264, 586 ;5, 550, 246 ; 5, 712, 374、和5, 714, 586号中描述，其各自内容均并入本文做为参考。倍癌霉素类似物 (例如，KW-2189、DC88、DC89CBI-TMI、及其衍生物）在，例如美国专利第5,070,092号、美 国专利第5, 187, 186号、美国专利第5, 641，780号、美国专利第5, 641，780号、美国专利第 4, 923, 990号、和美国专利第5, 101，038号中描述，其各自内容均并入本文做为参考。
[0419] 其它毒素的实例包含，但不限于抗代谢物（例如，甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫 鸟噪呤、阿糖胞苷、5-氟尿啼陡氮烯咪胺（5-fluorouracil decarbazine))，烧化剂（例 如，二氯甲基二乙胺（mechlorethamine)、thioepa苯丁酸氮芥、CC_1065(参见美国专利 第5,475,092、5,585,499、5,846,545号）、美法仑、卡莫司汀出5顯）及洛莫司汀（〇：顯）、 环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲佐菌素、丝裂霉素 C、和顺式-二氯二氨钼（II) (DDP) 顺钼）、蒽环类（例如，柔红霉素（先前为道诺霉素）和阿霉素），抗生素（例如，更生霉 素（先前为放线菌素）、博莱霉素、光神霉素、丝裂霉素、嘌呤霉素氨茴霉素 （puromycin anthramycin) (AMC))、倍癌霉素及其类似物或衍生物，和抗有丝分裂剂（例如，长春新碱 (vincristine)、长春喊（vinblastine)、紫杉醇、auristatins (例如，auristatin E)和类 美坦素，及其类似物或同系物）。
[0420] 毒素也可以是表面活性毒素，例如是自由基产生者（例如，含硒毒素部分）的毒 素，或是含放射性核素部分的毒素。合适的含放射性核素部分包括，例如包含放射性碘 (1311 或 1251)、钇（90Y)、镥（177Lu)、锕（225Ac)、镨、砹（211At)、铼（186Re)、铋（212Bi 或 213Bi)、铟（1111η)、锝（99mTc)、磷（32P)、铑（188Rh)、硫（35S)、碳（14C)、氚（3H)、铬 (51Cr)、氯（36C1)、钴（57Co 或 58Co)、铁（59Fe)、硒（75Se)、或镓（67Ga)的部分。
[0421] 毒素可以是来自细菌来源的蛋白、多肽或肽，例如，白喉毒素、假单胞菌外毒素 (PE)和植物蛋白，例如，蓖麻毒素 A链（RTA)、核糖体失活蛋白（RIPs)白树毒素（gelonin)、 商陆抗病毒蛋白、肥阜草素（saporin)、和dodecandron，考虑用作毒素。
[0422] 设计以结合、使失去作用、促进负责产生特定的靶蛋白的mRNA的降解或是防止 其生成的核酸反义化合物也可用作毒素。反义化合物包含单或双链的反义RNA或DNA、 寡核苷酸、或是其类似物，其可特定地杂交至单独的mRNA种类，并防止该mRNA种类的转 录和/或RNA加工和/或编码的多肽的翻译，由此造成各编码多肽的量减少。Ching， 等人，Proc.Natl. Acad. Sci.U.S. A. 86:10006-10010(1989) ;Broder,等人，Ann.Int. Med. 113:604-618(1990) ;Loreau,等人.，FEBS Letters274:53-56(1990)。有用的反义疗 法包括例如：Veglin TM(VasGene)和 OGX-Oll(Oncogenix)。
[0423] 毒素也可以是一种光活性剂。合适的光活性剂包括卟啉类物质，例如卟吩姆 钠、绿卩卜啉、二氢卩卜酚E6、血卩卜啉衍生物本身、酞菁、初卩卜啉（etiopurpurins)、替沙林 (texaphrin)、及其类似物。
[0424] 毒素可以是一种结合细胞内目标的抗体或抗体片段。此种抗体或抗体片段可指向 指定的亚细胞区室或目标。例如，抗体或抗体片段可结合一种细胞内目标，其选自erbB2、 EGFR、BCR-ABL、p21Ras、半胱天冬氨酸酶3、半胱天冬氨酸酶7、Bcl-2、p53、细胞周期蛋白 E、ATF-l/CREB、HPV16E7、HP1、IV型胶原酶、组织蛋白酶L以及其它叙述于Kontermann，R. E·，Methods, 34:163-170 (2004)中（其全文内容并入本文做为参考）的细胞内目标。
[0425] 治疗方法和纟目合物
[0426] 本发明的抗体有用于免疫抑制和免疫消融。抗体靶向CD52表达细胞（例如，T和 B细胞）并减少（或如本文所用的"消减"）需要的受试者中它们的数量。淋巴细胞消减 可用于治疗多种疾病和症状，例如发炎、自体免疫疾病和癌症（例如，淋巴细胞（B或T细 胞）恶性肿瘤）。参见，例如，Reiff，A·，Hematology, 10 (2) :79-93 (2005)。可使用本发明 的抗体或抗原结合部分治疗的疾病和症状的实例包括但不限于，多发性硬化症、狼疮、类风 湿性关节炎、移植体抗宿主疾病（GVHD)、炎性肠道疾病、血管炎、贝西氏病、韦格纳肉芽肿病 (Wegener，s granulomatosis)、修格兰氏症候群（Sjogren，s syndrome)、葡萄膜炎、干癣、 硬皮病、多肌炎、I型（自体免疫类）糖尿病、自体免疫细胞减少症（例如，自体免疫嗜中性 粒细胞减少症、输血依赖性难治型PRCA、白血病和淋巴瘤例如具有巨大肿瘤的非何杰金氏 淋巴瘤和B细胞慢性淋巴细胞白血病。
[0427] 据此，本发明的方面为通过对需要的受试者（例如，具有自体免疫疾病、血癌的病 人，或是将要接受移植的病人）施用有效量的本发明的抗体，用于淋巴细胞消减的方法和 用于治疗发炎、自体免疫疾病或癌症的方法。还可预防性地施用该抗体以防止发炎开始或 是自体免疫疾病或癌症的复发。例如，可施用本发明的抗体作为调理疗法的一部分，以使病 人准备进行移植（例如，干细胞移植、同种异体T细胞自体移植输注、或实体器官移植）。
[0428] 本发明的一些抗⑶52抗体优选靶向某些⑶52+细胞群。一个可能的解释是，这些 抗体所结合的表位包含CD52蛋白上的一个或多个碳水化合物基团，并且此种碳水化合物 基团在一种细胞类型所表达的⑶52上比在另一种类型所表达的⑶52上更为普遍。例如，我 们已经发现，相对于B细胞，抗体7?11、5?7、367、和11(：11以更大的程度消减1'细胞。因此， 这些抗体的人源化和嵌合形式可用于治疗T细胞恶性肿瘤，且免疫抑制副作用比较温和。
[0429] 因为本发明的抗体靶向⑶52表达细胞，抗体也可用于消减T细胞和B细胞以外 的⑶52+细胞类型。例如，研究已显示，血管白细胞（VLC)和Tie2+单核细胞-表达高水平 ⑶52的髓样细胞-促进肿瘤血管新生并且有助于针对抗VEGF疗法的肿瘤抗性。Pulaski 等人，J. Translational Med. 7:49(2009)。本发明的抗⑶52抗体由此可通过革巴向VLC和 Tie2+单核细胞而用于抑制肿瘤血管新生。为此目的，抗⑶52抗体可系统地或局部地在新 血管形成部位，例如肿瘤部位给药。抗CD52抗体治疗可与标准癌症治疗例如化疗、手术、或 放射共同使用，或与另一种靶向治疗例如抗VEGF抗体治疗共同使用。抗CD52抗体治疗可用 于治疗，例如，乳腺癌、肺癌、神经胶质瘤、结肠直肠癌、和任何其它抗VEGF抗体的症状。抗 CD52抗体治疗也可用于其它新血管形成病症，包括非肿瘤血管新生症状。
[0430] 本发明的抗体可单独施用至个体（例如，人类）或与另一种制剂（例如，免疫抑 制剂）在联合治疗中共同施用。该抗体可在施用额外的制剂之前，一起或之后施用。在一 些实施方式中，额外的制剂为，例如，消炎化合物例如柳氮磺批陡（sulfasalazine)，另一 种非类固醇消炎化合物，或类固醇消炎化合物。在一些实施方式中，该额外制剂为另一种 淋巴消减抗体，例如另一种抗CD52抗体、抗CD20抗体、抗BAFF抗体、抗BAFF-R抗体、和 类似物。在一些实施方式中，该额外制剂为，例如，细胞因子（例如，IL-7)、抗细胞因子受 体抗体，或可溶性受体，其扭转、操作、和/或加强在抗CD52抗体所介导的淋巴细胞消减 之后发生的重建过程（参见，例如，Sportes等人，0}^〇1^116 1116四口丨68:41111.11￥.4〇&(1· Sci. 1182:28-38 (2009))。在另一实施方式中，合成肽模拟物可与本发明的免疫球蛋白共同 给药。
[0431] 研究已显示，阿仑单抗引起的淋巴细胞消减由嗜中性粒细胞和NK细胞所介导（Hu 等人，Immunologyl28:260-270(2009)。因此，在联合治疗的实施方式中，可在抗⑶52抗体 疗法之前、期间或之后对病人施用刺激嗜中性粒细胞和NK细胞的制剂，以增强抗体治疗。 刺激嗜中性粒细胞和/或NK细胞包括，但不限于，⑴增加其分裂速率，⑵增加对应于抗 CD52 抗体的同种型的 Fc 受体（例如，Fc YRIIIa和 Fc YRIIIb、Fc yRII、Fc YRI、和 Fca RI) 的细胞表面表达，（3)调动并增加循环细胞的数量，（4)募集细胞至靶部位（例如，肿瘤、 发炎、或组织损伤部位），（5)以及增加其细胞毒性活性。刺激嗜中性粒细胞和/或NK细 胞的制剂的实例包括，例如，粒细胞单核细胞集落刺激因子（gm-csf)(例如，LEUKINE? 或沙格司亭（sargramostim)和莫拉司亭（molgramostim));粒细胞集落刺激因子（G-CSF) (例如，NEUPOGEN?或非格司亭（filgrastim)、聚乙二醇化非格司亭、和来格司亭 (lenograstim));干扰素 -γ (例如，ACTIMMUNE? ) ;CXC 趋化因子受体 4(CXCR4)拮 抗剂（例如，M0Z0BIL?或普乐沙福（plerixafor));和CXC趋化因子受体2(CXCR2)拮抗剂。 可定期监测病人的嗜中性粒细胞数以确保最佳的治疗效果。也可在抗CD52抗体治疗开始 之前测量病人的嗜中性粒细胞数。可基于病人的嗜中性粒细胞数调整刺激物的量。如果病 人的嗜中性粒细胞数较正常者较低，则可使用较高剂量的刺激物。在嗜中性粒细胞减少症 (其可由使用抗CD52抗体治疗而引起）期间，也可使用较高剂量的嗜中性粒细胞刺激物以 最大化抗CD52抗体的效果。
[0432] 因为嗜中性粒细胞和/或NK刺激改善抗CD52抗体治疗的效力，联合治疗的此实 施方式使得我们可对病人使用较少的抗体并维持相似的治疗效果。使用较少的抗CD52抗 体同时维持治疗效果可帮助减少抗CD52抗体的副作用，其包括病人对施用的抗体的免疫 反应以及二次自体免疫（在抗CD52抗体治疗期间或之后出现的自体免疫）的发展。联合 治疗的此实施方式也可用于肿瘤环境，例如，在病人具有嗜中性粒细胞减少症时。
[0433] 在联合治疗的另一实施方式中，我们可使用调节T细胞的刺激物来增强抗CD52 抗体治疗。我们的数据显示，相较于其它CD4+T细胞，抗CD52抗体以更低的程度消减 ⑶4+CD25 +F〇XP3+调节T细胞。调节T细胞（也已知为"Treg"或抑制T细胞）是一种能够通过 接触依赖性或接触非依赖性（例如，细胞因子产生）机制抑制其它淋巴细胞的增殖和/或功 能的细胞。已叙述数种类型的调节T细胞，包括γ δΤ细胞、自然杀手T(NKT)细胞、⑶8+T细 胞、CD4+T细胞、和双阴性CD4XD8飞细胞。参见，例如，Bach等人，Immuno 1.3:189-98(2003)。 ⑶4+CD25+FoxP3+调节T细胞曾称为"自然发生"调节T细胞；它们表达⑶4、⑶25和叉头 (Forkhead)家族转录因子FoxP3(叉头盒p3)。因此，在联合治疗的此实施方式中，我们 可在抗⑶52抗体治疗之前、期间或之后施用刺激⑶4+⑶25+F 〇XP3+调节T细胞的制剂，以 在淋巴细胞消减之后扭转免疫系统的组成。制剂可，例如，活化那些T细胞，稳定和/或 扩充细胞群，移动和增加细胞循环，和/或募集细胞至靶部位。此种制剂的实例为雷帕 霉素、活性或潜伏性 TGF- β (例如，TGF- β 1、TGF- β 2、TGF- β 3、TGF- β 4、和 TGF- β 5)、 IL-10、IL-4、IFN-α、维生素 D3、地塞米松（dexamethasone)、和霉酌·酸酯（mycophenolate mofetil)(参见，例如，Barrat 等人，J. Exp. Med. 195:603-616 (2002) ;Gregori 等人，J Immunol. 167:1945-1953(2001) ;Battaglia 等人，Bloodl05:4743-4748 (2005) ;Battaglia 等人，J. Immunol. 177:8338-8347 (2006))。
[0434] 在本发明中，治疗疾病的抗CD52抗体的有效量为帮助治疗的受试者达到一个 或多个期望临床终点的量。例如，对于狼疮（其表现包括系统性红斑狼疮、狼疮性肾炎、 皮肤红斑狼疮、CNS狼疮、心血管表现、肺表现、肝表现、血液表现、胃肠表现、肌肉骨骼表 现、新生儿红斑狼疮、儿童全身性红斑狼疮、药物诱发性红斑狼疮、抗磷脂症候群、和引 起狼疮症状的补体缺乏症候群；参见，例如，Robert G.Lahita, Editor, Systemic Lupus Erythematosus, 4th Ed.，Elsevier Academic Press, 2004)，临床终点可通过监测受影响 的器官系统（例如，狼疮性肾炎的血尿及/或蛋白尿）和/或使用提供数个器官系统间的 疾病严重性的综合分数的疾病活动指数（例如，BILAG、SLAM、SLEDAI、ECLAM)来测定。参 见，例如，Mandl 等人，"Monitoring patients with systemic lupus erythematosus" in Systemic Lupus Erythematosus, 4th edition, pp. 619-631, R. G. Lahita, Editor, Elsevier Academic Press, (2004)。
[0435] 在自体免疫疾病、多发性硬化症（其包含复发缓解型、二次进展型、原发进展型、 和进展复发型多发性硬化症（(Lublin等人，Neurology46(4), 907-11 (1996))的另一实 施例中，诊断是通过，例如在检测例如核磁共振成像（MRI)、脊髓穿刺、诱发电位检测、和 血液样品实验室分析的协助下通过征状史和神经检查而作出的。在MS中，治疗目标是降 低复发的频率和严重性、预防因疾病进展而产生的障碍、和促进组织修复（Compston and Coles，2008)。因此，帮助达到与该目标一致的临床终点的抗⑶52抗体量是用于治疗的抗 体的有效量。
[0436] 为了使免疫原性降至最低，优选通过本发明的治疗方法和组合物使用人源化抗体 来治疗患者。在不需要重复给药的情况下，对患者施用本发明的鼠：人类嵌合抗体也是合适 的。
[0437] 可使用本发明的抗体来治疗先前已经用Campath-1H?治疗并且已经形成 Campath-1H?的中和抗体的个体（例如，Campath-1Η⑩-难治疗的个体）。例如，人 们可以治疗患有自体免疫疾病（例如，多发性硬化症、狼疮、血管炎）和/或癌症（例如， 白血病（例如，慢性淋巴细胞白血病）、淋巴癌（例如，非何杰金氏淋巴瘤））、先前已用 Campath-1Η?治疗（例如，使用一个或多个Campath-1Η?治疗疗程）和已经形成 Campath-IH?中和抗体的个体，其中中和抗体会降低进一步的Campath-ΙΗ?治疗效 力。我们已经显示，本发明的人源化抗体（例如，人源化2C3U2G6和9D9)尽管在阿仑单抗 的中和抗体的存在下也可结合至人类CD52。在另一个实施方式中，人们可以用本文所述的 特定的人源化抗体与一种本文所述的其它人源化抗体来治疗已经变得难以治疗的个体。
[0438] 本发明的抗体可以以单一的单位剂量或多剂量在健康照顾提供者认为合适的任 何时间点给药。剂量可通过本领域内已知的方法所决定，并可依据，例如个体年龄、敏感性、 耐受度和整体健康情况而定。可使用各种给药路径，其包括，但不限于，肠胃外（例如，静 脉内、动脉内、肌肉内、鞘内、腹膜内、皮下注射）、口服（例如，饮食）、局部（locally)、表面 (topical)、吸入（例如，支气管内、鼻内或口部吸入、鼻内滴剂）、或直肠，依据要治疗的疾 病或病症而定。肠胃外给药可以是一种优选的给药模式。
[0439] 在一个实施方式中，使用与Campath-丨H?相同的给药方案对患者施用本发明的 抗体（例如，针对慢性淋巴细胞白血病的Campath-ΙΗ?给药方案）。在另一个实施方式 中，以一种方案对患有自体免疫疾病（例如，多发性硬化症（MS))的患者施用本发明的抗 体，其中该方案包括第一周期的抗体给药，接着至少再一个抗体周期，其中各个治疗周期包 括连续数天应用1-5个剂量，并且其中各个治疗周期与下一个周期分隔至少1-24个月（例 如，12个月）。例如，在一个实施方式中，通过包括5个每日剂量抗体的第一周期抗体接着 至少再一抗体治疗周期（其中该治疗在第一周期之后12个月发生，并且治疗包括连续数天 施用的3个剂量的抗体）来治疗患有多发性硬化症的患者。在另一个实施方式中，患有MS 的病人仅再治疗一次，已经观察到重新开始的（renewed)MS活动性的迹象（参见，例如TO 2008/031626,其教导整体地并入本文以作参考）。在一些实施方式中，如果患有更晚期形式 的MS或更恶化形式的其它自体免疫疾病（例如血管炎；参见，例如，Walsh等人，Ann Rheum Dis671322-1327(2008))的患者早在他们最后的疗程之后经历复发，可能需要进行更频繁 的治疗疗程（例如，每四个月、每六个月）。可根据治疗临床医生的职业判断，使用这样的 临床医生可获得的任何方法确定重新开始的MS活动性的迹象。对于临床医生，目前有多种 技术来诊断重新开始的MS活动性，包括但不限于，通过临床方法（神经性障碍的复发或恶 化）或通过大脑或脊髓的核磁共振成像（MRI)。如医学从业者所公知，通过MRI检测的疾病 活动性可通过T1 (加强或非加强的）或T2加权成像上新的脑或脊椎病变的出现，或通过这 样的病变的体积增长而显示出。因为MS的诊断方法在不断发展，预期未来可能有另外的方 法将检测到重新开始的MS活动性（例如，磁化传递率或MR-光谱）。用于检测重新开始的 MS活动性的特定诊断方法不是对主张权利的本发明的限制。在某些实施方式中，为了确定 任何给定患者是否需要再治疗和对该患者再治疗的最佳时间点，在治疗周期之后以固定的 间隔重复进行MRIs。通常而言，在疾病临床地再次显现之前进行再治疗是有利的。
[0440] 制剂可依据所选择的给药途径而不同（例如，溶液、乳液）。包含将施用的抗 体的适当组合物可以生理上可接受的媒介物或载体而制备。组合物可包括多剂量或 者可以是单一单位剂量的组合物。对于溶液或乳液，合适的载体包括，例如，水溶液或 醇/水溶液、乳液或悬浮液，包含盐水或缓冲介质。肠胃外媒介物可包括氯化钠溶液、林 格氏葡萄糖（Ringer's dextrose)、葡萄糖与氯化钠、乳酸林格氏或不挥发性油（fixed oil)。静脉内媒介物可包括各种添加剂、防腐剂、或流体、营养或电解质补充剂（参见， 通常而言，Remington ,s Pharmaceutical Sciences, 17th Edition, Mack Publishing Co.，PA，1985)。对于吸入，化合物可以是溶解的或是装载至合适的给药用分配器（例如，雾 化器（atomizer)、气雾器（nebulizer)或压力气雾剂分配器）。
[0441] 诊断方法和纟目合物
[0442] 本发明的免疫球蛋白也可用于研究和诊断应用的多种方法。例如，它们可用于检 测、分离、和/或纯化人类CD52或其变体（例如，通过悬浮液中亲合纯化或其它合适方法例 如流式细胞术，例如，用于细胞，例如淋巴细胞），和研究人类CD52结构（例如，构象）和功 能。对于体外应用，其中抗体的免疫原性不是考虑的重点，除了人源化抗体，本发明的鼠抗 体和嵌合抗体将是有用的。
[0443] 本发明的免疫球蛋白可用于诊断应用（例如，体外、先体外后体内）。例如，可使用 本发明的人源化免疫球蛋白来检测和/或测量样品中（例如，在组织或体液（比如带有人 类⑶52的发炎渗出物、血液、血清、肠液、组织）中表达人类⑶52的细胞上）人类⑶52的 水平。样品（例如，组织和/或体液）可从个体获得，且本文所述的免疫球蛋白可以以合适 的免疫学方法使用以检测和/或测量人类CD52表达，包括方法比如流式细胞术（例如，用 于悬浮液中的细胞，例如淋巴细胞），酶联免疫吸附检定（ELISA)，包括化学发光检定、放射 免疫检定、和免疫组织学方法。
[0444] 在一个实施方式中，提供一种检测样品中人类⑶52的方法，其包含在适合免疫球 蛋白对人类CD52特异性结合的条件下将样品与本发明的免疫球蛋白接触并检测所形成的 抗体-CD52复合物。在应用该方法时，本文所述的免疫球蛋白可用于分析正常组织相对于 发炎组织（例如，来自人类）的人类CD52反应性和/或表达（例如，免疫组织学地），以检 测例如，炎性肠道疾病（IBD)、自体免疫疾病（例如多发性硬化症和狼疮）、癌症（例如非何 杰金氏淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病）、或其它症状与增加的人类CD52表达（例如，在受感 染的组织中）之间的关联。因此，本发明的免疫球蛋白允许在正常组织和发炎组织中进行 评估人类CD52的存在的免疫方法，通过该方法可评估疾病存在、疾病进程和/或抗人CD52 治疗在疾病（例如，发炎性疾病）治疗中的效用。
[0445] 此外，在通过消减性抗CD52治疗抗体的治疗之后，可使用免疫球蛋白来检查组 织，以估计该消减多有效以及以确定⑶52表达是否有任何的下调（Rawstrom等人.，Br. Heam.，107:148-153(1999))。
[0446] 除非另外定义，本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域内的普 通技术人员所普遍理解的意义相同的意义。示例方法和物质在下文中叙述，尽管与本文所 述的方法和物质相似或等同的方法和物质也可用于本发明的实践或测试中。本文所提及的 所有出版物和其它参考文献整体地并入本文做为参考。在冲突情况下，本说明书包括定义 为优先。虽然本文引用数个文件，此引用并不构成以下认可：任何这些文件构成为本领域内 公知常识的一部分。本说明书和权利要求通篇中，词语"包含（comprise)"或变形例如"包 含（comprises、comprising) "将被理解为包含所述整体或整体组但不排除任何其它整体或 整体组。材料、方法、和实施例仅仅是说明性的而不意在限制。
[0447] 示例
[0448] 实施例1 :鼠抗人⑶52抗体的产生
[0449] 下列工作实施例中的鼠抗人⑶52抗体通过使用来自⑶1背景的人类⑶52转基因 小鼠的脾细胞免疫CD1株小鼠而产生（图1A)，其中转基因小鼠的鼠 B细胞和T细胞表面 上的人类CD52呈现通过流式细胞术而证实。因为转基因小鼠具有与免疫小鼠相同的背景 (CD1)，来自转基因小鼠的脾细胞在细胞表面上以天然形式呈现人类CD52为独特的、非己 抗原，免疫的非转基因小鼠初始朝人类CD52发起抗体反应。
[0450] 为收集人类CD52转基因小鼠的脾细胞，将小鼠安乐死，取出脾脏并经由通过注射 器而制备单细胞悬浮液。接着通过腹膜内（i.P.)注射用收集的人类CD52阳性脾细胞以每 只小鼠100 μ 1中5xl06个与或者不与弗氏完全佐剂（Freund's Complete Adjuvant) -起 对CD1小鼠免疫。在使用弗氏不完全佐剂，腹膜内注射，用转基因小鼠人类CD52阳性脾细 胞以每只鼠1〇〇μ 1中5xl06个第一次免疫之后，每两周对小鼠给予两次加强剂量（booster dose)。
[0451] 对于所有小鼠，在免疫之前对每只小鼠收集眼出血100-200微升于黄色盖血清分 离管中，以确定基础水平反应性，在每轮免疫之后一周收集以确定基础水平反应性，并在每 轮免疫之后一周收集以确定抗人⑶52特异性免疫反应。将对CH0 K1细胞（被改造以表达 人类⑶52蛋白），而不对亲代CH0 K1细胞表现出高水平的抗人⑶52反应性（通过FACS检 测）的小鼠处死，在无菌条件下收集血液并收集脾脏以产生杂交瘤。通过在免疫之后3-4 天使用非分泌性小鼠骨髓瘤细胞-系SP2/0Agl4或NS1骨髓瘤细胞作为融合伴侣（fusion partner)而产生杂交瘤。将融合细胞放置于包含次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷的完全生长培 养基中以产生杂交瘤。对许多杂交瘤上清液筛选后，选择数个产生特异性抗人CD52抗体的 克隆，并对其进一步亚克隆以得到克隆群体。按比例增加产生抗人CD52抗体的杂交瘤克隆 以进行进一步发展。
[0452] 实施例2 :鼠抗人⑶52抗体的重链和轻链的PCR分析
[0453] 通过测试杂交瘤上清液其抗人⑶52反应性的存在而鉴定数个鼠抗人⑶52单克 隆抗体（图1B)。选择单独的克隆并通过PCR克隆和测序来鉴定小鼠的重链可变序列和 轻链可变序列。与ΥΤΗ：Μ· 5HL (即，Campath IG κ (大鼠）和试剂抗体CF1D12 (CF1D12 κ ) (Invitrogen Life Science Technologies)相比较的轻链序列不于图2中。类似地，与 YTH34. 5HL和试剂抗体CF1D12相比较的重链序列示于图3中。
[0454] 鉴定出总共10个独特的轻链可变序列和11个独特的重链可变序列。如果包括 CampathK和CF1D12,则在抗人⑶52抗体的轻链内，鉴定出7个独特的⑶R-1区（表1)， 8个独特的CDR-2区（表2)和7个独特的CDR-3区（表3)。
[0455] 表1 :轻链CDR-1序列
[0456]

【权利要求】
1. 一种单克隆抗人CD52抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体的轻链和重链包括在 以下中找到的三个互补决定区（CDRs): a) 分别在SEQ ID NOs :9和22中； b) 分别在SEQ ID NOs :4和17中； c) 分别在SEQ ID NOs :5和18中； d) 分别在SEQ ID NOs :6和19中； e) 分别在SEQ ID NOs :7和20中； f) 分别在SEQ ID NOs :8和21中； g) 分别在SEQ ID NOs :3和16中； h) 分别在 SEQ ID NOs : 10 和 23 中； i) 分别在 SEQ ID NOs : 11 和 24 中； j) 分别在 SEQ ID NOs : 12 和 25 中； k) 分别在SEQ ID NOs : 12和137中；或 l) 分别在 SEQ ID NOs : 13 和 26 中。
2. -种单克隆抗人CD52抗体，或其抗原结合部分，其结合至与权利要求1所述的单克 隆抗体或抗原结合部分所结合的人类CD52上的表位相同的表位。
3. -种单克隆抗人CD52抗体，或其抗原结合部分，其与权利要求1所述的单克隆抗体 或抗原结合部分竞争或交叉竞争。
4. 如权利要求1、2、或3所述的单克隆抗体或抗原结合部分，其中所述抗体是人源化抗 体、鼠抗体、或嵌合抗体。
5. 如权利要求1所述的单克隆抗体或抗原结合部分，其中所述重链的骨架区利用 VH3-72或VH3-23人类生殖系序列，并且其中所述轻链的骨架区利用VK2A18b人类生殖系 序列。
6. 如权利要求1所述的单克隆抗体或抗原结合部分，其中所述抗体包括重链 (H)-CDR1、H-CDR2、H-CDR3,和轻链（L)-CDR1、L-CDR2、和 L-CDR3,其氨基酸序列为： a) 分别为 SEQ ID NOs :53、63、71、31、36、和44; b) 分别为 SEQ ID NOs :50、60、69、29、37、和43; c) 分别为 SEQ ID NOs :50、61、68、29、38、和43; d) 分别为 SEQ ID NOs :50、61、69、29、36、和43; e) 分别为 SEQ ID NOs :50、62、69、29、39、和43; f) 分别为 SEQ ID NOs :52、61、70、30、40、和43; g) 分别为 SEQ ID NOs :51、59、69、29、36、和43; h) 分别为 SEQ ID NOs :54、64、71、31、36、和45; i) 分别为 SEQ ID NOs :55、63、72、31、36、和46; j) 分别为 SEQ ID NOs :56、65、73、32、41、和47; k) 分别为 SEQ ID NOs :56、65、294、32、41、和47;或 l) 分别为 SEQ ID N0s:56、66、74、33、41、和 48。
7. 如权利要求1所述的单克隆抗体或抗原结合部分，其中所述抗体的轻链和重链： a)分别包括SEQ ID NOs :9和22的氨基酸序列； b) 分别包括SEQ ID NOs :4和17的氨基酸序列； c) 分别包括SEQ ID NOs :5和18的氨基酸序列； d) 分别包括SEQ ID NOs :6和19的氨基酸序列； e) 分别包括SEQ ID NOs :7和20的氨基酸序列； f) 分别包括SEQ ID NOs :8和21的氨基酸序列； g) 分别包括SEQ ID NOs :3和16的氨基酸序列； h) 分别包括SEQ ID NOs : 10和23的氨基酸序列； i) 分别包括SEQ ID NOs : 11和24的氨基酸序列； j) 分别包括SEQ ID NOs : 12和25的氨基酸序列；或 k) 分别包括SEQ ID NOs : 13和26的氨基酸序列。
8. 如权利要求1所述的单克隆抗体或抗原结合部分，其中所述重链和所述轻链： a) 分别包括SEQ ID NOs : 158和165的氨基酸序列； b) 分别包括SEQ ID NOs : 136和138的氨基酸序列； c) 分别包括SEQ ID NOs : 137和138的氨基酸序列； d) 分别包括SEQ ID NOs : 139和147的氨基酸序列； e) 分别包括SEQ ID NOs : 149和155的氨基酸序列； f) 分别包括SEQ ID NOs : 149和156的氨基酸序列； g) 分别包括SEQ ID NOs : 103和102的氨基酸序列； h) 分别包括SEQ ID NOs : 158和166的氨基酸序列； i) 分别包括SEQ ID NOs : 159和165的氨基酸序列； j) 分别包括SEQ ID NOs : 159和166的氨基酸序列； k) 分别包括SEQ ID NOs : 161和166的氨基酸序列；或 l) 分别包括SEQ ID NOs : 163和166的氨基酸序列。
9. 一种单克隆抗人CD52抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体的重链和轻链分别包 括SEQ ID NOs :272和273的氨基酸序列，且无信号序列。
10. -种单克隆抗人CD52抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体的重链和轻链分别包 括SEQ ID NOs :274和275的氨基酸序列，且无信号序列。
11. 一种单克隆抗人CD52抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体的重链和轻链分别包 括SEQ ID NOs :276和278的氨基酸序列，且无信号序列。
12. -种单克隆抗人CD52抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体的重链和轻链分别包 括SEQ ID NOs :277和278的氨基酸序列，且无信号序列。
13. -种单克隆抗人CD52抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体的重链和轻链分别包 括SEQ ID NOs :279和280的氨基酸序列，且无信号序列。
14. 一种单克隆抗人CD52抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体的重链和轻链分别包 括SEQ ID NOs :281和282的氨基酸序列，且无信号序列。
15. -种单克隆抗人CD52抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体的轻链包括选自SEQ ID NOs : 102、138、145-148、153-157、和 164-168 的氨基酸序列。
16. -种单克隆抗人CD52抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体的轻链包括选自SEQ ID NOs : 273、275、278、280、和282的氨基酸序列，且无信号序列。
17. -种抗体轻链或其部分，包括选自SEQ ID N0s:102、138、145-148、153-157、 164-168、273、275、278、280、和282的氨基酸序列，且无信号序列若其存在。
18. -种单克隆抗人CD52抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体的重链包括选自SEQ ID NOs :103、136、137、139-144、149-152、和 158-163 的氨基酸序列。
19. 一种单克隆抗人CD52抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体的重链包括选自SEQ ID NOs :272、274、276、277、279、和281的氨基酸序列，且无信号序列。
20. -种抗体重链或其部分，包括选自 SEQ ID N0s:103、136、137、139-144、149-152、 158-163、272、274、276、277、279、和281的氨基酸序列，且无信号序列若其存在。
21. 如权利要求1-8、15、16、和18中任一项所述的单克隆抗体，其中所述抗体是IgGl、 IgG2、IgG3、或 IgG4 分子。
22. 如权利要求1-16、18和19中任一项所述的抗原结合部分，其中所述抗原结合部分 是单链抗体、Fv、Fab、Fab'、F (ab'）2、Fd、单链Fv分子（scFv)、双特异性单链Fv二聚体、双 抗体、区域缺失抗体或单域抗体（dAb)。
23. 如权利要求1、2或3所述的单克隆抗体或抗原结合部分，其中所述抗体或抗原结 合部分结合至包括SEQ ID NO :104的氨基酸序列，并且任选地，所述抗体或抗原结合部分至 SEQ ID NO :104的结合通过在SEQ ID NO :104的残基4、7、8、和11中的一个或多个处的丙 氨酸取代而减少。
24. 如权利要求1-16、18、和19中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合部分，其中所述 抗体或抗原结合部分具有选自以下的一个或多个性质： a) 消减T或B淋巴细胞，或二者； b) 与B淋巴细胞相比，优先地消减T淋巴细胞； c) 增加 TNF-α、IL-6、或MCP-1的循环血清水平； d) 介导CD52表达细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC); e) 介导CD52表达细胞的补体依赖性细胞毒性（CDC); f) 在阿仑单抗的中和抗体的存在下结合至人⑶52 ;和 g) 促进人类T或B淋巴细胞中的细胞内信号传导，或促进二者中的细胞内信号传导。
25. -种分离的核酸，其编码权利要求1-16、18、和19中任一项所述的抗体的重链或其 抗原结合部分，或所述抗体的轻链或其抗原结合部分。
26. 如权利要求25所述的分离的核酸，其中所述分离的核酸包括： a) 选自SEQ ID NOs :283、285、287、288、290、和292的重链核苷酸序列，或不具有编码 信号肽的序列的所述核苷酸序列； b) 选自SEQ ID NOs :284、286、289、291、和293的轻链核苷酸序列，或不具有编码信号 肽的序列的所述核苷酸序列；或 c) a)和b)二者的核苷酸序列。
27. 如权利要求26所述的分离的核酸，其中所述分离的核酸包括选自以下的重链核苷 酸序列和轻链核苷酸序列： a) 分别选自SEQ ID NO :290和SEQ ID NO :291，二者均不具有编码信号肽的序列； b) 分别选自SEQ ID NO :285和SEQ ID NO :286,二者均不具有编码信号肽的序列； c) 分别选自SEQ ID NO :287和SEQ ID NO :289,二者均不具有编码信号肽的序列； d) 分别选自SEQ ID NO :288和SEQ ID NO :289,二者均不具有编码信号肽的序列； e) 分别选自SEQ ID NO :283和SEQ ID NO :284,二者均不具有编码信号肽的序列；和 f) 分别选自SEQ ID N0:292和SEQ ID N0:293,二者均不具有编码信号肽的序列。
28. -种包含重链核苷酸序列的分离的核酸和一种包含轻链核苷酸序列的分离的核酸 用于制备药物中的用途，所述药物用来治疗需要治疗的病人，其中所述重链核苷酸序列和 所述轻链核苷酸序列： a) 分别选自SEQ ID NO :290和SEQ ID NO :291，二者均不具有编码信号肽的序列； b) 分别选自SEQ ID NO :285和SEQ ID NO :286,二者均不具有编码信号肽的序列； c) 分别选自SEQ ID NO :287和SEQ ID NO :289,二者均不具有编码信号肽的序列； d) 分别选自SEQ ID NO :288和SEQ ID NO :289,二者均不具有编码信号肽的序列； e) 分别选自SEQ ID NO :283和SEQ ID NO :284,二者均不具有编码信号肽的序列；和 f) 分别选自SEQ ID N0:292和SEQ ID N0:293,二者均不具有编码信号肽的序列。
29. -种重组载体，其包括（1)编码权利要求1-16、18、和19中任一项所述的单克隆抗 体的重链或其抗原结合部分的核酸序列、（2)编码权利要求1-16、18、和19中任一项所述的 单克隆抗体的轻链或其抗原结合部分的核酸序列、或（3)二者。
30. -种宿主细胞，其包括编码权利要求1-16、18、和19中任一项所述的单克隆抗体 的重链或其抗原结合部分的第一核酸序列，所述第一核酸序列可操作地连接至表达控制元 件，和编码所述单克隆抗体的轻链或其抗原结合部分的第二核酸序列，所述第二核酸序列 可操作地连接至表达控制元件。
31. -种制造抗人CD52抗体或其抗原结合部分的方法，包括将权利要求30所述的宿主 细胞维持在适合所述抗体或其抗原结合部分表达的条件下。
32. 如权利要求31所述的方法，进一步包括分离所述抗体或其抗原结合部分。
33. -种组合物，包括权利要求1 -16、18、19、和21 -24中任一项所述的单克隆抗体或抗 原结合部分，以及药学上可接受的媒介物或载体。
34. -种用于治疗需要治疗的病人的方法，包括对所述病人施用有效量的权利要求 1-16、18、19、和21-24中任一项所述的抗体或抗原结合部分、或权利要求33所述的组合物。
35. 如权利要求34所述的方法，其中所述病人正接受移植。
36. -种用于治疗需要治疗的病人中的自体免疫疾病的方法，包括对所述病人施用有 效量的权利要求1-16、18、19、和21-24中任一项所述的抗体或抗原结合部分、或权利要求 33所述的组合物。
37. 如权利要求36所述的方法，其中所述自体免疫疾病为多发性硬化症、类风湿性关 节炎、系统性红斑狼疮、或血管炎。
38. -种用于治疗需要治疗的病人中的癌症的方法，包括对所述病人施用有效量的权 利要求1-16、18、19、和21-24中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合部分、或权利要求33 所述的组合物。
39. 如权利要求38所述的方法，其中所述癌症为白血病。
40. 如权利要求38所述的方法，其中所述癌症为淋巴瘤。
41. 如权利要求38所述的方法，其中所述癌症为T细胞恶性肿瘤，并且相较于B细胞， 所述抗体或抗原结合部分优先地消减T细胞。
42. 如权利要求38所述的方法，其中所述癌症为实体肿瘤。
43. 如权利要求34、36、或38所述的方法，进一步包括对所述病人施用嗜中性粒细胞或 NK细胞刺激剂。
44. 如权利要求42所述的方法，其中所述刺激剂为G-CSF或GM-CSF。
45. 如权利要求34、36、或38所述的方法，进一步包括对所述病人施用T调节细胞刺激 剂。
46. 如权利要求45所述的方法，其中所述刺激剂为雷帕霉素。
47. -种在需要的病人中抑制血管生成的方法，包括对所述病人施用有效量的权利要 求1-16、18、19、和21-24中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合部分。
48. 如权利要求47所述的方法，其中所述病人有实体肿瘤。
49. 如权利要求47所述的方法，其中所述病人有新血管形成。
50. 如权利要求1-16、18、19、和21-24中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合部分用 于制备药物中的用途，其中所述药物用于治疗需要治疗的病人中的自体免疫疾病。
51. 如权利要求1-16、18、19、和21-24中任一项所述的抗体或抗原结合部分用于制备 药物中的用途，其中所述药物用于治疗需要治疗的病人中的癌症。
52. 如权利要求1-16、18、19、和21-24中任一项所述的抗体或抗原结合部分用于制备 药物中的用途，其中所述药物用于治疗需要移植的病人。
53. 如权利要求1-16、18、19、和21-24中任一项所述的抗体或抗原结合部分用于制备 药物中的用途，其中所述药物用于治疗需要治疗的病人中的新血管形成。
54. 如权利要求1-16、18、19、和21-24中任一项所述的抗体或抗原结合部分用作药物 的用途。
【文档编号】A61P35/02GK104231084SQ201410379748
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2010年5月13日 优先权日:2009年5月13日
【发明者】L. 罗伯茨 B., 尚卡拉 S., H. 布龙迪克 W., M. 西德尔斯 W. 申请人:基酶有限公司