靶向硼制剂及其制备方法
【专利摘要】本发明属于生物医药领域，公开了一种靶向硼制剂及其制备方法与应用。本发明所述靶向硼制剂由聚酰胺一胺树枝状大分子、表皮生长因子受体抗体和多面体硼烷组成，所述聚酰胺一胺树枝状大分子上连接所述表皮生长因子受体抗体，内部负载所述多面体硼烷。本发明所述靶向硼制剂含硼量高，能够满足BNCT对硼原子剂量的要求，对肿瘤细胞靶向性好，同时稳定性好、细胞毒性低，能够被表面高表达EGFR的人胶质瘤U87MG细胞有效摄取。本发明所述靶向硼制剂能够有效提高原位移植瘤裸鼠肿瘤组织内硼的含量，经中子照射后明显延长原位移植瘤裸鼠生存期，适用于硼中子俘获疗法治疗脑胶质瘤。本发明所述制备方法操作简单，制备得到的靶向硼制剂稳定性好。
【专利说明】靶向硼制剂及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域，具体涉及负载多面体硼烷的表皮生长因子抗体耦联树 枝状大分子靶向给药系统及其制备方法，适用于硼中子俘获疗法治疗脑胶质瘤。
【背景技术】
[0002] 脑胶质瘤约占颅内原发肿瘤的45%，是最常见的颅内原发恶性肿瘤。其特点表现 为肿瘤呈浸润性生长，肿瘤边界不清，手术难以彻底切除且术后易复发。目前认为手术结合 术后放化疗的综合治疗是治疗胶质瘤的最佳方案。放疗因此成为脑胶质瘤综合治疗的重要 环节之一。
[0003] 硼中子俘获疗法（boronneutroncapturetherapy,BNCT)是一种理论上可以选 择性杀伤已经扩散到正常组织中的肿瘤细胞的治疗方法。当硼（boron-10,kiB)受到低能量 中子照射时，即发生核反应，产生具有高线性能量转换的α粒子，杀伤反应的范围在一个 细胞内（5_9μπι)，其本身衰变为锂元素。BNCT治疗脑胶质瘤临床试验在美国、日本、芬兰、 荷兰、瑞典等国家相继开展，多数试验结果认为BNCT治疗胶质瘤患者平均生存期和5年生 存率优于传统的放射治疗。
[0004] BNCT要取得疗效需要特殊的设备-产生中子源的反应堆，鉴于BNCT治疗脑胶质 瘤的安全性及临床效果都得到了肯定，我国于2005年在中国工程院周永茂及王忠诚院士 的积极支持下，北京凯佰特科技有限公司建造了我国第一台也是世界首台医院中子照射器 (In-HospitalNeutronIrradiator，ΙΗΝΙ-1)。该设备于 2008 年经鉴定后正式运转，2010 年获批准试运行，2012年获得国家核工业部科技进步一等奖（2012HNJ01D-01)。该设备具 有经济、安全、有效、体积小和操作方便的特点，动物试验已基本完成，即将进行临床试验。
[0005] BNCT要取得疗效，除了有效的中子发射源之外，关键问题之一是肿瘤细胞内必须 含有足量的kiB原子，且肿瘤中kiB原子的浓度与周围正常组织和血液中浓度的比值大于3 : 1。目前研究显示，向肿瘤细胞运送足量的kiB原子而尽量减少正常组织的硼含量仍存在问 题。临床试验中允许使用的有两种含kiB的化合物，即二羟苯丙氨酸硼（BPA)和多面体硼烷 (BSH)，但效果均不理想。因此合成可增加肿瘤吸收比例的含硼制剂，对运用硼中子俘获疗 法治疗脑胶质瘤具有重要意义。
【发明内容】
[0006] 本发明针对目前应用于BNCT临床试验的硼原子携带剂在肿瘤组织富集量较低、 靶向性差的缺点，提供一种含硼量高的靶向硼制剂。
[0007] 为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
[0008] -种靶向硼制剂，由聚酰胺一胺树枝状大分子、表皮生长因子受体的抗体和多面 体硼烷组成，所述聚酰胺一胺树枝状大分子上连接所述表皮生长因子受体的抗体，内部负 载所述多面体硼烷。
[0009] 本发明的另一个目的是提供所述靶向硼制剂的制备方法。
[0010] 一种靶向硼制剂的制备方法，通过3- (2-吡啶二巯基）丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯 和十一酸马来酰亚胺-酰肼-三氟乙酸盐将聚酰胺一胺树状大分子和表皮生长因子抗体相 连接后形成功能化树状大分子，然后负载多面体硼烷得到所述靶向硼制剂。
[0011] 在一些实施方案中，所述的制备方法，具体包括以下步骤：
[0012] (1)表皮生长因子受体抗体与高碘酸钠反应，得到氧化的表皮生长因子受体抗 体；
[0013] (2)聚酰胺一胺树枝状大分子与3-(2-吡啶二巯基）丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯反 应，得到中间体PAMAM-SPDP;
[0014] (3)步骤（2)反应得到的中间体PAMAM-SPDP与DTT反应得到PAMAM-SH;
[0015] (4)步骤（3)反应得到的PAMAM-SH与i^一酸马来酰亚胺-酰肼-三氟乙酸盐反应 得到PAMAM-KMUH;
[0016] (5)步骤⑷反应得到的PAMAM-KMUH与步骤（1)中得到的氧化的mAbEGFR偶联得 到PAMAMiAbEGFR;
[0017] (6)向步骤（5)反应得到的PAMAM-mAbEGFR中加入多面体硼烷BSH，得到所述靶向 硼制剂。
[0018] 在一些实施方案中，所述的制备方法步骤（1)中所述的表皮生长因子受体抗体与 高碘酸钠摩尔比为1 :10。
[0019] 在一些实施方案中，所述的制备方法步骤（2)中所述的聚酰胺一胺树枝状大分子 与3-(2-吡啶二巯基）丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯的摩尔比为1 :10。
[0020] 在一些实施方案中，所述的制备方法步骤（3)中所述的PAMAM-SPDP与DTT的摩尔 比为1 :1〇。
[0021] 在一些实施方案中，所述的制备方法步骤（4)中所述的PAMM-SH与^^一酸马来酰 亚胺-酰肼-三氟乙酸盐的摩尔比为1 :1〇。
[0022] 在一些实施方案中，所述的制备方法步骤（5)中所述的PAMAM-KMUH与氧化的表皮 生长因子受体抗体的摩尔比为10 :1。
[0023] 在一些实施方案中，所述的制备方法步骤（6)中所述的PAMAM-mAbEGFR与多面体 硼烧的质量比为2 :1。
[0024] 本发明的另一个目的是提供所述靶向硼制剂在制备硼中子俘获疗法的药物中的 应用。
[0025] 与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果之一：
[0026] (1)本发明所述靶向硼制剂将大剂量的多面体硼烷（BSH)负载于树枝状大分子空 腔内，明显提高了硼原子的给药量，具有包封率高和载药量高的优点，能够满足BNCT对硼 原子剂量的要求。
[0027] (2)本发明所述靶向硼制剂连接有肿瘤细胞表面高表达的表皮生长因子受体的抗 体（mAbEGFR)，对肿瘤细胞有较好的靶向性，增加肿瘤组织与正常脑组织摄取硼的差异，减 小中子照射时各种有意义射线对正常脑组织的损伤，同时稳定性好、细胞毒性低。
[0028] (3)本发明所述靶向硼制剂能够被表面高表达表皮生长因子受体的人胶质瘤 U87MG细胞有效摄取。
[0029] (4)本发明所述靶向硼制剂能够有效提高原位移植瘤裸鼠肿瘤组织内硼的含量， 经中子照射后明显延长原位移植瘤裸鼠生存期。
【专利附图】
【附图说明】
[0030] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0031] 图1为实施例1制备的PAMAMiAbEGFR的SDS-PAGE鉴定结果；
[0032] 图2为实施例3不同浓度的PAMAM-mAbEGFR/BSH对U87MG细胞不同时间增殖率的 影响的结果图；其中，为为 〇· 01l·1mol/L、0 为 0· 1μmol/L、B为 1μmol/L、O为 5μmol/ L、□为 10μmol/L;
[0033] 图3为实施例4荧光显微镜观察U87MG细胞对PAMAM-mAbEGFR-FITC/BSH的内吞 情况图，其中（a)为细胞内吞的荧光照片，（b)为同一视野下光镜照片；
[0034] 图4为实施例6原位移植瘤裸鼠经BNCT后的Kaplan-Meier生存曲线；其中对照 组未经任何照射，X线5Gy为经5GyX线照射组，INHI-14MV组为仅经4MVINHI-I照射组， BSH4MV组为注射BSH后经4MVINHI-I照射组，PAB4MV组为注射PAMAM-mAbEGFR/BSH后 经4MVINHI-I照射组，X线IOGy为经IOGyX线照射组，INHI-18MV组为仅经8MVINHI-I 照射组，BSH8MV组为注射BSH后经8MVINHI-I照射组，PAB8MV组为注射PAMAM-mAbEGFR/ BSH后经8MVINHI-I照射组；
[0035] 图5为本发明制备PAMAM-mAbEGFR/BSH的路线图。
【具体实施方式】
[0036] 下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述， 显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的 实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都 属于本发明保护的范围。
[0037] 本发明针对肿瘤细胞对目前临床试验中允许使用的两种kiB制剂吸收的特异性均 不强的缺点，提供了一种肿瘤特异性的靶向硼制剂。所述靶向硼制剂为一种负载BSH的耦 连EGFR抗体的树枝状大分子（PAMAM-mAbEGFR/BSH)。
[0038] 为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
[0039] -种靶向硼制剂，由聚酰胺一胺树枝状大分子、表皮生长因子受体的抗体和多面 体硼烷组成，所述聚酰胺一胺树枝状大分子上连接所述表皮生长因子受体的抗体，内部负 载所述多面体硼烷。
[0040] 其中，多面体硼烷（BSH)分子式为Na2B12H11SH,含有硼原子数远多于含有1个硼原 子的二羟苯丙氨酸硼（BPA)，本发明所述靶向硼制剂选用BSH作为负载硼制剂，提高肿瘤细 胞吸收硼原子的剂量。
[0041] 聚酰胺一胺树状大分子（PAMAMdendrimer)是一类具有三维结构的高分子，与传 统的线性聚合物在结构上有着很大的区别，它由引发核、内层重复单元和外层端基组成，具 有高度的几何对称性、精确的分子结构、大量的表面官能团和内部空腔。聚酰胺一胺树状大 分子内部含有大量空间，且能有效与进入空腔内的小分子复合成紧密的粒子，在细胞内化 过程中，缓冲内涵体一溶酶体的酸性环境，帮助包裹的小分子与树形分子迅速解离。经修饰 的PAMM毒性降低，转染效率增高。本发明所述靶向硼制剂采用PAMM作为BSH的载药分 子，提高BSH的负载量及细胞内吞后的迅速释放。
[0042] BNCT成功的关键是运送足量的wB原子到肿瘤细胞，而尽量减少正常组织的wB含 量，所以应用靶向治疗携带kiB原子到肿瘤细胞是一个理想的治疗方法。表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)是一种广泛分布于人体组织细胞膜上的多功 能糖蛋白，EGFR存在于大多数细胞中，在40%的胶质母细胞瘤中呈高表达，在不同级别胶 质瘤组织中，EGFR的表达随肿瘤恶性级别的增高而增高，而正常人脑组织中未见EGFR明显 表达，本发明在所述聚酰胺一胺树枝状大分子上连接所述表皮生长因子受体的抗体，使得 本发明所述靶向硼制剂对EGFR阳性的细胞具有靶向性，进而提高胶质瘤细胞对本发明所 述靶向硼制剂的吸收，从而实现硼中子俘获疗法。
[0043] 本发明所述靶向硼制剂能够靶向性提高肿瘤细胞对kiB原子的摄取剂量，增加肿 瘤细胞与周围正常组织kiB摄取量的差异，为BNCT提供合适的硼原子携带剂。
[0044] 在一些优选实施方案中，本发明所述靶向硼制剂中所述表皮生长因子受体的抗体 为表皮生长因子受体的单克隆抗体。
[0045] 本发明还提供了所述靶向硼制剂的制备方法。
[0046] 一种靶向硼制剂的制备方法，通过3- (2-吡啶二巯基）丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯 和十一酸马来酰亚胺-酰肼-三氟乙酸盐将聚酰胺一胺树状大分子和表皮生长因子抗体相 连接后形成功能化树状大分子，然后负载多面体硼烷得到所述靶向硼制剂。
[0047] 3-(2-吡啶二巯基）丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯（STOP)，分子式SC12H12N2O4S2，为一 个短链交联剂，其通过羟基琥珀酰亚胺酯活性基团连接PAMAM分子上的氨基（-NH2)。十一酸 马来酰亚胺-酰肼-三氟乙酸盐（KMUH)分子式为C15H25N3O3 ·CF3CO2H,为一个长链交联剂， 其通过马来酰亚胺与PAMAM-SH分子上的巯基（-SH)反应。本发明所述制备方法通过SPDP 和KMUH将表皮生长因子抗体和聚酰胺-胺树状大分子（PAMM)相连接后形成功能化树状 大分子，对多面体硼烷（BSH)具有高负载量和稳定性，在获得良好生物相容性的同时，增加 肿瘤细胞对BSH的吸收剂量。
[0048] 另一方面树状大分子必须依靠较大的尺寸才能体现出肿瘤细胞的增强渗透滞留 效应（EPR效应）以及避免被过早的代谢。尽管高代数的树状大分子拥有较大的尺寸，但随 之而来的却是更高的系统毒性。本发明所述制备方法SPDP和KMUH连接链段的引入可以帮 助直径小于9nm的PAMMG6. 0以下较低代数的树状大分子在不提高代数的前提下获得较 大的纳米尺寸，提高整个体系的生物安全性。
[0049] 在一些实施方案中，本发明所述靶向硼制剂的制备方法具体包括以下步骤：
[0050] (1)表皮生长因子受体抗体与高碘酸钠反应，得到氧化的表皮生长因子受体抗 体；
[0051] (2)聚酰胺一胺树枝状大分子与3-(2-吡啶二巯基）丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯反 应，得到中间体PAMAM-SPDP;
[0052] (3)步骤⑵反应得到的中间体PAMAM-SPDP与DTT反应得到PAMAM-SH;
[0053] (4)步骤（3)反应得到的PAMAM-SH与i^一酸马来酰亚胺-酰肼-三氟乙酸盐反应 得到PAMAM-KMUH;
[0054] (5)步骤⑷反应得到的PAMAM-KMUH与步骤（1)中得到的氧化的mAbEGFR偶联得 到 PAMAM-mAbEGFR ;
[0055] (6)向步骤（5)反应得到的PAMAM-mAbEGFR中加入多面体硼烷BSH，得到所述靶向 硼制剂。
[0056] 其中，本发明所述靶向硼制剂的制备方法步骤（1)所述表皮生长因子受体抗体 mAbEGFR与高碘酸钠（NaKM)反应，得到氧化的表皮生长因子受体抗体，使表皮生长因子受 体抗体形成羰基（C = 0)官能团。
[0057] 在一些优选实施方案中，所述mAbEGFR与NaKM反应为mAbEGFR与NaKM在pH为 4. 5的0.IM醋酸盐缓冲液中混合，室温反应2h，反应混合物脱盐，用pH7. 5的50mM磷酸盐 缓冲液洗脱，得到氧化的表皮生长因子受体抗体。
[0058] 进一步的，步骤（1)中所述的mAbEGFR与NaKM摩尔比优选为1 :10。
[0059] 在一些优选实施方案中，本发明所述靶向硼制剂中所述表皮生长因子受体的抗体 为表皮生长因子受体的单克隆抗体。
[0060] 本发明所述靶向硼制剂的制备方法步骤（2)中聚酰胺一胺树枝状大分子（PAMM) 与3-(2-吡啶二巯基）丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯（STOP)反应，
[0061] SPDP的羟基琥珀酰亚胺酯活性基团与PAMAM分子上的氨基（-NH2)连接得到中间 体PAMAM-SPDP。
[0062] 在一些优选实施方案中，所述步骤（2)中PAMAM与SPDP反应为PAMAM与SPDP在 pH7. 5的0.IM磷酸盐缓冲液中混合，室温反应2h，反应混合物脱盐，用pH7. 5的50mM磷酸 盐缓冲液洗脱，得到中间体PAMAM-SPDP。
[0063] 进一步的，步骤（2)中所述PAMAM与SPDP的摩尔比优选为1 :10。
[0064] 优选的，本发明所述聚酰胺一胺树枝状大分子为5. 0代溶液，其分子量为28824， 分子末端为氨基（-NH2)。
[0065] 本发明所述靶向硼制剂的制备方法步骤（3)PAMAM-SPDP与DTT反应，DTT还原 SPDP分子上的吡啶二硫基，形成巯基（-SH)，得到PAMAM-SH。
[0066] 在一些优选实施方案中，所述步骤（3)中PAMAM-SPDP与DTT反应为DTT溶液与 PAMAM-SPDP室温反应30min，反应混合物脱盐，用pH7. 5的50mM磷酸盐缓冲液洗脱，得到 PAMAM-SH；
[0067] 进一步的，步骤（3)中所述的PAMAM-SPDP与DTT的摩尔比优选为1 :10。
[0068] 其中，所述DTT溶液的配置方法为DTT(购于Sigma公司）溶于为pH7. 5的0·IM 磷酸盐缓冲液中，加入10v/v%二甲基亚砜（DMSO)。
[0069] 优选的，步骤（3)中所述pH 7. 5的50mM磷酸盐缓冲液中含10v/v% DMS0。
[0070] 本发明所述靶向硼制剂的制备方法步骤（4)PAMAM-SH与i^一酸马来酰亚胺-酰 肼-三氟乙酸盐（KMUH)反应，KMUH中的马来酰亚胺与PAMAM-SH分子上的巯基（-SH)连接 得到PAMAM-KMUH。
[0071] 在一些优选实施方案中，所述步骤（4)中PAMM-SH与KMUH反应为将步骤（3)反应 得到的PAMAM-SH与KMUH在DMSO中混合，室温反应2h，反应混合物脱盐，用pH7. 5的50mM 磷酸盐缓冲液洗脱，得到PAMAM-KMUH。
[0072] 进一步的，步骤（4)中所述的PAMAM-SH与KMUH的摩尔比优选为1 :10。
[0073] 优选的，步骤（4)中所述pH7. 5的50mM磷酸盐缓冲液中含10v/v%DMS0。
[0074] 本发明所述靶向硼制剂的制备方法步骤（5)PAMAM-KMUH与步骤（1)中得到的氧 化的mAbEGFR偶联，PAMAM-KMUH上的酰肼与氧化的mAbEGFR上的羰基（C= 0)反应得到 PAMAMiAbEGFR;
[0075] 在一些优选实施方案中，所述步骤（5)中所述PAMAM-KMUH与氧化的mAbEGFR偶联 为PAMAM-KMUH与氧化的mAbEGFR混合，室温反应24h，得到的偶联物PAMAM-mAbEGFR。
[0076] 其中，步骤（5)中所述的PAMAM-KMUH与氧化的mAbEGFR的摩尔比优选为10:1。
[0077] 进一步的，所述步骤（5)还包括对得到的PAMAM-mAbEGFR进行浓缩纯化的步骤。
[0078] 在一些优选实施方案中，所述浓缩纯化为通过超滤浓缩到I 再使用层析 色谱法纯化，用pH7. 5的50mM磷酸盐缓冲液洗脱，得到PAMAM-mAbEGFR。
[0079] 优选的，所述层析色谱法纯化为Sephacryl S-300层析色谱柱纯化。
[0080] 优选的，所述浓缩纯化中所述pH7. 5的50mM磷酸盐缓冲液中含lOv/v%DMS0。
[0081] 本发明所述靶向硼制剂的制备方法步骤（6)向PAMAM-mAbEGFR中加入多面体硼烷 (BSH)，负载wB原子得到靶向硼制剂。
[0082] 在一些优选实施方案中，所述步骤（6)中所述向PAMAM-mAbEGFR中加入BSH为 PAMAM-mAbEGFR载体溶液置于烧杯中，向其中逐步加入BSH，直至BSH不再溶解为止，放入 25°C恒温摇床中震荡24小时，得到负载BSH的PAMAM-mAbEGFR载体（PAMAM-mAbEGFR/BSH) 的饱和溶液，饱和溶液过膜处理，收集滤液即得靶向硼制剂。
[0083] 其中，步骤（6)中所述的PAMAM-mAbEGFR与BSH的质量比优选为2:1。
[0084] 优选的，所述过膜为过0. 22 μ m的膜。
[0085] 进一步的，作为优选，本发明所述靶向硼制剂的制备方法中步骤（1)、（2)、（3)和 (4)中所述的反应混合物脱盐均使用SephadexG25层析色谱柱，以去除未反应的小分子物 质。
[0086] 本发明采用SDS-PAGE凝胶电泳、MTT、荧光显微镜、中子照射后的抑瘤效应等方法 测试本发明制备的负载的多面体硼烷的耦联表皮生长因子受体单克隆抗体的树枝状大分 子，具体测试结果如下：
[0087] (I) SDS-PAGE凝胶电泳鉴定：
[0088] SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定结果显示mAbEGFR单体（分子量85KD左右）的条 带对应的分子量约在85KD左右，合成后的PAMAM-mAbEGFR条带的分子量约在115KD左右， 且在85KD左右无可见条带，表明经层析纯化后的PAMAM-mAbEGFR溶液中不含有未结合的 mAbEGFR。
[0089] (2) BSH 在 PAMAM-mAbEGFR/BSH 中承载剂量的确定：
[0090] 绘制硼标准品曲线，将PAMAM-mAbEGFR/BSH滤液稀释到一定浓度，用感应耦合等 离子体原子发射光谱仪（ICP-AES)检测样品硼的含量。载体中BSH的浓度根据载药前后 BSH的差值来计算，得出负载在PAMAM-mAbEGFR上的BSH为280mg/g。
[0091] (3)细胞毒性考察：
[0092] 将不同浓度的合成材料PAMAM-mAbEGFR/BSH与细胞共同孵育不同时间，通过MTT 试验检测增殖细胞活性，结果显示负载BSH的靶向EGFR树枝状大分子对细胞增殖率没有明 显的影响，各组间无显著差异（P>〇. 05)，说明该合成材料有良好的生物相容性，没有明显的 毒性。
[0093] (4)生物活性检测：
[0094] 将带有绿色荧光的EGFR单克隆抗体mAbEGFR-FITC代替制备步骤（1)中的 mAbEGFR，使得制备所得负载BSH的靶向EGFR的树枝状大分子PAMAM-mAbEGFR-FITC/ BSH带有绿色荧光。选用EGFR表达阳性的U87MG细胞作为靶细胞，通过荧光显微镜观 察细胞对PAMAM-mAbEGFR-FITC/BSH的内吞情况。结果显示PAMAM-mAbEGFR-FITC/BSH 在1μM时已有90 %以上U87MG细胞出现绿色荧光，且强度较高，说明此时已摄取大量 PAMAM-mAbEGFR-FITC/BSH。
[0095] (5)稳定性测试
[0096] 将制备的PAMAM-mAbEGFR/BSH溶液放置-20°C环境，分别于1，3，6个月取样，观察 溶液性状，同时进行BSH承载量和生物活性检测。结果显示PAMAM-mAbEGFR放置不同时间 BSH的承载量和合成物的生物活性没有没有明显的改变。
[0097] (6)原位移植瘤模型裸鼠体内硼C°B)生物分布检测：
[0098] 建立裸鼠原位移植瘤模型，采用静脉注射和对流增强传送两种方式向肿瘤细胞输 送PAMAM-mAbEGFR/BSH，剂量相当于BSH100mg/kg体重，裸鼠分批于注射后6h、12h、24h、 36h和48h收集血液后处死，分离肿瘤组织、正常脑组织、肝脏和肾脏，采用ICP-AES检测样 本中含wB的浓度。结果显示高分子PAMAM-mAbEGFR/BSH经静脉注射无法到达脑组织和脑 肿瘤组织，对流增强传送方式给药能够被肿瘤组织大量吸收。24h时PAMAM-mAbEGFR/BSH在 肿瘤组织内已经明显扩散，且硼含量符合BNCT要求，此时适合中子照射。
[0099] (7)BNCT的原位移植瘤裸鼠抑瘤效应检测：
[0100] 测试分为对照组（未照射）、X线照射组、INHI-I组（仅用中子照射）、BSH组和 PAMAM-mAbEGFR/BSH组。体外培养EGFR阳性胶质瘤细胞种植后出现明显的颅内移植瘤症 状时用于BNCT实验。BSH在静脉注射后3h进行中子照射是目前BNCT研究最常用的方式， 此时肿瘤硼浓度较高，且肿瘤与正常脑组织及肿瘤与血液硼浓度比值适合BNCT治疗。其 中BSH组裸鼠于静脉注射后3h进行中子照射，PAMAM-mAbEGFR/BSH组裸鼠于对流增强传送 注射后24h进行中子照射，照射时间点硼浓度使用ICP-AES检测，结果显示两组硼浓度有明 显差异（P〈〇. 01)。BSH组肿瘤浓度为8. 65± 1.32μg/g，肿瘤与正常脑组织硼浓度比值为 2. 65,肿瘤与血液硼浓度比值为2. 02 ;PAMAM-mAbEGFR/BSH组肿瘤浓度为30. 54±0. 82μg/ g，肿瘤与正常脑组织硼浓度比值为11. 70,肿瘤与血液硼浓度比值为大于30。所有照射均 使用INHI-I在裸鼠麻醉后进行，照射时使用富含锂的照射盒遮挡中子射线，仅将肿瘤部位 暴露于照射盒的孔道处接受中子照射。INHI-I最大功率30KW，最大热中子通量为1Χ109η/ (cm*s)，照射分为4MV-min和8MV-min。从照射之日算起，计算移植瘤裸鼠生存时间。采用 中位生存期（mediansurvivaltime，MeST)、平均生存时间（meansurvivaltime，MST)、 Kaplan-Meier生存曲线作为评价指标，可见给于PAMAM-mAbEGFR/BSH后进行BNCT明显提高 了颅内移植瘤裸鼠的生存时间，与对照组比较（P〈〇. 01)、INHI-1组比较（P〈0. 01)、同剂量X 线组比较（P〈〇. 05)、BSH组比较（P〈0. 05)均有显著差异。
[0101] 本发明所述靶向硼制剂能够被表面高表达表皮生长因子受体的人胶质瘤细胞有 效摄取，并且能够有效提高原位移植瘤裸鼠肿瘤组织内硼的含量，用于肿瘤的硼中子俘获 疗法。因此本发明还提供了所述靶向硼制剂在制备硼中子俘获疗法的药物中的应用。
[0102] 本发明至少具有以下有益效果之一：
[0103] (1)本发明所述靶向硼制剂将大剂量的多面体硼烷（BSH)负载于树枝状大分子空 腔内，明显提高了硼原子的给药量，具有包封率高和载药量高的优点，能够满足BNCT对硼 原子剂量的要求。
[0104] ⑵本发明所述靶向硼制剂连接有肿瘤细胞表面高表达的表皮生长因子受体的抗 体（mAbEGFR)，对肿瘤细胞有较好的的靶向性，增加肿瘤组织与正常脑组织摄取硼的差异， 减小中子照射时各种有意义射线对正常脑组织的损伤，同时稳定性好、细胞毒性低。
[0105] (3)本发明所述靶向硼制剂能够被表面高表达表皮生长因子受体的人胶质瘤 U87MG细胞有效摄取。
[0106] (4)本发明所述靶向硼制剂能够有效提高原位移植瘤裸鼠肿瘤组织内硼的含量， 经中子照射后明显延长原位移植瘤裸鼠生存期。
[0107] 为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的方法进行详细说明。其 中实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第 三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年）中所述的条件，或按照制造厂 商所建议的条件。所述SPDP和KMUH购于Pierce公司，PAMAM和DTT购于Sigma公司。
[0108]实施例 I :PAMAM-mAbEGFR/BSH 的制备
[0109] (1)表皮生长因子受体单克隆抗体mAbEGFR 0· Img与高碘酸钠2mg在pH为4. 5的 0. IM醋酸盐缓冲液Iml中混合，使用磁珠在室温不停搅拌2h，反应混合物经S印hadexG25 层析色谱柱脱盐，去除过量的高碘酸钠，用pH 7. 5的50mM磷酸盐缓冲液洗脱，收集得到的 氧化的表皮生长因子受体单克隆抗体；
[0110] (2)5%聚酰胺一胺树枝状大分子（PAMM)溶液（Sigma公司）0. 58ml，其中含有 PAMAM 29mg，与3. 12mg SPDP在pH为7. 5的0· IM磷酸盐缓冲液Iml中混合，室温反应2h， 反应混合物经S印hadexG25层析色谱柱脱盐，去除未反应的SPDP，用pH 7. 5的50mM磷酸 盐缓冲液洗脱，得到中间体PAMAM-SPDP ;
[0111] (3)1.54mg DTT溶于pH 7. 5的0. IM磷酸盐缓冲液Iml中，加入0. lgDMSO,配成含 10% DMSO的DTT溶液。配置的DTT溶液与步骤（2)反应得到的PAMAM-SPDP混合，室温反 应30min。反应混合物经SephadexG25层析色谱柱脱盐，用pH 7. 5的50mM磷酸盐缓冲液 (含10% DMS0)洗脱，去除未反应的DTT，得到PAMAM-SH ;
[0112] (4)将反应得到的PAMAM-SH与4. Img KMUH在DMSO中混合，室温反应2h，反应混 合物经S印hadexG25层析色谱柱脱盐，用pH 7. 5的50mM磷酸盐缓冲液（含10% DMS0)洗 脱，去除未反应的KMUH，得到PAMAM-KMUH ;
[0113] (5)得到的PAMAM-KMUH与步骤（1)中得到的氧化的mAbEGFR混合，室温反应24h， 得到的耦联物PAMAM-mAbEGFR，再使用S印hacryIS-300层析色谱柱纯化，用pH7. 5的50mM 磷酸盐缓冲液（含10%二甲基亚砜）洗脱，得到PAMAM-mAbEGFR，通过超滤浓缩到lml，冷冻 干燥成为白色粉末；
[0114] (6)PAMAMiAbEGFR载体0· Img加入双蒸水中，搅拌均勻定容至1ml，向其中逐步加 入BSH，直至BSH不再溶解为止，此时加入BSH质量为0. 05mg。放入25°C恒温摇床中震荡 24小时，得到PAMAM-mAbEGFR载体负载的BSH(PAMAM-mAbEGFR/BSH)饱和溶液。饱和溶液过 膜（0. 22μm)处理，除去未溶解的BSH，收集滤液，得到PAMAM-mAbEGFR/BSH。
[0115] 合成过程中对表皮生长因子受体单克隆抗体连接的树状大分子PAMAM-mAbEGFR 使用SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定，结果见图1。
[0116] 由图1结果可见，mAbEGFR在80kb左右出现条带，而制备的PAMAM-mAbEGFR样品 于IlOkba左右出现条带，且80kb处无任何条带，表明mAbEGFR与PAMAM已连接，且经层析 纯化后的收集液PAMM:mAbEGFR= 1:1连接。
[0117] 进一步绘制硼标准品曲线，将PAMAM-mAbEGFR/BSH滤液稀释到一定浓度，用感应 耦合等离子体原子发射光谱仪（ICP-AES)检测样品硼的含量。载体中BSH的浓度根据 载药前后BSH的差值来计算，得出负载在PAMAM-mAbEGFR上的BSH为280mg/g，即每摩尔 PAMAMiAbEGFR分子负载有BSH为 58. 8kg(58. 8kg/mol)。
[0118] 上述这些测试结果表明已成功制备了设计合成的载药抗体连接的树状大分子 PAMAM-mAbEGFR/BSH〇
[0119] 实施例 2 :PAMAM-mAbEGFR/BSH的制备
[0120] (DmAbEGFR0· 3mg与高碘酸钠6mg在pH为4. 5的0·IM醋酸盐缓冲液3ml中混 合，使用磁珠在室温不停搅拌2h，反应混合物经S印hadexG25层析色谱柱脱盐，去除过量 的高碘酸钠，用PH7. 5的50mM磷酸盐缓冲液洗脱，收集得到的氧化的表皮生长因子受体单 克隆抗体；
[0121] (2)聚酰胺一胺树枝状大分子PAMAM(Sigma公司）溶液I. 74ml，其中含PAMM 87mg，与9. 36mgSPDP在pH为ρΗ7· 5的0·IM磷酸盐缓冲液3ml中混合，反应2h，反应混合 物经S印hadexG25层析色谱柱脱盐，去除未反应的SPDP，用pH7. 5的50mM磷酸盐缓冲液 洗脱，得到中间体PAMAM-SPDP;
[0122] (3) 4. 62mgDTT溶于pH7. 5的0·IM磷酸盐缓冲液3ml中，加入0· 3gDMS0,配成含 10%DMSO的DTT溶液。配置的DTT溶液与步骤（2)反应得到的PAMAM-SPDP混合，室温反 应30min。反应混合物经SephadexG25层析色谱柱脱盐，用pH7. 5的50mM磷酸盐缓冲液 (含10%DMS0)洗脱，去除未反应的DTT，得到PAMAM-SH;
[0123] (4)将反应得到的PAMAM-SH与12. 3mgKMUH在DMSO中混合，室温反应2h，反应混 合物经S印hadexG25层析色谱柱脱盐，用pH7. 5的50mM磷酸盐缓冲液（含10 %DMS0)洗 脱，去除未反应的KMUH，得到PAMAM-KMUH;
[0124] (5)得到的PAMAM-KMUH与步骤（1)中得到的氧化的mAbEGFR混合，室温反应24h， 得到的PAMAM-mAbEGFR，再使用S印hacrylS-300层析色谱柱纯化，用pH7. 5的50mM磷酸 盐缓冲液（含10 %二甲基亚砜）洗脱，得到PAMAM-mAbEGFR，通过超滤浓缩到3ml，冷冻干燥 成为白色粉末；
[0125] (6)PAMAM-mAbEGFR载体0. 5mg加入双蒸水中，搅拌均勻定容至5ml，向其中逐步加 入BSH，直至BSH不再溶解为止，此时加入BSH质量为0. 25mg。放入25°C恒温摇床中震荡 24小时，得到PAMAM-mAbEGFR载体负载的BSH(PAMAM-mAbEGFR/BSH)饱和溶液。饱和溶液过 膜（0. 22μm)处理，除去未溶解的BSH，收集滤液得到PAMAM-mAbEGFR/BSH;
[0126] 对PAMAM-mAbEGFR进行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定，结果同实施例1制 备的PAMAM-mAbEGFR，显示mAbEGFR与PAMAM已连接，且经层析纯化后的收集液PAMAM: mAbEGFR= 1:1连接。进一步以ICP-AES测定产物PAMAM-mAbEGFR/BSH中硼的含量，结果表 明PAMAM-mAbEGFR上的BSH为280mg/g，这些测试结果表明已成功制备了设计合成的载药抗 体连接的树状大分子PAMAM-mAbEGFR/BSH。
[0127] 实施例3 :细胞毒性考察
[0128] 处于对数生长期人神经胶质瘤U87MG细胞，以IO4个/孔接种于96孔板，37°C培养 24h后移弃培养液，PAMAM-mAbEGFR/BSH配制成 0、0. 01、0.l、l、5、10ymol/L共 6 个浓度梯 度的无血清培养基加入细胞中分别培养24、48和72h，吸去含药培养液，每孔加入0. 2ml含 0. 5mg/mlMTT的无血清培养液，于37°C继续孵育4h，吸去含有MTT的培养液，用PBS清洗2 次后，每孔加入0. 2mlDMS0,震荡IOmin溶解均匀，酶标仪570nm处测定吸光度A值，计算细 胞增殖率，结果见图2。其中细胞增殖率的计算公式如下：
[0129] 细胞增殖率=实验组吸光度值/对照组吸光度值X100%。
[0130] 由图2结果可见，PAMAM-mAbEGFR/BSH对细胞增殖率没有明显的影响，各组间无显 著差异（P>〇. 05)，10μmol/LPAMAM-mAbEGFR/BSH在U87MG细胞中孵育72h最大抑制率细 胞增殖9. 55%，在最大给药剂量的10倍浓度时仍未达到半数致死量，说明PAMAM-mAbEGFR/ BSH细胞毒性较低，具有良好的生物相容性。
[0131] 实施例4 :生物活性检测
[0132] 将带有绿色荧光的EGFR单克隆抗体mAbEGFR-FITC代替制备步骤⑴中 的mAbEGFR，使得制备所得负载多面体硼烷的靶向表皮生长因子受体的树枝状大分子 PAMAM-mAbEGFR-FITC/BSH带有绿色荧光。其他制备步骤与本发明产品PAMAM-mAbEGFR/ BSH完全相同。EGFR表达阳性的人神经胶质瘤U87MG细胞，培养于含10%胎牛血清的 高糖DMEM培养基中。以IO5个/孔接种于6孔板，培养24h贴壁，加入含有IyM的 PAMAM-mAbEGFR-FITC/BSH的无血清培养液，于37°C培养24h，PBS清洗两次，换常规培养液， 荧光显微镜观察细胞对PAMAM-mAbEGFR-FITC/BSH的内吞情况，结果见图3。
[0133] 图2结果显示PAMAM-mAbEGFR-FITC/BSH在1μM时已有90%以上U87MG细胞出现 绿色荧光，且强度较高，说明此时已摄取大量PAMAM-mAbEGFR-FITC/BSH。
[0134] 实施例5 :稳定性测试
[0135]将实施例1制备的PAMAM-mAbEGFR/BSH溶液放置-20°C环境，分别于1，3，6个月取 样，观察溶液性状，同时进行BSH承载量和生物活性检测。测试结果见表1。
[0136] 表IPAMAM-mAbEGFR放置不同时间对BSH承载量和生物活性测试
[0137]
【权利要求】
1. 一种靶向硼制剂，由聚酰胺一胺树枝状大分子、表皮生长因子受体的抗体和多面体 硼烷组成，所述聚酰胺一胺树枝状大分子上连接所述表皮生长因子受体的抗体，内部负载 所述多面体硼烷。
2. -种靶向硼制剂的制备方法，通过3-(2-吡啶二巯基）丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯和 十一酸马来酰亚胺-酰肼-三氟乙酸盐将聚酰胺一胺树状大分子和表皮生长因子抗体相连 接后形成功能化树状大分子，然后负载多面体硼烷得到所述靶向硼制剂。
3. 根据权利要求2所述的制备方法，具体包括以下步骤： (1) 表皮生长因子受体抗体与高碘酸钠反应，得到氧化的表皮生长因子受体抗体； (2) 聚酰胺一胺树枝状大分子与3-(2-吡啶二巯基）丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯反应， 得到中间体PAMAM-SPDP ; (3) 步骤（2)反应得到的中间体PAMAM-SPDP与DTT反应得到PAMAM-SH ; (4) 步骤（3)反应得到的PAMAM-SH与十一酸马来酰亚胺-酰肼-三氟乙酸盐反应得到 PAMAM-KMUH ； (5) 步骤（4)反应得到的PAMAM-KMUH与步骤（1)中得到的氧化的mAbEGFR偶联得到 PAMAM-mAbEGFR ； (6) 向步骤（5)反应得到的PAMAM-mAbEGFR中加入多面体硼烷BSH，得到所述靶向硼制 剂。
4. 根据权利要求3所述的制备方法，步骤（1)中所述的表皮生长因子受体抗体与高碘 酸钠摩尔比为1 :10。
5. 根据权利要求3所述的制备方法，步骤（2)中所述的聚酰胺一胺树枝状大分子与 3-(2-吡啶二巯基）丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯的摩尔比为1 :10。
6. 根据权利要求3所述的制备方法，步骤（3)中所述的PAMAM-SPDP与DTT的摩尔比为 1 :10。
7. 根据权利要求3所述的制备方法，步骤⑷中所述的PAMAM-SH与i^一酸马来酰亚 胺-酰肼-三氟乙酸盐的摩尔比为1 :1〇。
8. 根据权利要求3所述的制备方法，步骤（5)中所述的PAMAM-KMUH与氧化的表皮生长 因子受体抗体的摩尔比为10 :1。
9. 根据权利要求3所述的制备方法，步骤（6)中所述的PAMAM-mAbEGFR与多面体硼烷 的质量比为2 :1。
10. 权利要求1所述靶向硼制剂在制备硼中子俘获疗法的药物中的应用。
【文档编号】A61P35/00GK104399094SQ201410609140
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年11月3日 优先权日:2014年11月3日
【发明者】孙婷, 周幽心, 王中 申请人:苏州大学附属第一医院