利用聚乙二醇的磁共振造影剂及磁共振成像方法
【专利摘要】本发明涉及利用聚乙二醇的磁共振造影剂及磁共振成像方法，其目的在于提供具备安全性及定量性、能以较短重复时间连续获得磁共振图像的技术。使用含有以天然丰度以上的比例含有13C的聚乙二醇或被该聚乙二醇标记的化合物的磁共振造影剂，以60秒以下的重复时间施加激发脉冲，连续获得磁共振信号。
【专利说明】利用聚乙二醇的磁共振造影剂及磁共振成像方法
[0001]本申请是申请日为2007年05月14日、申请号为200780017678.9 (国际申请号为PCT/JP2007/059849)、发明名称为“利用聚乙二醇的磁共振造影剂及磁共振成像方法”的申请的分案申请。
【技术领域】
[0002]本发明涉及利用聚乙二醇的磁共振造影剂，更详细而言，涉及用于以60秒以下(优选I秒以下、更优选250毫秒以下、特别优选100毫秒以下)的重复时间(!^petit1ntime)施加激发脉冲而连续获得磁共振信号的磁共振造影剂。本发明还涉及使用所述磁共振造影剂的磁共振信号的获得方法及磁共振成像方法。
【背景技术】
[0003]最近，作为利用造影剂的图像诊断，正在实际应用使用正电子或放射线标记造影剂的成像技术(PET、SPECT等)或利用磁共振现象的MRI (磁共振成像:magnetic resonanceimaging)。利用PET或SPECT成像技术不是不能得到病变部位的定量信息，但另一方面，由于存在放射能的半衰期问题，所以具有不能稳定地保存造影剂的缺点。另外，放射性化合物存在给人体带来不良影响的危险，这一点对受试者来说也是不理想的。而MRI由于测定稳定的同位素核，所以对人体而言是安全的成像技术，具有能消除由放射性同位素不稳定性引发的上述缺点的优点。因为这个原因人们认为MRI成像技术的利用将在今后逐步扩大。
[0004]现有的MRI中通常使用IH作为磁共振的对象核，作为其造影剂，已知有作为钆(Gd)配位化合物的Gd造影剂、利用氧化铁微粒的超顺磁性氧化铁胶体制剂(SP1)等。上述造影剂的原理如下:在受试者体内通过缩短周围存在的水分子的IH的弛豫时间(relaxat1n time),间接地使其存在可视化。但是,利用IH作为磁共振的对象核的MRI中，由于用IH得到的磁共振信号和造影剂浓度的线性不完全，所以存在难以获得能在分子成像等中进行定量分析的图像的缺点。另外，为了将质子以外的核种类中与质子大致相同灵敏度的19F核应用到利用MRI的分子成像中，进行了研究，但由于含氟原子的化合物的合成困难等，未能达到实用化。进而，每次使用利用氧化铁或钆的造影剂、或利用氟等原子的造影剂时，都不得不考虑一定程度的毒性。
[0005]另一方面，使含有13C的分子存在于受试体内，通过测定13C磁共振信号，也能进行MRI成像，由此可知能够使用含有13C的分子作为MRI用造影剂。该13C磁共振信号，与IH的情形相比，由于在受试体内的背景值低，所以认为对于获得用于定量评价的图像是有用的。但是，13C磁共振信号具有易受该分子结构影响的缺点。因此，为了增强13C磁共振信号而在单一分子中导入多个13C时,有时产生分子内各13C的化学位移分散而降低测定精度的问题。另外，使导入了 13C的分子与抗体等分子量比较大的蛋白质结合时，有时也发生13C磁共振信号减弱的不良情况。
[0006]另外，MRI成像中，为了减轻受试者的负担等而要求在短时间获得磁共振图像，人们认为利用Tl弛豫(纵弛豫)时间适度缩短的分子作为MRI用造影剂是有效的。但是，在利用含有13C的分子获得磁共振信号时，Tl弛豫时间主要依赖于其分子结构等，所以现状是不知道什么样结构的分子的Tl弛豫时间短、对以短时间连续获得磁共振图像有用。
[0007]人们迫切希望以上述现有技术为背景，开发出安全性高、也能用于定量评价、且能在短时间内连续获得磁共振信号的技术。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于提供具备安全性和定量性、同时能以较短的重复时间连续获得磁共振信号的造影剂，及使用该造影剂的磁共振信号的获得方法及磁共振成像方法。
[0009]本发明人等为了解决上述课题而进行了深入研究，发现使用含有以天然丰度以上的比例含有13C的聚乙二醇、或被该聚乙二醇标记的化合物的造影剂，将重复时间设定在60秒以下(优选I秒以下、更优选100毫秒以下)，反复施加激发脉冲，能连续定量地测定13C磁共振信号，并能在短时间内获得能用于定量分析的磁共振图像。本发明是基于上述认识并经反复改良而完成的。
[0010]即，本发明提供下述造影剂。
[0011]项1.一种磁共振造影剂，用于以60秒以下的重复时间施加激发磁场的脉冲而连续获得磁共振信号并将其图像化，其特征在于，
[0012]所述磁共振造影剂含有聚乙二醇或被该聚乙二醇标记的化合物，所述聚乙二醇以天然丰度(natural abundance)以上的比例含有13C。
[0013]项2.如项I所述的磁共振造影剂，其中，所述聚乙二醇的13C的比例为总碳原子的 20 ?100%。
[0014]项3.如项I所述的磁共振造影剂，其中，所述聚乙二醇的重均分子量为470?10000000。
[0015]项4.如项I所述的磁共振造影剂，其中，所述化合物为被聚乙二醇标记的抗体，所述聚乙二醇以天然丰度以上的比例含有13C。
[0016]本发明还提供下述磁共振成像方法。
[0017]项5.—种磁共振成像方法，其特征在于，以60秒以下的重复时间对给与了磁共振造影剂的受试体施加激发磁场的脉冲，由此连续获得磁共振信号，进行图像化，所述磁共振造影剂含有聚乙二醇或被该聚乙二醇标记的化合物，所述聚乙二醇以天然丰度以上的比例含有13C。
[0018]项6.如项5所述的磁共振成像方法，其中，所述聚乙二醇的13C的比例为总碳原子的20?100%。
[0019]项7.如项5所述的磁共振成像方法，其中，所述聚乙二醇的重均分子量为470?10000000。
[0020]项8.如项5所述的磁共振成像方法，其中，所述化合物为被聚乙二醇标记的抗体，所述聚乙二醇以天然丰度以上的比例含有13C。
[0021 ] 本发明还提供下述磁共振信号的获得方法。
[0022]项9.一种磁共振信号的获得方法，其特征在于，以60秒以下的重复时间对给与了磁共振造影剂的受试体施加激发磁场的脉冲，由此连续获得磁共振信号，所述磁共振造影剂含有聚乙二醇或被该聚乙二醇标记的化合物，所述聚乙二醇以天然丰度以上的比例含有13C。
[0023]项10.如项9所述的方法，其中，所述聚乙二醇的13C的比例为总碳原子的20?100%。
[0024]项11.如项9所述的方法，其中，所述聚乙二醇的重均分子量为470?10000000。
[0025]项12.如项9所述的方法，其中，所述化合物为被聚乙二醇标记的抗体，所述聚乙二醇以天然丰度以上的比例含有13C。
[0026]本发明还提供下述以天然丰度以上的比例含有13C的聚乙二醇、或被该聚乙二醇标记的化合物的应用。
[0027]项13.以天然丰度以上的比例含有13C的聚乙二醇或被该聚乙二醇标记的化合物在制备磁共振造影剂中的应用，所述磁共振造影剂用于以60秒以下的重复时间施加激发磁场的脉冲，从而连续获得磁共振信号。
[0028]项14.如项13所述的应用，其中，所述聚乙二醇的13C的比例为总碳原子的20?100%。
[0029]项15.如项13所述的应用，其中，所述聚乙二醇的重均分子量为470?10000000。
[0030]项16.如项13所述的应用，其中，所述化合物是被以天然丰度以上的比例含有13C的聚乙二醇标记的抗体。
[0031]项17.以天然丰度以上的比例含有13C的聚乙二醇或被该聚乙二醇标记的化合物在制备磁共振造影剂中的应用，所述磁共振造影剂用于以60秒以下的重复时间施加激发磁场的脉冲，从而连续获得磁共振信号，进行图像化。
[0032]项18.如项17所述的应用，其中，所述聚乙二醇的13C的比例为总碳原子的20?100%。
[0033]项19.项17所述的应用，其中，所述聚乙二醇的重均分子量为470?10000000。
[0034]项20.项17所述的应用，其中，所述化合物为被以天然丰度以上的比例含有13C的聚乙二醇标记的抗体。
[0035]利用本发明的造影剂，即使将重复时间设定为60秒以下(优选I秒以下、更优选250毫秒以下、特别优选100毫秒以下)，反复施加激发脉冲，也能得到高精度的磁共振信号，所以对高速获得清晰的磁共振图像是有用的。
[0036]用于本发明的造影剂的聚乙二醇即使含有多个13C，各13C的化学位移也不分散，集中于一点，所以能获得高精度的磁共振信号。另外，本发明的造影剂由于利用13C磁共振信号，所以与IH的情况相比，受试体内的背景值低，能获得可定量评价的图像。
[0037]进而，以天然丰度以上的比例含有13C的聚乙二醇即使结合在蛋白质等高分子量的其他化合物上，也几乎不影响该磁共振信号。因此，根据本发明，能在短时间内实施以下
(I)?(4)所示的诊断、判定、可视化等。
[0038](I)在特异性识别特定的病灶部位的抗体上结合上述聚乙二醇，将其用作造影剂，由此将病灶部位可视化，进行诊断。
[0039](2)在特异性识别特定的细胞的抗体上结合上述聚乙二醇，将其用作造影剂，由此使该细胞的体内动态可视化。
[0040](3)使脂质体制剂等DDS制剂中含有上述聚乙二醇或结合了该聚乙二醇的化合物，通过给与该制剂，判定制剂在目标部位的蓄积度。
[0041](4)直接将含有13C的聚乙二醇给与人体，通过使其在特定的脏器或部位蓄积一定时间，使特定脏器或部位可视化。
[0042]进而，本发明的造影剂使用13C，所以与用于PET或SPECT等的含有放射性化合物的造影剂相比，不仅安全性高，而且经时稳定，所以也具有有足够时间进行磁共振成像的优点。
【具体实施方式】
[0043]本发明的造影剂含有以天然丰度以上的比例含有13C的聚乙二醇(以下标记为“ 13C-PEG” )、或被该13C-PEG标记的化合物。
[0044]用于本发明的13C-PEG只要是以天然丰度以上的比例(即总碳原子的约I %以上)含有13C的13C-PEG即可。从提高磁共振信号的检测灵敏度的观点来看，13C占总碳原子的比例为20?100%，优选为50?100%，更优选为90?100%，特别优选为大致100%的13C-PEG是理想的。聚乙二醇由-CH2CH2O-的重复结构构成，所有碳原子的化学环境相同，所以即使在同一分子内含有多个13C,各13C的化学位移也不分散,集中于一点,所以具有磁共振信号被增强而检出的优点。
[0045]另外，作为用于本发明的13C-PEG的分子量，没有特别限定，基于13C的含有比例等适当设定。例如，13C的含有比例低时，13C-PEG的分子量优选为高者，另外，13C的含有比例高时，13C-PEG的分子量可以为低者。作为用于本发明的13C-PEG之一例，可以举出重均分子量为 470 ?10000000、优选为 6000 ?2000000 的 13C-PEG。
[0046]本发明中可以直接使用上述13C-PEG，但也可以使用被上述13C-PEG标记的化合物(以下标记为“13C-PEG修饰化合物”)。此处，所谓13C-PEG修饰化合物是指13C-PEG直接或通过成为连接体的基团结合在化合物上得到的13C-PEG修饰化合物。在上述13C-PEG修饰化合物中，作为成为13C-PEG的标记(结合)对象的化合物，例如可以举出单克隆抗体、多克隆抗体等抗体；所述抗体的Fab片段；白蛋白、转铁蛋白等血清蛋白质；干扰素、红细胞生成素、白细胞介素、M-CSF, G-CSF、胰岛素、脂肪素(adipokine)等药理活性蛋白质；EP-1873 (Epix Pharma)、依文氏蓝(Evans Blue)、刚果红、硫磺素-S、(E,E)-1-溴-2, 5-双(3-羟基羰基-4-羟基)苯乙烯基苯出58)、伍4)-1-氟-2，5-双(3-羟基羰基-4-羟基)苯乙烯基苯(FSB)等低分子化合物；构成能在内部封入药物的脂质体的化合物等。例如，利用结合了能特异地结合在特定的病灶部位(例如癌、动脉硬化、炎症等部位)的抗体的13C-PEG修饰化合物，能使该特定病灶部位可视化。另外，例如如果使用结合了药理活性蛋白质的13C-PEG修饰化合物，则能判定该药理活性蛋白质在治疗目标部位的蓄积度。
[0047]通过用公知的方法使上述13C-PEG和成为标记对象的化合物结合来制备上述13C-PEG修饰化合物。作为优选例，如果作为标记对象的化合物具有氨基(具体而言是抗体或药理活性蛋白质)，则可以举出用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)将上述聚乙二醇进行活性酯化，使其与成为标记对象的化合物形成酰胺键的方法。
[0048]在上述13C-PEG修饰化合物中，作为结合在成为标记对象的化合物上的上述13C-PEG的数量，以不损害成为标记对象的化合物所希望的活性为限度，没有特别限定。例如，上述13C-PEG修饰化合物，对于成为标记对象的化合物，可以结合一个13C-PEG，也可结合2个以上13C-PEG。
[0049]本发明的造影剂如下调制，将上述13C-PEG或13C-PEG修饰化合物溶解在药学或化学上允许的溶剂例如生理盐水、等渗磷酸缓冲液等中进行调制。本发明的造影剂中，上述聚乙二醇或13C-PEG修饰化合物的浓度可以根据图像形成方式、测定方式、测定部位等适当设定。作为一例，可以举出相对于本发明造影剂的总量，上述13C-PEG或13C-PEG修饰化合物的浓度达到0.0001?100重量％、优选0.001?50重量％、更优选0.01?10重量％。
[0050]进而，本发明的造影剂除含有上述成分之外，还可以含有适量的增溶剂、乳化剂、粘度调节剂、缓冲剂等添加剂。
[0051]本发明的造影剂通过静脉内注射、皮下注射、肌肉内注射、口服给药或其他方法给与受试者。根据上述13C-PEG或13C-PEG修饰化合物的13C的含有量、磁共振图像的测定部位等适当设定本发明的造影剂的给与量。例如，本发明的造影剂的给与量可以设定为在测定部位上述13C-PEG或13C-PEG修饰化合物的13C原子数为每Icm3为I X 10_12mol以上，优选为lX10_8mol以上，更优选为lX10_6mol以上。
[0052]本发明的造影剂用于通过以60秒以下的重复时间施加激发磁场(RF波)的脉冲，连续获得磁共振信号。此处，所谓重复时间(time of repetit1n:TR)是指一个脉冲序列所需的总时间。换言之，TR表示在累积测定中从一个脉冲序列的最初至下一脉冲序列的最初的时间间隔。本发明的造影剂中所用的上述13C-PEG或13C-PEG修饰化合物由于具有Tl弛豫时间适当缩短的优点，所以能在将该重复时间如上所述设定为较短的情况下，连续地获得磁共振图像。用本发明的造影剂时，从更高速地连续获得磁共振信号的观点来看，能将重复时间优选设定为I秒以下，更优选为250毫秒以下，特别优选为60?100毫秒。由此，本发明的造影剂能将重复时间设定为较短时间，并能连续获得磁共振信号，所以优选用于闻速图像化。
[0053]使用本发明的造影剂获得的磁共振信号能直接用于诊断等。另外，也可以将该磁共振信号进行图像化获得磁共振图像，将其用于各种诊断。
[0054]使用本发明的造影剂获得磁共振信号时的其他条件、例如激发磁场的脉冲的持续时间、磁共振信号的测定方法等，可以由获得磁共振信号通常所采用的条件适当设定。另外，针对磁共振信号的图像化方法，可以由获得磁共振图像通常所采用的条件适当设定。
[0055]因此，本发明的造影剂能适用于公知的成像方法，具体而言为化学位移成像法、质子检测13C化学位移成像法、快速自旋回波法、梯度回波法等成像方法。
[0056]【实施例】
[0057]以下，基于实施例详细说明本发明，但本发明并不限定于此。需要说明的是，以下，附在标记“13C-PEG”前的比例)表示在该13C-PEG中13C相对于总碳原子的比例。另夕卜，附在标记“13C-PEG”后面的数值表示该13C-PEG的分子量。
[0058]实施例1
[0059]为了研究13C-PEG的NMR光谱特性进行了以下试验。将几乎所有碳原子均为13C的 13C-PEG6000 [以下标记为 99% 13C-PEG6000，从 Cambridge Isotope Laboratories,Inc(CIL公司)购得]以浓度2.2mg/ml溶解在重水(D2O)中，将其作为样品，测定NMR光谱。另外，将具有天然丰度(1% )的13C的13C-PEG6000(以下标记为1% 13C-PEG6000)以浓度22mg/ml溶解在重水(D2O)中，将其作为样品，测定NMR光谱。
[0060]需要说明的是，NMR光谱的装置及测定条件如下所示:[0061 ] 装置:高分辨率NMR装置
[0062]仪器台(Console):Varian Unity INOVA
[0063]磁铁:Oxford300MHz
[0064]测定条件:在观测频率75MHz、测定温度23°C、单脉冲法(质子去偶)、延迟时间I秒、45°脉冲下测定
[0065]所得的结果示于图1。99% 13C-PEG6000尽管为高分子，但显示非常尖锐的NMR信号(参见图1a)。另外，99% 13C-PEG6000中，由于所有碳原子均处于相同的化学环境，所以化学位移集中于一点，达到较强的信号强度。而浓度被设定为99% 13C-PEG6000的10倍的高浓度1% 13C-PEG6000显示了 99% 13C-PEG6000的大致十分之一的信号强度，所以确认了基于13C的信号强度与13C的数量对应，并且定量性极高。
[0066]实施例2
[0067]将99% 13C-PEG6000以浓度2.5mg/ml溶解在重水(D2O)溶剂中，将其用作样品，研究在以下测定条件下即缩短照射脉冲(90°脉冲)、获得FID(1.3秒)之后的延迟时间(回波收集结束后至下一激发为止的时间；停顿时间！acquisit1n delay ；dead time)的间隔时对信号强度的影响。另外，作为比较，将13C-丙酮酸[丙酮酸钠(1-13C，99%)、CIL公司]以浓度25mg/ml溶解在重水中得到的液体和将I位碳原子为13C的葡萄糖[D-葡萄糖(1-13C, 99% ) XIL公司制](以下标记为13C-葡萄糖)以浓度2.2mg/ml溶解在重水中得到的液体分别作为样品，相同地进行试验。
[0068]装置:高分辨率NMR装置
[0069]仪器台:VarianUnity INOVA
[0070]磁铁:Oxford3OOMHz
[0071]测定条件:在观测频率75MHz、测定温度23°C、单脉冲法(质子去偶)、90°脉冲下测定。
[0072]所得的结果示于图2及3。如图2a所示，用13C-丙酮酸时，将延迟时间设定为60秒以下时，信号强度急剧减小。该现象是13C-丙酮酸的Tl弛豫时间非常长(质子未直接结合的碳原子的Tl弛豫时间延长)导致的。与此相对，关于99% 13C-PEG6000，如图2b及图3b所示，即使将延迟时间缩短至20msec左右，也几乎未观测到信号强度的减小。认为该现象是由于99% 13C-PEG6000的Tl弛豫时间在一定程度上缩短。
[0073]另外，关于13C-葡萄糖，虽然观测到葡萄糖的α型、β型异构体的两种碳的信号，但其均与质子直接共价键合，所以与丙酮酸的情况相比，它们的Tl时间缩短。因此，即使缩短延迟时间，也未观察到像在丙酮酸中观测到的60秒以下的急剧减小。但是，其中需要说明的是，α型、β型的I位碳均确认伴随延迟时间间隔缩短信号强度减小(参见图3a)。葡萄糖的α型、β型异构体的两种碳的信号强度之和在延迟时间间隔从200秒变成20毫秒时信号强度减小21%，而99% 13C-PEG6000的情况下，信号强度减小仅仅为3.9 %。由此可认为，在99% 13C-PEG6000中，即使缩短延迟时间间隔至20毫秒，信号强度也不减小的现象是来自13C-PEG特有的Tl弛豫时间。
[0074]实施例3
[0075]将99% 13C-PEG6000以浓度2.5mg/ml溶解在重水(D2O)溶剂中，将其作为样品，使用磁场强度7特斯拉的MRI装置，研究在以下的测定条件下、即以重复时间为60?200毫秒施加脉冲时对信号强度的影响。另外，作为比较，将13C-葡萄糖以浓度2.2mg/ml溶解在重水中，得到的溶液作为样品，同样地进行试验。
[0076]装置:MRI装置(磁场强度7特斯拉)
[0077]仪器台:VarianUnity INOVA
[0078]磁铁JASTEC 7T
[0079]测定条件:在观测频率75MHz、测定温度23°C、单脉冲法(质子去偶)、40°脉冲下测定
[0080]所得的结果示于图4。如图4明确可知，在40°脉冲下测定时，葡萄糖的信号在脉冲间隔从200毫秒变成100毫秒时，减小约30%，与此相对，在99% 13C-PEG6000的情况下，即使缩短至100毫秒，也只观察到信号强度减小约4%左右。由以上结果可知，在MRI装置中，也能利用13C-PEG6000能缩短重复时间的特征。
[0081]实施例4
[0082]使用在I % 13C-PEG的一个末端的羟基上键合NHS的I % 13C-PEG5000NHS及I %13C-PEG20000NHS(日本油脂公司制)，标记IgG。标记反应后，利用凝胶过滤和蛋白A柱进行纯化处理，由此除去未反应的1% 13C-PEG(参见图5a)。由图5a所示的SDS-PAGE像明显可确认，可在高分子侧确认多条带，实际上可确认1% 13C-PEG以共价键被IgG标记。
[0083]将由此得到的1% 13C-PEG5000标记IgG以浓度14.lmg/ml溶解在重水中，将1%13C-PEG20000标记IgG以浓度5.lmg/ml溶解于重水中，分别作为样品，进行NMR光谱的测定。需要说明的是，NMR光谱的装置及测定条件如下所示:
[0084]装置:高分辨率NMR装置
[0085]仪器台:VarianUnity INOVA
[0086]磁铁:Oxford3OOMHz
[0087]测定条件:在观测频率75MHz、测定温度23°C、单脉冲法(质子去偶)、延迟时间I秒、45°脉冲下测定
[0088]所得的结果示于图5b及图6。由图5b可明确地确定，1% 13C-PEG5000及1%13C-PEG20000即使结合在IgG上，与未结合在IgG上的情况相同，化学位移集中于一点，并显示非常尖锐的信号。进而，如图6可知，在1% 13C-PEG5000中，信号的半峰宽也基本不受与IgG结合的影响。由该结果可判明，与IgG之类高分子蛋白质结合不引起PEG的信号强度减小或光谱变宽等不良情况。
[0089]实施例5
[0090]使用具有天然丰度(1% )的13C的PEG研究PEG的分子量增加时NMR信号的强度及半峰宽如何变化。所用的PEG的平均分子量为35000、500000、2000000的3种。使用高分辨率核磁共振装置测定NMR光谱。需要说明的是，测定条件如下所示。
[0091 ] 装置:日本电子JNM-ECA500
[0092]磁铁:0xford(ll.7Tesla, 500MHz)
[0093]测定备件
[0094]观测频率:125MHz
[0095]温度:25°C
[0096]观测幅度:3 IKHz
[0097]数据点:32K
[0098]脉冲序列:单脉冲去偶
[0099]偏转角(flipangle):45。
[0100]延迟时间:2秒
[0101]数据读取时间:1秒
[0102]结果示于图7。所有分子量的PEG的浓度均为0.5mg/ml (溶剂为D20)，将0.5mM的13C-丙氨酸(CIL公司、羧酸的碳为13C。)添加到各样品中作为内部对照，进行测定。在176.5ppm的位置观测到13C-丙氨酸的羧酸的碳信号，所有分子量的PEG的信号均在69.5ppm附近(因分子量不同，有时偏离0.1ppm左右)被观察到。所有PEG信号均是非常尖锐的信号，测定各个PEG的NMR信号的半峰宽的结果为，PEG35000、PEG500000、PEG2000000的半峰宽分别为2.99、3.03、3.25Hz，分子量即使增大，也基本未见半峰宽变化。另外，以信号的高度评价各PEG的NMR信号的信号强度时，以13C-丙氨酸的羧酸的信号为I时，所有PEG中的信号强度(峰的高度)均为8?10左右，相同重量浓度的PEG溶液样品中，未见因分子量不同而信号强度(峰的高度)有较大差异(图7a、b、c)。也就是说，PEG分子量即使大至2000000左右，也完全不发生分子内碳的NMR信号强度减弱的情况，这可以由该试验判明。将各PEG的浓度换算为摩尔浓度时，PEG35000、PEG500000、PEG2000000的样品为14.2 μ M、1.0 μ M、0.25 μ Μ。如果在此种情况下评价每个PEG单分子的信号高度，则以13C-丙氨酸为I时，分别计算为283、4000、19400，结果为信号强度(峰的高度)大致与PEG的分子量成比例地增大。由以上结果明确，在溶液的粘性不成问题时，PEG的NMR信号的信号强度(峰的高度)大致与PEG的分子量成比例地变大。
[0103]实施例6
[0104]将99% 13C-PEG6000溶解在纯水(H2O)中，达到33mg/ml，作为样品。将0.1ml该样品注射给与大鼠(从日本CLEA购得、雄性SD大鼠、14周龄)侧头肌，在以下条件下获得MRI图像。
[0105]装置:MR仪器台 Varian Unity I NOVA、磁铁 JASTEC 7T
[0106]脉冲序列:质子去偶13C 2D化学位移成像(无切片选取(no slice select1n))
[0107]位相编码:8 X 8
[0108]成像视野(FOV): 50 X 50mm2
[0109]重复时间:1秒
[0110]矩阵:32X 32
[0111]累积测定次数:8次
[0112]总测定时间:8分32秒
[0113]所得的结果示于图8。由该结果确认，利用99% 13C-PEG6000,即使以I秒的短重复时间，也能将大鼠的侧头肌清晰地图像化，进而可视化。
[0114]实施例7
[0115]将99% 13C-PEG6000 溶解在生理盐水中，达到 0.05mg/ml、0.5mg/ml 或 5mg/ml，将Iml各个溶液添加在I cm方形比色杯中。针对添加了各个99% 13C-PEG6000的比色杯，用以下的条件获得MRI图像。另外，作为比较，使用含有10重量％的13C-葡萄糖的生理盐水、或单独使用生理盐水，同样地获得MRI图像。
[0116]装置:MR仪器台 Varian Unity IN0VA、磁铁 JASTEC 7T
[0117]脉冲序列:质子去偶13C 2D化学位移成像(无切片选取)
[0118]位相编码:8 X 8
[0119]成像视野(FOV): 50 X 50mm2
[0120]矩阵:32X 32
[0121]重复时间:250毫秒
[0122]累积测定次数:128次
[0123]总测定时间:34分钟
[0124]所得的结果示于图9。由图9可知,在装入Icm方形的比色杯的5mg/ml和0.5mg/ml的99% 13C-PEG6000能以充分的对比度可视化。另一方面，在0.05mg/ml的情况下，可观察到SN比(信号杂音比)显著降低，但其中需要说明的是，99% 13C-PEG6000的比色杯的位置能可视化至能充分确认的程度。
[0125]实施例8
[0126]使用99% 13C-PEG6000的水溶液，用几种成像方法获得MRI图像，并比较图像。具体而言，将99% 13C-PEG6000溶解在纯水(H2O)中，达到30mg/ml或5mg/ml，将其填充在各个Icm3的比色杯中，进行图像化。作为成像方法，使用13C化学位移成像(13C-CSI)、质子检测13C化学位移成像(ΙΗ-detected 13C-CSI)、13C梯度回波(13C-GRE)、13C快速自旋回波(13C-FSE)的4种成像方法。各成像在下面所示的条件下进行。
[0127]13C-CSI ;矩阵:8X8, FOV:50X 50mm2，重复时间:1 秒，测定时间:128 秒
[0128]ΙΗ-detected 13C-CSI ;矩阵:8X8, FOV:50X50mm2，重复时间:1 秒，测定时间:128秒
[0129]13C-GRE ;矩阵:64X64, FOV:50X50mm2，重复时间:30 毫秒，测定时间:123 秒，质子去偶
[0130]13C-FSE ;矩阵:32 X 32，FOV:50 X 50mm2,重复时间:I秒，回波链:8，回波间期(echo space):5毫秒，中央采集(centric acquisit1n),测定时间:64秒,质子去偶
[0131]结果示于图10。图10中，a表示利用13C化学位移成像法(13C-CSI)成像得到的图像，b表示利用质子检测13C化学位移成像法(ΙΗ-detected 13C-CSI)成像得到的图像，c表示利用13C梯度回波法(13C-GRE)成像得到的图像，以及d表示利用13C快速自旋回波法(13C-FSE)成像得到的图像。图10的a?d的图像中，上面配置有填充了 99%13C-PEG6000的5mg/ml溶液的比色杯，下面配置填充了 99% 13C-PEG6000的30mg/ml溶液的比色杯。
[0132]填充有99% 13C-PEG6000的5mg/ml或30mg/ml溶液的比色杯中的任一个均被可视化，但在这样短时间的成像条件下，确认30mg/ml的比色杯能被明确可视化。另外，比较13C-CSI (图1Oa)和lH-detectedl3C_CSI (图1Ob)时，二者在SN比或析像度等方面均未见较大差别。另一方面，利用13C-GRE及13C-FSE成像得到的图像能明确识别比色杯的正方形形状。另外，由本结果确认，通过利用13C-GRE及13C-FSE测定，与13C-CSI或lH-detected13C-CSI比较，能以相同程度的累积时间或更短时间的累积时间获得高析像度的图像。以上情况表示存在下述可能性，即以13C-PEG作为造影剂时，如果适当地应用13C-GRE或13C-FSE等，则也能够以更短时间获得高析像度的图像。
【专利附图】
【附图说明】
[0133]【图1】表示实施例1中测定的99% 13C-PEG6000(2.2mg/ml)和I %13C-PEG6000(22mg/ml)的 13C-NMR 光谱图。
[0134]【图2】表示实施例2中测定的结果，即13C-丙酮酸及99%13C-PEG6000的13C-NMR信号强度和延迟时间(Acquisit1n delay)的关系的图。
[0135]【图3】表示实施例2中测定的结果，即13C-葡萄糖及99%13C-PEG6000的13C-NMR信号强度和延迟时间(Acquisit1n delay)的关系的图。
[0136]【图4】表示实施例3中测定的结果，即用40°的脉冲、将重复时间设定为60?960毫秒时的13C-葡萄糖及99% 13C-PEG6000的13C-NMR信号强度的图。
[0137]【图5】图5中，a为各纯化工序中得到的1%13C-PEG20000标记IgG的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的照片。a中，从左列开始表示分子量标记物(marker)、标记前IgG(图中记为IgG)、标记反应后经凝胶过滤(Sephacryl S-200、Pharmacia)的1% 13C-PEG20000标记IgG (图中记为gelfilt)、凝胶过滤后用蛋白A柱进行亲和纯化得到的1% 13C-PEG20000标记IgG(图中标记为ProA)。另外，图5中，b是在实施例4中1%13C-PEG5000标记IgG及1% 13C-PEG20000标记IgG的13C-NMR光谱的测定结果。
[0138]【图6】表示99%13C-PEG6000和1% 13C-PEG5000标记IgG的信号半峰宽的比较图。
[0139]【图7】表示实施例5中得到的NMR光谱图。a为I% 13C-PEG35000 0.5mg/ml (14.2 μ Μ)的 NMR 光谱。b 为 I % 13C-PEG500000 0.5mg/ml (1.0 μ Μ)的 NMR 光谱。c 为I % 13C-PEG2000000 0.5mg/ml (0.25 μ Μ)的 NMR 光谱。
[0140]【图8】表示实施例6中得到的MRI图像的图。图8中，a为质子图像；b为99%13C-PEG6000的13C-化学位移图像，用蓝色表示；c为存在于大鼠的侧头肌内的脂肪的13C-化学位移图像，用红色表示；d为在质子图像上叠加99% 13C-PEG6000的13C-化学位移图像及内在脂肪的13C-化学位移图像后所表示的图像；e为质子图像上叠加99%13C-PEG6000的13C-化学位移图像后所表示的图像；f是在质子图像上叠加内在脂肪的13C-化学位移图像后所表示的图像。
[0141]【图9】表示实施例7得到的MRI图像的图。a为5mg/ml的99%13C-PEG6000的图像[上面的照片:质子图像。左上比色杯加有10重量％ 13C-葡萄糖，右上比色杯加有为5mg/ml的13C-PEG6000，下面的比色杯加有生理盐水。下面的照片:13C_PEG6000的CSI图像]。b为0.5mg/ml的99% 13C-PEG6000的图像[上面的照片:质子图像。左边的比色杯加有生理盐水，右边的比色杯加有0.5mg/ml的13C-PEG6000。下面的照片:13C_PEG6000的CSI图像]。c为0.05mg/ml的99% 13C-PEG6000的图像[上面的照片:质子图像。左边的比色杯加有生理盐水，右边的比色杯加有0.05mg/ml的99% 13C-PEG6000。中间的照片:99% 13C-PEG6000的CSI图像。下面的照片:经过图像处理切掉了中间图像的噪音得到的图像。可以明确识别0.05mg/ml的99% 13C-PEG6000的存在。]。
[0142]【图10】表示实施例8得到的MRI图像的图。图10中，a是利用13C化学位移成像法(13C-CSI)成像得到的图像；b为利用质子检测13C化学位移成像法(lH-detected13C-CSI)成像得到的图像；c为利用13C梯度回波法(13C-GRE)成像得到的图像；及d为13C快速自旋回波法(13C-FSE)成像得到的图像。需要说明的是，a-d的图像中，上面放置5mg/ml的99% 13C-PEG6000的比色杯，以及下面放置30mg/ml的99% 13C-PEG6000的比色杯，2个比色杯纵向配置。
【权利要求】
1.一种磁共振成像方法，其特征在于，以60秒以下的重复时间对给与了磁共振造影剂的受试体施加激发磁场的脉冲，由此连续获得磁共振信号，进行图像化，所述磁共振造影剂含有聚乙二醇或被所述聚乙二醇标记的化合物，所述聚乙二醇以天然丰度以上的比例含有13C。
2.如权利要求1所述的磁共振成像方法，其中，所述聚乙二醇的13C的比例为总碳原子的 20 ?100%。
3.如权利要求1所述的磁共振成像方法，其中，所述聚乙二醇的重均分子量为470?10000000。
4.如权利要求1所述?的磁共振成像方法，其中，所述化合物为被以天然丰度以上的比例含有13C的聚乙二醇标记的抗体。
5.如权利要求1所述的磁共振成像方法，其中，所述施加激发磁场的脉冲的重复时间为I秒以下。
6.—种磁共振信号的获得方法，其特征在于，以60秒以下的重复时间对给与了磁共振造影剂的受试体施加激发磁场的脉冲，由此连续地获得磁共振信号，所述磁共振造影剂含有聚乙二醇或被所述聚乙二醇标记的化合物，所述聚乙二醇以天然丰度以上的比例含有13C。
7.如权利要求6所述的方法，其中，所述施加激发磁场的脉冲的重复时间为I秒以下。
8.如权利要求6所述的方法，其中，所述聚乙二醇的13C的比例占总碳原子的20?100%。
9.以天然丰度以上的比例含有13C的聚乙二醇或被所述聚乙二醇标记的化合物在以60秒以下的重复时间施加激发磁场的脉冲而连续获得磁共振信号中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其中，所述施加激发磁场的脉冲的重复时间为I秒以下。
11.如权利要求9所述的应用，其中，所述聚乙二醇的13C的比例占总碳原子的20?100%。
【文档编号】A61K49/12GK104324393SQ201410497647
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2007年5月14日 优先权日:2006年5月17日
【发明者】铃木良和, 三浦岩, 饭田满 申请人:大塚制药株式会社