本发明涉及中医药制品加工技术领域，具体涉及一种从蘘荷中提取活性组分的方法，以及该提取到的活性组分在制备抗肿瘤药物，镇痛、抗炎药物，抗菌药物中的应用。
背景技术：
蘘荷(Zingibermioga)，姜科姜属，多年生草本植物，俗称野姜、茗荷、阳藿等。其嫩芽、花轴和嫩茎味芳香微甘，可凉拌或炒食，也可制作酱菜，是营养价值很高的珍稀蔬菜。蘘荷嫩茎具有特殊气味，其挥发油中除具有特殊气味的挥发性组分外，还鉴定出许多药用成分，如烷烃醇类、酮类、醛类、环氧化合物及醚类、冰片、烯烃、脂肪酸、酯类化合物等多种化合物。随着科技的进步，关于蘘荷提取物的一种新功能也逐渐被发现和利用。如公开号为CN103432541A的中国发明专利“一种蘘荷花苞提取物的降血脂新用途”公开了从蘘荷花苞中提取有效组分用于制备降血脂药物的方法。又如公开号为CN102940864A的中国发明专利“一种蘘荷提取物的解酒新用途”公开了一种从蘘荷花苞中提取有效活性组分用于制备解救剂的方法。但到目前位置，对于襄荷提取物的研究中，还未见其抗癌、抗炎、及抗菌功效的报道。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是针对以上现有技术的不足，提供一种蘘荷活性组分的提取方法，该方法操作简单、过程可控、重复性好，提取得到的蘘荷活性组分被证明具有抗肿瘤，镇痛、抗炎，抗菌活性。本发明所采用的技术方案为：一种蘘荷活性组分的提取方法，它包括以下步骤：(1)取烘干的蘘荷根茎为原料，切成0.5-1cm小段后，加入超纯水进行浸泡12-24小时，其中超纯水的加入量为蘘荷根茎质量的8倍，然后进行煎煮，时间为1小时，煎煮完之后进行过滤；(2)取过滤所得的滤渣，加入滤渣8倍质量的超纯水，进行煎煮1小时，煎煮完之后进行过滤，重复以上步骤；(3)将步骤(1)、(2)过滤所得的滤液进行合并，浓缩干燥，得本发明目的活性组分。本发明还进一步提供上述从蘘荷提取到的活性组分在制备抗肿瘤药物中的应用。该活性组分作为有效成分按常规方法与药学上可接受的任何载体制成各类药用制剂。本发明进一步提供上述从蘘荷提取到的活性组分在制备镇痛、抗炎药物中的应用。该活性组分作为有效成分按常规方法与药学上可接受的任何载体制成各类药用制剂。本发明进一步提供上述从蘘荷提取到的活性组分在制备抗菌药物中的应用。该活性组分作为有效成分按常规方法与药学上可接受的任何载体制成各类药用制剂。与现有技术相比，本发明具有以下显著优点和有益效果：1、本发明先使用超纯水对蘘荷根茎进行浸泡，以软化蘘荷根茎坚硬的细胞壁，然后采用多次煎煮的方法提取活性组分，本操作方法简单可控，易操作，重复性好，可实施化程度高，可实现工业化生产；2、发明提取得到的活性组分原料来源于天然，副作用小或没有，可进一步开发出药效更好、不良反应更小更少的抗癌剂、镇痛抗炎剂、抗菌剂，用于相关疾病治疗，具有明显的社会效益和经济效益；3、发明拓展了药物或保健食品的原料来源，扩大了蘘荷的应用范围，使蘘荷成为抗肿瘤药物、镇痛抗炎剂、抗菌剂的有效组分原料，显著提高了蘘荷的附加值。具体实施方式以下结合实施例对本发明作进一步具体描述。应该指出，以下具体说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有说明，本发明使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。实施例1：蘘荷活性组分的提取1、原料、材料：蘘荷根茎采自浙江湖州莫干山。2、试剂：超纯水由密立博纯水仪生产。3、仪器设备：旋转蒸发仪购自上海亚容生化仪器厂。4、提取方法包括以下步骤：(1)取烘干的蘘荷根茎为原料，切成0.5-1cm小段后，加入超纯水进行浸泡12-24小时，其中超纯水的加入量为蘘荷根茎质量的8倍，然后进行煎煮，时间为1小时，煎煮完之后进行过滤；(2)取过滤所得的滤渣，加入滤渣8倍质量的超纯水，进行煎煮1小时，煎煮完之后进行过滤，重复以上步骤；(3)将步骤(1)、(2)过滤所得的滤液进行合并，浓缩干燥成固态，得本发明目的组分，将得到的此目的组分进行以下实验。实施例2：抗肿瘤药理实验1、实验材料1.1动物SPF级昆明种小鼠(KunMingmice，KMmice)，♂，质量18-22g，由沈阳药科大学实验动物中心购自长生生物技术有限公司。动物在SPF级层流架中饲养，自由摄食和饮水，环境温度23±2℃，湿度30％-70％，照明时间12h/d(7:00～19:00开灯)。饲养3天后进行实验。1.2药品与试剂注射用环磷酰胺购自江苏恒瑞医药股份有限公司生产，批号12060625。S180和H22瘤株由沈阳药科大学药理教研室提供。2、实验方法2.1蘘荷水提物对S180荷瘤小鼠的抑瘤作用选接种8天健康状况良好的S180瘤源小鼠，腹部皮肤消毒后，注射器抽取腹水，离心后弃上清，无菌生理盐水稀释至细胞浓度为1×1010L-1，于每只小鼠右侧腋皮下接种0.2mL以形成实体瘤。次日将小鼠随机分为5组，每组10只，分别为模型对照组(生理盐水)、阳性对照组(环磷酰胺)、实施例1所得水提物组(1g/kg)、实施例1所得水提物组(2g/kg)、实施例1所得水提物组(4g/kg)，连续给药8d，末次给药24h后颈椎脱臼处死小鼠，称体重，剥取瘤块、脾脏和胸腺并称重。按照下列公式计算抑瘤率、脾指数和胸腺指数。抑瘤率％＝(1-模型对照组平均瘤重/实验组平均瘤重)×100％脾(胸腺)指数＝[脾(胸腺)重量(mg)/体重(g)]×100％结果如表1所示。表1蘘荷水提物对小鼠S180肿瘤的抑制作用(Mean±S.D.,n＝10)注：*P<0.05，**P<0.01，与模型组相比结果表明，与模型组相比，蘘荷水提物低、中剂量组可显著降低S180荷瘤小鼠的瘤重，抑瘤率分别为46.15％，52.31％，而且没有环磷酰胺的抑制胸腺指数的副作用。2.2蘘荷水提物对H22荷瘤小鼠的抑瘤作用昆明种小鼠50只，按文献报道方法取传代第7天的H22小鼠腹水2mL，用生理盐水调至2×1010L-1，在每只小鼠右腋皮下接种瘤细胞悬液0.2mL。按体重随机分为5大组(10只/组)，分别为模型对照组(生理盐水)、阳性对照组(环磷酰胺)、实施例1所得水提物组(1g/kg)、实施例1所得水提物组(2g/kg)、实施例1所得水提物组(4g/kg)，连续给药8d，末次给药24h后颈椎脱臼处死小鼠，称体重，剥取瘤块、脾脏和胸腺并称重。按照下列公式计算抑瘤率、脾指数和胸腺指数。抑瘤率(％)＝对照组(NS)平均瘤重-给药组平均瘤重/对照组平均瘤重×100％脾(胸腺)指数＝[脾(胸腺)重量(mg)/体重(g)]×100％结果见表2。表2蘘荷水提物对小鼠H22肿瘤的抑制作用(Mean±S.D.,n＝10)注：*P<0.05，**P<0.01，与模型组相比结果表明，与模型组相比，蘘荷水提物低、中剂量组可显著降低H22荷瘤小鼠的瘤重，抑瘤率分别为34.46％，41.22％，而且没有环磷酰胺的抑制胸腺指数的副作用。在上述两个抗肿瘤实验中，蘘荷水提物高剂量均没有降低瘤重的作用，即是说，在服用剂量为1-2g/kg时，按照本实施例1所示方法得到的蘘荷水提物能起到很好的抑制小鼠S180肿瘤和H22肿瘤的作用。所以说，在将蘘荷水提物应用到制备抗肿瘤药物时，其剂量非常重要。实施例3：镇痛、抗炎实验1、实验材料1.1动物SPF级昆明种小鼠(KunMingmice，KMmice)，♂，质量18-22g，由沈阳药科大学实验动物中心购自长生生物技术有限公司。动物在SPF级层流架中饲养，自由摄食和饮水，环境温度23±2℃，湿度30％-70％，照明时间12h/d(7:00～19:00开灯)。饲养3天后进行实验。1.2药品与试剂阿司匹林购自沈阳奥华制药有限公司，批号121101；二甲苯购自天津市迪博化工有限公司，批号20090224；冰乙酸购自天津市大茂化学试剂厂，批号20111118。2、实验方法2.1小鼠扭体反应实验取雌性KM小鼠50只，体重18-22g，随机分为5组，每组10只。分别为模型组，阳性药组(阿司匹林,100mg/kg)，水提物低剂量组(1g/kg)、水提物中剂量组(2g/kg)、水提物高剂量组(4g/kg)。稳定2天后，按0.2ml/10g体重灌胃给药，模型组给以等量的生理盐水，每天1次，共5天。末次给药后1h，所有小鼠腹腔注射0.6％冰乙酸0.2ml/只。记录15min内小鼠扭体的次数。扭体次数减少百分率＝(模型组平均扭体次数—给药组平均扭体次数)/模型组平均扭体次数×100％。2.2二甲苯致小鼠耳肿胀实验取KM小鼠50只，♂，体重18-22g，适应饲养3天后，按照体重均衡原则随机分成5组，每组10只。分别为模型组，阳性对照组(阿司匹林,100mg/kg)，水提物低剂量组(1g/kg)、水提物中剂量组(2g/kg)、水提物高剂量组(4g/kg)。稳定2天后，按0.2ml/10g体重灌胃给药，模型组给以等量的生理盐水，每天1次，共7天。于末次给药后1h，将小鼠右耳正反两面涂20μl二甲苯致炎，左耳不涂作为空白对照。30min后，脱颈处死小鼠，用直径8mm的打孔器在左右两耳同一位置打下耳片，精密称重(mg)记录。观察指标：耳肿胀度及耳肿胀抑制率：以左右耳片重量差为肿胀度并计算肿胀抑制率，耳肿胀抑制率％＝(模型组平均耳肿胀度-给药组平均耳肿胀度)/模型组平均耳肿胀度×100％；3、实验结果表3水提物对冰醋酸致小鼠扭体反应的影响注：**P<0.01，与模型组相比表4水提物对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响注：*P<0.05，**P<0.01，与模型组相比由表3、表4可知，蘘荷水提物中剂量(2g/kg)具有明显的镇痛、消炎作用，而低剂量(1g/kg)和高剂量(4g/kg)不具有镇痛、消炎作用，这指示本发明蘘荷水提物在作为应用于制备镇痛、消炎药物时，其剂量至关重要。即，按照本发明方法从蘘荷中提取得到的抗肿瘤活性组分，应用在制备镇痛、消炎药物中，可以起到很好的镇痛、消炎作用。实施例4：蘘荷水提物体外抗菌试验研究1、实验用品1.1材料与试剂牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3.0g,蛋白胨10.0g,NaCl5.0g,琼脂20.0g馏水1000ml,pH7.4-7.6。PRMI1640培养基:RPMI1640(Gibco)10g，NaHCO32.0g，三氮吗啡啉丙磺(segma)34.5g，加三蒸水溶解，1mol/LNaOH调整pH至7.0后，定容至1000mL，0.25μm微孔滤膜过滤除菌后放置4℃保存备用。蒸馏水由由沈阳药科大学自制；100％酒精购自天津博迪化工有限公司；二甲基亚砜(DMSO)购自天津市大茂化学试剂厂；氟康唑购自北京鼎国昌盛生物技术公司；氨苄青霉素购自北京鼎国昌盛生物技术公司。1.2仪器紫外分光光度仪购自上海棱光技术有限公司；96孔板购自爱思达医用塑料有限公司；净化工作台购自沈阳利港净化设备有限公司；0.25μm微孔滤膜购自莱博科技有限公司。1.3菌株疣状毛癣菌(Trichophytonverrucosum)、白色念珠菌(Candidaalbicans)参考株(CMCC03382)1株、金黄色葡萄球菌(StaphyloccocusaureusRosenbach)、大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumonia219)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、产气荚膜杆菌(Clostridiumperfringen)由沈阳药科大学微生物实验室提供保存。2.实验方法2.1药物原液的配制分别精密称取实施例1目的活性组分(蘘荷水提物)，氟康唑，青霉素各12.80mg，加DMSO1mL溶解后，在加9mL无菌蒸馏水定溶至10mL，使配制成浓度为1280μg/mL的储存液，0.25μm微孔滤膜4℃保存备用。2.2管碟法测定抑制细菌活性下层无菌培养基：将已分装的牛肉膏蛋白胨培养基固体培养基融化，每皿15mL定量倒入无菌平皿中。至于平的桌面冷凝。上层混菌培养基：取计数后的菌悬液200μL加入40mL融化放温的沙氏固体培养基中，制成终浓度为0.5～2.5×104cfu/mL的含菌培养基，混合均匀后快速取6-7mL均匀倒在上述凝好的无菌平板上，冷却至凝固，即得含菌双层平板。在双层平板的背面贴好标签，标注菌株、药品名称，用无菌的小镊子夹取已灭菌的小钢管，将其放置在双层平板表面的相应区域上，每个平皿放四个小钢管。用移液枪将相应等量200μL的对照品和待测样品供试液加到小钢管中，把培养皿的玻璃盖换成无菌陶土盖后放入37℃真菌培养箱中培养，24h后观察管碟法抑真菌结果，用直尺测量并记录抑菌圈直径(mm)。2.3最低抑菌浓度(MIC)法测定抑真菌、细菌活性。真菌MIC法：第一步，加培养基：每行的第1孔加入180μLPRMI1640培养基，2-11孔加入100μLRPMI1640培养基，12孔加入200μLRPMI1640培养基。第二步，加药：向第1孔中加入20μL氨苄青霉素，用移液枪混匀后吸取100μL至2孔，依次进行2倍稀释至第10孔后混匀弃去100μL。第三步，加菌：向1～11孔中各加100μL接种菌悬液。第11孔为生长对照，第12孔为空白培养基对照。阳性对照药物不设空白对照，即从第1孔开始做倍比梯度稀释直至第10孔，测试浓度(μg/mL)范围为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25。96孔板置于小塑料盒内，向每个盒中加入1mL蒸馏水，28℃培养，每天观察生长情况。以空白对照无菌生长，阴性对照生长良好作为判断试验操作是否合格的标准。细菌MIC法流程同真菌，培养基换成牛肉膏蛋白胨培养基。37℃培养一天观察。3.实验结果蘘荷水提物在640～1280μg/mL浓度时能显著抑制金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希氏菌3种测试菌株的生长繁殖，形成抑菌圈，浓度越大抑菌圈直径越大；但对产气荚膜杆菌和枯草芽孢杆菌抑菌作用不明显。蘘荷水提物对疣状毛癣菌和白色念珠菌的MIC均为0.25μg/mL，对金色葡萄球菌的MIC为0.5μg/mL。实施例5：具体实施病例1、张XX，男，46岁，确诊患肺癌两年余，经取蘘荷根80克水煎，大火烧开后文火煎约20分钟，共反复三次，将药液混合，每日分三次服用，每次80毫升，连续服用一个月后，自感不适症状基本消失，经CT检查发现肿瘤组织未见增大，现仍在继续服用。2、于X，男，62岁，医院诊断为肺癌晚期，出院后在家自行蘘荷根水煎剂三个月后，咳嗽、咯血、胸痛症状明显减轻，无任何不良反应，现仍在继续服用。3、王XX，女，12岁，上呼吸道感染导致咳嗽、咯痰，服用蘘荷根水煎剂3天，症状明显减轻；服用6天后症状基本消失。本研究发现蘘荷水提物具有抗肿瘤、镇痛抗炎及特定菌的抗菌活性，提示蘘荷根茎具有很好的开发利用价值。接下来我们将对实施例1所得的活性组分进行成份、纯度等进一步鉴定，以期望于能获得高纯度的活性单体。本项研究的目的就是在总结临床经验和初步试验证明蘘荷提取物有抗癌、镇痛抗炎、抗菌作用的基础上，力争为临床奉献一个低毒有效的新型中药制剂。为了保障我们的科研成果，也为鼓励我们进一步深入研究，我们特先申请此专利，希望获批。本发明实施例涉及到的材料、试剂和实验设备，如无特别说明，均为符合中药制品加工的普通市售产品。以上所述，仅为本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的核心技术的前提下，还可以做出改进和润饰，这些改进和润饰也应属于本发明的专利保护范围。与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。