青钱柳在制备用于抑制肠道apoB48合成、分泌的药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及药物领域，特别是涉及青钱柳的应用领域，更为具体的说是涉及青钱柳在制备用于抑制apoB48分泌的药物中的应用。利用青钱柳叶醇提物对肠道apoB48的合成、分泌的抑制作用，达到有效地控制由长期外源性脂质过度摄入造成的高血脂症的目的。
【专利说明】青钱柳在制备用于抑制肠道apoB48合成、分泌的药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及药物领域，特别是涉及青钱柳的应用领域，更为具体的说是涉及青钱柳在制备用于抑制apoB48合成、分泌的药物中的应用。
【背景技术】
[0002]脂质代谢紊乱是指多种原因导致的一种全身血脂代谢异常的高发疾病，体内脂质代谢紊乱，血液粘稠度将会增加，血管壁上极易沉积有血脂，从而易引发动脉粥样硬化、心肌梗塞、脑中风、冠心病等疾病。
[0003]体内脂质有两个来源:一是来自食物的外源性脂质主要包括大部分甘油三酯和少部分胆固醇，经消化后由小肠吸收被利用；二是由人体自身合成的内源性脂质。随着生活水平提高，不健康饮食习惯日益加剧，导致日常摄取的食物中高脂肪、高胆固醇过多，因此外源性脂质过度吸收已成为引发脂质代谢紊乱及相关疾病的重要诱因。通过药物调控外源性脂质的吸收代谢，对防治此类疾病具有重要意义。
[0004]外源性脂质吸收和代谢是一个复杂的生理过程。由于脂质不溶或微溶于水，其吸收代谢过程中必须与一种特殊蛋白质结合形成脂蛋白，这种担负着运转脂类的蛋白质被称为载脂蛋白(Apolipoprotein, Apo)。
[0005]研究小肠来源ApoB48的表达量的改变会对小肠脂蛋白的合成，乃至肝脏脂蛋白的合成产生重要的影响。研究表明，小肠ApoB48的产量增加会使更多的肝脏被运送至肝脏，肝脏VLDL的产量也会增加。此外，Apo B48表达异常不仅导致高脂血症，而且还与动脉粥样硬化、肥胖等疾病密切相关。胰岛素抵抗状态下，CM在血中清除率降低，CM残基易沉积在血管壁；肥胖病人体内，ApoB48的水平也显著提高。因此对小肠apoB48的调节有助于改善外源性脂质的摄入，有效地控制动脉粥样硬化、肥胖、高血脂症等疾病的发生。
[0006]现在用于临床的肠道降胆固醇药物主要为胆汁酸螯合剂，近几年也研发出新的肠道降脂药物，如MTTP抑制剂和apoB表达抑制剂。通过减少胆汁酸重吸收，抑制MTTP和apoB的表达来调节体内的高脂水平和外源性脂质的过渡摄入，但是apoB表达抑制剂主要集中在apoB-100降脂剂药物的开发上，因此相关肠道apoB48的药物开发有限，不能完全地控制因脂质过多摄入而引发的高血脂症，造成病情延误。
【发明内容】
[0007]本发明针对目前相关肠道调节apoB48药物开发的局限性，公开了青钱柳在制备用于抑制apoB48合成、分泌药物中的应用。
[0008]更进一步地说，所述青钱柳为青钱柳醇提物。
[0009]通过研究，我们发现青钱柳叶醇提物能够抑制apoB48的过度分泌，特别地，是对于长期高脂饮食造成的高血脂症引起的apoB48的抑制效果。因此，我们基于这一理论分别用不同方法做了验证试验，表明青钱柳对于高脂状态下，肠道apoB48的分泌具有抑制作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1为青钱柳醇提物在高脂小鼠血清中apoB48的蛋白电泳分析图。
[0011]图2为青钱柳醇提物在高脂小鼠血清中apoB48的Elisa分析图。
【具体实施方式】
[0012]本实验实施例部分所用的材料如下:
[0013]KM小鼠(购买)，青钱柳醇提物(自制)，总胆固醇试剂盒(南京建成生物工程研究所),apoB48酶联免疫分析(Elisa)试剂盒(南京森贝伽生物科技有限公司)，山羊抗apoB抗体(Santa Cruz B1technology, Inc.),兔抗山羊辣根过氧化物酶二抗(Cell SignalingTechnology, Inc.),酶联免疫检测仪(B1Tek Corporat1n),垂直电泳槽(B1-rad),稳压稳流电泳仪(南京科宝仪器研究所)，控温离心机(Beckman Coulter), X线胶片暗匣(上海跃进医用光学器械厂)以上未提及的材料，除非特别说明，否则均为市售产品。
[0014]实施例1青钱柳醇提物的制备
[0015]青钱柳叶在提取前，去除杂质和较粗的枝干。取生药量2.5kg，采用8倍量80%的乙醇回流提取三次，每次2h，合并提取物，得浸膏466g。浸膏溶于0.5% CMC-Na中，制成悬浮液。
[0016]实施例2血清样本的制备
[0017]40只雄性KM小鼠适应性饲养I周，随机分为两组，空白组10只，给予普通饲料和普通水，余下造模组30只，给予高脂饲料6周。6周后，小鼠眼眶取血(取血前禁食12h)，3000r/min离心15min，取血清测量空腹总胆固醇(TC)水平，以TC > 3.85mmol/L(150mg/dL)为高血脂症成功模型，按TC值随机分为3组，每组10只。高脂模型组12h)，3000r/min离心15min，取血清测量空腹总胆固醇(TC)水平，以TC > 3.85mmol/L (150mg/dL)为高血脂症成功模型，按TC值随机分为3组，每组10只。高脂模型组(HC)，青钱柳醇提物低剂量组(EEL，2g/kg)，醇提取物中剂量组(EEM，4g/kg)，醇提取物高剂量组(EHl，8g/kg)。各组给予CMC-Na悬浮液，空白组和高脂模型组给予等体积0.5% CMC-Na。灌胃给药4周。
[0018]4周后小鼠禁食过夜，用10%水合氯醛(0.3mL/100g)麻醉，眼眶取全血，3000r/min,离心 15min 得血清。取 200 μ L 血清，加 4mI KBr 溶液(density = 1.006g/ml)，60，000Xg, 15°C离心3h。离心得样品上层液。
[0019]实施例3样品apoB48含量的测定
[0020]实施例3.1蛋白质印迹法测定apoB48含量
[0021]实施例3.1.1 SDS-PAGE凝胶电泳工作液配制
[0022]A液(丙烯酰胺储存液，10mL):29.2g丙烯酰胺，0.8g双丙烯酰胺，置通风橱操作，加双蒸水至10mL,缓慢搅拌直至丙烯酰胺粉末完全溶解，并以石蜡封口，4°C储存。
[0023]B液(4X 分离胶缓冲液，10mL):75mL 2M Tris-HCl (PH 8.8)，4mL 10% SDS，21mL双蒸水，4 °C储存。
[0024]C液(4X 堆积胶缓冲液，10mL):50mL IM Tris-HCl (PH 6.8), 4mL 10% SDS,46mL
双蒸水，密闭，4°C储存。
[0025]电泳缓冲液(IL):3g Tris-base，14.4g甘氨酸，Ig SDS，加双蒸水至 1L，PH 8.3左右，室温保存。
[0026]5Χ 样品缓冲液(1mL):0.6mL IM Tris-HCl (PH6.8), 5mL 50% 的甘油，2mL 10%SDS, 0.5mL 2-巯基乙醇，ImL I %溴酚蓝，0.9mL的双蒸水，可在4°C储存数周。
[0027]实施例3.L 2电泳
[0028]制备10%聚丙烯酰胺分离胶:A液3.96mL, B液3mL，双蒸水5.04mL, 10%过硫酸胺60 μ L，TEMED 6 μ L，总量12mL ;制备聚丙烯酰胺堆积胶:A液3.45mL, C液1.5mL,双蒸水3.45mL, 10%过硫酸胺45 μ L，TEMED7.5 μ L，总量6mL ;将分离胶注入垂直电泳槽的玻璃平板夹层中，至凝胶距玻璃板上边缘约Icm为止，缓缓加入双蒸水至顶部，37°C聚合0.5h ;吸尽覆盖在分离胶上的双蒸水，加入堆积胶至夹层顶部，缓慢倾斜插入梳子，37°C聚合15min ；凝胶聚合后，小心拔出梳子；凝胶板放入电泳槽内，将电泳缓冲液加入内外电泳槽中，使凝胶上下端均能浸泡在电泳液中，使用B1-Rad微型凝胶系统；待测样品(蛋白含量50 μ g)加1/4样本体积的5X样品缓冲液混匀，并于沸水中煮lOmin，冷却后4°C、3000rpm离心lmin,加入加样孔中，对照孔加入预染蛋白Marker (12kDa-170kDa);接通电源,恒压电泳分离蛋白质(90V恒压1.5h);关闭电源，取下凝胶，去除堆积胶，置于转移液中为后续步骤备用。
[0029]实施例3.1.3转膜
[0030]转移缓冲液的配制:3.03g Tris-HCl，14.4g甘氨酸，200mL甲醇(20% )加双蒸水至1L，室温保存；滤纸，胶均置于转移缓冲液中平衡，PVDF膜先用甲醇预处理5min后，移入转移缓冲液中进行平衡；转移夹层由下到上为:3层滤纸、PVDF膜、胶、3层滤纸。注意夹层中不能有气泡；按3-4mA/cm2XPVDF膜面积计算电流大小，恒流转膜45min ;关闭电源，取出转印膜，少量TBST漂洗后，进行蛋白质免疫检测。
[0031]实施例3.1.4蛋白质免疫检测
[0032]将转印膜放入封闭液(含5%脱脂奶粉的TBST溶液或3% BSA的TBST溶液)室温封闭2h或者4°C过夜；取出转印膜放入TBST稀释的一抗(I: 800)中，4°C放置过夜；取出转印膜；TBST洗膜，1min/次，洗涤4次；将洗涤后的转印膜放入TBST稀释的二抗(I: 10000)中，37°C放置Ih;取出转印膜，TBST洗膜，1min/次，洗涤3次。
[0033]实施例3.1.5显影、压片、图像分析
[0034]膜正面覆盖ECL Plus发光试剂(A液和B液等体积混合)，去尽残液，包好，放入X光片夹中，暗处反应30s ;于暗室中对胶片进行显影和定影。将胶片进行拍照，并用图象处理系统(Image-Pro Plus 6.0)分析目标条带的光密度值。
[0035]蛋白印记结果表明HC组血清中总apoB48的含量中较NC组显著升高，而不同剂量青钱柳醇提物能够显著地降低apoB48的表达(P < 0.01)。光密度值定量印证此结果，即HC组apoB48含量比NC组增加了 2倍，而较HC组，给药组有效地抑制apoB48的分泌。
[0036]实施例3.2酶联免疫分析apoB48的含量
[0037]实施例3.2.1测定步骤
[0038]标准品的稀释与加样:在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品ΙΟΟμ 1，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μ 1，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取10ul分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释50μ 1，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50 μ I弃掉，再各取50 μ I分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50 μ 1，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μ I分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μ1，混匀后从第七、第八孔中分别取50 μ I加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50 μ 1，混匀后从第九第十孔中各取50 μ I弃掉。(稀释后各孔加样量都为50 μ 1，浓度分别为12 μ g/ml,8 μ g/ml,4 μ g/ml,2 μ g/ml,I μ g/ml)。
[0039]加样:分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40 μ 1，然后再加待测样品10 μ I (样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。温育:用封板膜封板后置37°C温育30分钟。配液:将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。洗涤:小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。加酶:每孔加入酶标试剂50 μ 1，空白孔除外。温育:操作同上。洗涤:操作同上。显色:每孔先加入显色剂Α50μ 1，再加入显色剂Β50μ 1，轻轻震荡混匀，37°C避光显色15分钟。终止:每孔加终止液50 μ 1，终止反应(此时蓝色立转黄色)。测定:以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(0D值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。
[0040]实施例3.2.2计算apoB48的浓度
[0041]以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
[0042]酶联免疫分析结果表明，HC组血清总apoB48的量较NC组增加了 I倍，而青钱柳醇提物剂量依赖性地抑制apoB48的表达量，且中低剂量青钱柳醇提物能够显著地降低apoB48 的量(P < 0.01)。
【权利要求】
1.青钱柳在制备用于抑制肠道apoB48合成、分泌的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征是:所述青钱柳为青钱柳醇提取物。
【文档编号】A61K36/52GK104274513SQ201410524882
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2014年9月30日 优先权日:2014年9月30日
【发明者】张健, 蒋翠花, 高萌, 殷志琦, 姚楠, 李玥, 马永兰, 林孜 申请人:江苏省中医药研究院