高取代度瓜尔豆胶磷酸酯的合成及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种合成高取代度瓜尔豆胶磷酸酯的方法，属生物高分子及化学合成【技术领域】。本发明采用特殊的磷酸化试剂，利用微波辅助技术高效合成了高取代的具有生物活性的瓜尔豆胶磷酸酯，拓展了瓜尔豆胶作为天然活性物质的应用范围。活性试验表明，本发明合成的瓜尔豆胶磷酸酯对HepG2肝癌细胞具有显著的体外抑制HepG2细胞的作用（IC50为19.71~28.42mg/mL），可作为HepG2肝癌细胞的抑制剂，用于制备抗癌药物。
【专利说明】高取代度瓜尔豆胶磷酸酯的合成及应用
【技术领域】
[0001]本发明属生物高分子及化学合成【技术领域】，涉及一种瓜尔豆胶磷酸酯的合成方法；本发明同时还涉及瓜尔豆胶磷酸酯的医药用途一作为HepG2肝癌细胞的抑制剂应用于制备抗癌药物中。
【背景技术】
[0002]多糖是自然界存在的一大类由单糖通过糖苷键连接而成的天然高分子化合物。具有显著的药效功能，如增强免疫功能、抗肿瘤、降血糖、抗衰老、抗病毒等生物活性而成为研究的热点。多糖所具备的生物活性与其化学结构有极为密切的关系。影响多糖生物学活性的结构因素包括分子量、所带的官能团、多糖的主链性质(糖单元组成和糖苷键类型)、支链的类型、单糖连接方式以及多糖分子的高级结构如空间构象等。其中官能团的种类对多糖生物活性的影响极大，如糖链上的硫酸基、乙酰基、烷基等的取代位置、含量及络合元素的种类决定了多糖有何活性及活性的大小。因此，为了提高多糖的生物活性，可通过改变多糖的空间结构、分子量及取代基种类、数目和位置对其活性产生影响。利用多糖残基上的羟基、羧基、氨基等基团，运用化学方法对多糖的官能团进行改造修饰，已成为活性多糖研究和筛选的重要方向。
[0003]在诸多多糖衍生物中，多糖磷酸酯由于其具有良好的生物学活性而受到广泛的关注。近年来不断有文献报道通过化学方法合成多糖磷酸酯。Suzuki等对酵母甘露聚糖进行硬脂酰化和磷酸化后能有效的抗S-180和艾氏腹水癌(Chemical & pharmaceuticalbulletin, 1976, 24, 1100-1103) ;Williams 等对卢-(1_3)-D-葡聚糖进行了磷酸化后，活性大大提高(Carbohydrate Research, 1991, 219, 203-213);陈苑玉等合成的N, N-二(2-氯乙基)果糖基磷酰胺酯的抗肿瘤活性实验结果表明，其对L1210细胞和S180腹水癌有一定的抑制作用(高等学校化学学报，1993，7，963)。目前对于多糖的磷酸化中，使用磷酸化试剂主要是磷酸盐、酸酐等，直接对多糖进行衍生化，存在反应时间长，取代度普遍较低的缺点。对于分子量较大的多糖类生物高分子，由于空间位阻太大，常规方法制备的多糖磷酸酯取代度很低，往往需要重复进行反应才能得到取代度较高的产物。
瓜尔豆胶(或瓜尔胶)，编号:GB20.025,是由豆科植物瓜尔豆(Cyamposistetragonolobus)的种子去皮去胚芽后的胚乳部分,干燥粉碎后加水,进行加压水解后用20%的乙醇沉淀，离心分离后干燥粉碎而得。主要成分是分子量为5?80万的配糖键结合的半乳甘露聚糖，即由半乳糖和甘露糖(1:2)组成的高分子量水解胶体多糖类。白色至淡黄褐色粉末，能分散在水中形成粘稠液，为天然胶中粘度最高者。其水溶液为中性，粘度随PH值的变化而变化，pH值6?8粘度最高，pH1以上则迅速降低，pH6?3.5内随PH值降低。pH3.5以下粘度又增大。由于瓜尔豆胶在冷热水中聚能充分水化形成半透明溶液。主要应用在食品加工领域:1、在冷饮如冰淇淋、雪糕、冰霜、冰片中起优良稳定剂作用，防止冰晶产生，起着增稠、乳化作用；2、在面制品如面条、挂面、方便面、粉条中起到防止粘结、保水、增加筋力，保持品质的优良作用，而且延长上货架时间；3、在饮料如花生奶、杏仁奶、核桃奶、粒粒橙、果汁、果茶、各种固体饮料及八宝粥中起到增稠持水和稳定剂作用，并改善口感作用；4、在乳制品如果奶、酸奶中起到稳定剂作用，并起到增稠、乳化，改善口感的作用；5、在?制品如?腐、?奶中起到稳定作用；6、在肉制品中，如火腿肠、午餐肉、各种肉丸中起到粘结、爽口和增加体积作用；7、调味品:在调味汁和色拉调味品中，利用了瓜尔豆胶在低浓度下产生高黏度这一基本性质,使得这些产品的质构和流变等感官品质更加优质；8、罐头食品:这类产品的特征是尽可能不含流动态的水，瓜尔豆胶则可用于稠化产品中的水分，并使肉菜固体部分表面包一层稠厚的肉汁。特殊的、缓慢溶胀的瓜尔豆胶有时还可以用于限制装罐时的黏度。为了拓展瓜尔豆胶的应用，将其磷酸化得到具有生物活性的瓜尔豆胶磷酸酯具有十分重要的意义。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种瓜尔豆胶磷酸酯的制备方法；
本发明的另一目的是提供一种瓜尔豆胶磷酸酯的医药用途一作为H印G2肝癌细胞的抑制剂用于制备抗癌药物。
[0005]一、多糖磷酸酯的合成
(I)瓜尔豆胶溶液的制备:将瓜尔豆胶加入到无水甲酰胺中，于7(T80°C下搅拌12?24小时，得到均一的瓜尔豆胶溶液；瓜尔豆胶与无水甲酰胺的重量体积为0.0Γ0.05g/mL。
[0006](2)磷酸化试剂的制备:在(T5°C下，将三氯氧磷滴加到无水吡啶中(以0.5?0.8 mL/分钟的速度)，反应2?4小时，得到磷酸化试剂；三氯氧磷与无水吡啶的体积比为1:5?1:15。
[0007]为了加快反应速度，磷酸化试剂的制备中还加入催化剂4- 二甲氨基吡啶，且4- 二甲氨基吡啶与三氯氧磷的重量体积比为0.02、.05g/mL。
[0008](3)磷酸化反应:在(T5°C下将瓜尔豆胶溶液滴加到磷酸化试剂中，4(T80°C下搅拌反应15?90分钟，冷却至(T5°C，用O飞。C的碱液溶液中和至pH=7?8后，于室温、0.06、.08MPa下抽滤；滤液装入截流分子量为800(Tl2000道尔顿的透析袋中，先于流水中透析36?48小时，再于去离子中透析If 36小时；然后减缓透析袋内液体减压浓缩至原体积的l/2(Tl/40，最后加入无水乙醇进行沉淀(乙醇含量占总体积的7(Γ80%)，离心，冷冻干燥，得瓜尔豆胶磷酸酯。
[0009]瓜尔豆胶溶液与磷酸化化试剂的体积比为1:2?1:5 ;减压浓缩是在5(T60°C、
0.06?0.08Mpa下进行；离心是在3500?4500转/分钟下分离15?25分钟；冷冻干燥是在-6(T-50°C、1?5Pa的条件下冷冻干燥30?36小时。
[0010]为了加快磷酸化进程和提高磷酸酯的取代度，瓜尔豆胶的磷酸化是在功率100?500W、频率2450MHz的微波条件下进行。
[0011]二、瓜尔豆胶磷酸酯的结构性能
下面通过红外光谱图、13C NMR谱图、磷含量测定、分子量及其分布及对HepG2肝癌细胞的抑制作用对本发明合成的高取代度多糖磷酸酯的结构、性能等进行分析说明。
[0012]1、红外光谱图分析
图1为瓜尔豆胶和本发明制备的瓜尔豆胶磷酸酯的红外光谱图。图1中，瓜尔豆胶和瓜尔豆胶磷酸酯的中糖环母体吸收峰并未发生变化。在1268.9 CnT1和909.6 cnT1处出现的新的吸收峰，分别对应P=O和C-O-P的特征吸收，说明瓜尔豆胶结构中的部分-OH被磷酸根取代，已被磷酸酯化。
[0013]2、13C NMR 谱图分析
图2为瓜尔豆胶(A)和本发明制备的瓜尔豆胶磷酸酯(B)的13C NMR谱图。本发明制备的瓜尔豆胶磷酸酯主要的变化在^ 67.4和65.2 ^ 67.4处新的化学位移出现，归属为C-6取代的甘露糖单元和半乳糖单元。从δ 6(Γ70处的化学位移看，在5 60左右06的化学位移未发生变化。由此可以推断，瓜尔豆胶磷酸酯中发生了 C-6取代。
[0014]3、磷含量测定
采用电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-AES)测定磷含量，本发明中区域选择性合成的瓜尔豆胶磷酸酯的取代度为0.88^1.37，说明多糖磷酸酯已成功合成。
[0015]4、分子量分析
采用凝胶色谱-动静态光散射联用测定，本发明中区域选择性合成的瓜尔豆胶磷酸酯的重均分子量为6.08X 14 Da?8.23X 14Da,分子量分布为2.76?3.31。说明本发明中多糖磷酸酯的分子量可根据反应条件进行调节。
[0016]5、体外对H印G2肝癌细胞的抑制作用
取对数生长期的H印G-2细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，并用含15%新生牛血清的DMEM培养基制成浓度3 X 15个/mL的单细胞悬液，不断摇动细胞悬液使细胞数均匀，以0.2 ml/孔接种于96孔培养板(板边缘封无菌水，空白组加3孔不含细胞的培养基)，置CO2培养箱内在37°C、饱和湿度、5%C02条件下培养。培养24 h后细胞贴壁，换含药培养基，每孔加190μ L培养基和10 μ L样品液(空白组和对照组加10 μ I PBS液)，药物终浓度为20，50，100，200，500，1000，5000 μ g/mL，每浓度重复6孔，并设不加样品的对照组和空白调零组。置CO2培养箱内，在37°C、饱和湿度、5%C02条件下培养。样品处理48 h后，每孔加入MTT溶液20yL，37°C下继续培养4 h。小心弃去孔内上清液，并加入150 yLDMSO，振荡10 min，使紫色结晶完全溶解。用酶标仪在490 nm处测吸光值，对照组以空白组调零，并按下列公式计算抑制率，并根据不同浓度样品的抑制率计算半数抑制浓度(IC5tl):
抑制率(％) = (1-实验组平均OD值/对照组平均OD值)X 100%
对H印G2肝癌细胞的IC5tl为19.7Γ28.42mg/mL,因此，其具有显著的体外抑制H印G2细胞的作用，可作为HepG2肝癌细胞的抑制剂，用于制备抗癌药物。
[0017]综上所述，本发明与现有技术相比具有如下优点:
1、本发明通过瓜对尔豆胶磷酸化制备了具有显著的体外抑制H印G2细胞的瓜尔豆胶磷酸酯，拓展了瓜尔豆胶作为天然活性物质的应用范围；
2、本发明在磷酸化试剂的合成引入催化剂4-二甲氨基吡啶，在磷酸化过程中引入微波辅助合成技术，不仅有效缩短了反应所需时间，而且有效提高了瓜尔豆胶磷酸酯的取代度；
3、本发明制备的瓜尔豆胶磷酸酯的取代度和分子量可以通过磷酸化试剂的比例调节优化，以满足不同领域要求；
4、本发明不需要特殊设备，简单可控，成本低，适合推广应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1为瓜尔豆胶和本发明制备的瓜尔豆胶磷酸酯的红外光谱图。
[0019]图2为瓜尔豆胶(A)和本发明制备的瓜尔豆胶磷酸酯(B)的13C NMR谱图。
【具体实施方式】
[0020]下面通过具体实施例对本发明高取代度多糖磷酸酯的合成方法作进一步的说明。
[0021]实施例1
(1)瓜尔豆胶溶液的制备:称取0.5g瓜尔豆胶，加入到50mL无水甲酰胺中，在80°C下，磁力搅拌器上以1200转/分钟的转速搅拌12小时，得到均一的瓜尔豆胶溶液；
(2)磷酸化试剂的制备:将附有冷凝、搅拌和恒压漏斗装置的反应器置于5°C冰盐浴中，先将60mL吡啶加入到反应器中，再将12mL三氯氧磷用带有恒压漏斗的活塞以0.8mL/分钟加速度滴加到反应器中；之后加入4- 二甲氨基吡啶0.6g，继续反应30分钟，得到磷酸化试剂；
(3)磷酸化反应:将附有搅拌和恒压漏斗装置的反应器置于(TC冰盐浴中，先将50mL磷酸化试剂加入到反应器中，将1mL瓜尔豆胶溶液用带有恒压漏斗的活塞以2mL/分钟加速度滴加到反应器中；取出反应器放入微波反应装置中，在微波功率为500W、频率2450MHz，70°C下搅拌反应60分钟，冷却至0°C，用0°C的氢氧化钠溶液中和至pH=7，然后在室温、0.06MPa下抽滤，滤液装入截流量为800(Tl2000道尔顿的透析袋中，先于流水中透析48小时，再于去离子水透析36小时(每2小时换水一次)，然后将透析袋内液体在60°C、0.08MPa下减压浓缩至原体积的1/40 ;加入乙醇进行沉淀(乙醇含量占总体积的80%)，最后在4500转/分钟的条件下离心25分钟，固体在-60°C、IPa的条件下冷冻干燥30小时，得瓜尔豆胶磷酸酯。
[0022]该多糖磷酸酯的取代度为1.37，重均分子量为8.23 X 14Da,分子量分布为2.97。对!fepG2肝癌细胞的IC5tl为23.36mg/mL。
[0023]实施例2
(1)瓜尔豆胶溶液的制备:称取2.5g瓜尔豆胶，加入到50mL无水甲酰胺中，在75°C下，磁力搅拌器上以800转/分钟的转速搅拌24小时，得到均一的瓜尔豆胶溶液；
(2)磷酸化试剂的制备:将附有冷凝、搅拌和恒压漏斗装置的反应器置于0°C冰盐浴中，先将60mL吡啶加入到反应器中，再将4mL三氯氧磷用带有恒压漏斗的活塞以0.5mL/分钟加速度滴加到反应器中；之后加入4- 二甲氨基吡啶0.08g,继续反应30分钟，得到磷酸化试剂；
(3)磷酸化反应:将附有搅拌和恒压漏斗装置的反应器置于5°C冰盐浴中，先将50mL磷酸化试剂加入到反应器中，再将25mL瓜尔豆胶溶液用带有恒压漏斗的活塞以ImL/分钟加速度滴加到反应器中；取出反应器放入微波反应装置中，在微波功率为100W、频率2450MHz, 40°C下搅拌反应60分钟，冷却至0°C，用0°C的氢氧化钠溶液中和至pH=8，在室温、0.08MPa下抽滤，滤液装入截流量为800(Tl2000道尔顿的透析袋中，先于流水中透析36小时，再于去离子水透析48小时(每5小时换水一次)，然后将透析袋内液体在50°C、
0.06MPa下减压浓缩至原体积的1/20 ;加入乙醇进行沉淀(乙醇含量占总体积的70%)，最后在3500转/分钟的条件下离心15分钟，固体在-50°C、5Pa的条件下冷冻干燥36小时，得瓜尔豆胶磷酸酯。
[0024]该多糖磷酸酯的取代度为1.13,重均分子量为6.08 X 14Da,分子量分布为3.31。对H印G2肝癌细胞的IC5tl为19.71mg/mL。
[0025]实施例3
(1)瓜尔豆胶溶液的制备:称取Ig瓜尔豆胶，加入到50mL无水甲酰胺中，在70°C下，磁力搅拌器上以500转/分钟的转速搅拌18小时，得到均一的瓜尔豆胶溶液；
(2)磷酸化试剂的制备:将附有冷凝、搅拌和恒压漏斗装置的反应器置于2°C冰盐浴中，先将60mL吡啶加入到反应器中，再将6mL三氯氧磷用带有恒压漏斗的活塞以0.7mL/分钟加速度滴加到反应器中；之后加入4- 二甲氨基吡啶0.3g，继续反应30分钟，得到磷酸化试剂；
(3)磷酸化反应:将附有搅拌和恒压漏斗装置的反应器置于2°C冰盐浴中，先将50mL磷酸化试剂加入到反应器中，再将12.5mL瓜尔豆胶溶液用带有恒压漏斗的活塞以ImL/分钟加速度滴加到反应器中；取出反应器放入微波反应装置中，在微波功率为300W、频率2450MHz，80°C下搅拌反应15分钟，冷却至2°C，用2°C的氢氧化钠溶液中和至pH=7，室温、
0.07MPa下抽滤，滤液装入截流量为800(Γ12000道尔顿的透析袋中，先于流水中透析48小时，再于去离子水透析18小时(每3小时换水一次)，然后将透析袋内液体在55°C、0.07MPa下减压浓缩至原体积的1/30 ;加入乙醇进行沉淀(乙醇含量占总体积的80% ),最后在4000转/分钟的条件下离心15分钟，固体在-55°C、3Pa的条件下冷冻干燥36小时，得瓜尔豆胶磷酸酯。
[0026]该多糖磷酸酯的取代度为0.88,重均分子量为6.30 X 14Da,分子量分布为2.76。对H印G2肝癌细胞的IC5tl为20.77mg/mL。
[0027]实施例4
(1)瓜尔豆胶溶液的制备:称取0.5g瓜尔豆胶，加入到50mL无水甲酰胺中，在80°C下，磁力搅拌器上以1200转/分钟的转速搅拌12小时，得到均一的瓜尔豆胶溶液；
(2)磷酸化试剂的制备:将附有冷凝、搅拌和恒压漏斗装置的反应器置于5°C冰盐浴中，先将60mL吡啶加入到反应器中，将12mL三氯氧磷用带有恒压漏斗的活塞以0.SmL/分钟加速度滴加到反应器中，反应30分钟，得到磷酸化试剂；
(3)磷酸化反应:将附有搅拌和恒压漏斗装置的反应器置于0°C冰盐浴中，先将50mL磷酸化试剂加入到反应器中，再将打开盛有1mL瓜尔豆胶溶液用带有恒压漏斗的活塞以2mL/分钟加速度滴加到反应器中，70°C下搅拌反应60分钟，之后冷却至0°C，用0°C的氢氧化钠溶液中和至pH=7，室温、0.06MPa下抽滤，滤液装入截流量为8000?12000道尔顿的透析袋中，先于流水中透析48小时，再于去离子水透析36小时(每2小时换水一次)，然后将透析袋内液体在60°C、0.08MPa下减压浓缩至原体积的1/40 ;加入乙醇进行沉淀(乙醇含量占总体积的80%),最后在4500转/分钟的条件下离心25分钟,下层固体在_60°C、lPa的条件下冷冻干燥30小时，得瓜尔豆胶磷酸酯。
[0028]该多糖磷酸酯的取代度为0.54,重均分子量为7.83 X 14Da,分子量分布为3.19。对H印G2肝癌细胞的IC5tl为28.42mg/mL。
[0029]该实施例的各参数与实施例1对应，二者的区别是:实施例1在磷酸化试剂的制备中加入了催化剂4-二甲氨基吡啶，在瓜尔豆胶的磷酸化中，采用了微波辅助技术，但得到的产品的生物活性却有了显著的提高。
【权利要求】
1.高取代度瓜尔豆胶磷酸酯的合成方法，包括以下工艺步骤: (1)瓜尔豆胶溶液的制备:将瓜尔豆胶加入到无水甲酰胺中，于7(T80°C下搅拌12?24小时，得到均一的瓜尔豆胶溶液； (2)磷酸化试剂的制备:在(T5°C下，将三氯氧磷滴加到无水吡啶中，反应2?4小时，得到磷酸化试剂； (3)磷酸化反应:在(T5°C下将瓜尔豆胶溶液滴加到磷酸化试剂中，4(T80°C下搅拌反应15?90分钟，冷却至0?5°C，用0?5°C的碱液溶液中和至pH=7?8后，于室温、0.06^0.08MPa下抽滤；滤液装入截流分子量为800(Γ12000道尔顿的透析袋中，先于流水中透析36?48小时，再于去离子中透析18?36小时；然后减缓透析袋内液体减压浓缩至原体积的l/2(Tl/40，最后加入无水乙醇进行沉淀，离心，冷冻干燥，得瓜尔豆胶磷酸酯。
2.如权利要求1所述高取代度瓜尔豆胶磷酸酯的合成方法，其特征在于:步骤(1)中，瓜尔豆胶与无水甲酰胺的重量体积为0.0Γ0.05g/mL。
3.如权利要求1所述高取代度瓜尔豆胶磷酸酯的合成方法，其特征在于:步骤(2)中，三氯氧磷与无水吡啶的体积比为1:5?1:15。
4.如权利要求1所述高取代度瓜尔豆胶磷酸酯的合成方法，其特征在于:步骤(2)的，磷酸化试剂的合成中，加入催化剂4- 二甲氨基吡啶，且4- 二甲氨基吡啶与三氯氧磷的重量体积比为0.02?0.05g/mL。
5.如权利要求1所述高取代度瓜尔豆胶磷酸酯的合成方法，其特征在于:步骤(3)中，瓜尔豆胶溶液与磷酸化化试剂的体积比为1: 2?1: 5。
6.如权利要求1所述高取代度瓜尔豆胶磷酸酯的合成方法，其特征在于:步骤(3)中，磷酸化反应是在功率100?500W、频率2450MHz的微波条件下进行。
7.如权利要求1所述高取代度瓜尔豆胶磷酸酯的合成方法，其特征在于:步骤(3)中，减压浓缩是在5(T60°C、0.06?0.08Mpa下进行。
8.如权利要求1所述高取代度瓜尔豆胶磷酸酯的合成方法，其特征在于:步骤(3)中，离心是在350(Γ4500转/分钟下分离15?25分钟。
9.如权利要求1所述高取代度瓜尔豆胶磷酸酯的合成方法，其特征在于:步骤(3)中，冷冻干燥是在-6(T-50°C、1?5Pa的条件下冷冻干燥30?36小时。
10.如权利要求1所述方法合成的高取代度瓜尔豆胶磷酸酯作为HepG2肝癌细胞的抑制剂应用在抗癌药物的制备中。
【文档编号】A61K31/736GK104311683SQ201410523569
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年10月8日 优先权日:2014年10月8日
【发明者】王俊龙, 杨文 , 杨婷, 张小娜, 左媛, 姚健, 张继 申请人:西北师范大学