一种湿热哮喘动物模型的建立方法
【专利摘要】本发明公开了一种湿热哮喘动物模型的建立方法，用高脂饲料喂养大鼠，并灌服大肠杆菌，造成大鼠湿热证型；在喂养高脂饲料期间用卵蛋白氢氧化铝生理盐水混悬液对大鼠致敏；致敏后进行卵蛋白生理盐水溶液激发，得到湿热哮喘动物模型。本发明将传统哮喘动物模型与中医湿热证型动物模型有机结合，形成中医湿热证型哮喘动物模型，切合中医临床哮喘研究应用，方便中医平喘药物筛选的研究。
【专利说明】-种湿热巧喘动物模型的建立方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及动物药理实验【技术领域】，特别涉及一种湿热哮喘动物模型的建立及检 测方法。
【背景技术】
[0002] 过敏性哮喘的病因和发病机制是外部抗原进入机体后引起的I型变态反应。而 根据外来抗原进入机体导致I型变态反应该个基本原理而制备的动物模型已经成为研究 平喘药品与生物制品的安全性评价及有效药品的筛选等实验方面的重要工具。哮喘的发 生多为宿疾内伏于肺，遇外感、饮食、情志、劳倦等诱因而引发，W致姨阻气道、肺失肃降致 病。然而由于气候的变化和饮食结构改变，服甘厚腻辛辣煎炸饮食者众，而使肠胃积湿积 热，发病后不论外感内伤多从湿化热，湿与热合，缠绵难愈。肺与大肠相表里，肺气肃降 有助于大肠传导功能的发挥，大肠传导功能正常，则有助于肺气的肃降。肠胃湿热可影响肺 之肃降功能而致胸满咳喘。基于此可W看出，目前哮喘临床特征和病理特点受诸多因素的 影响，单纯W外来抗原复制的哮喘中医模型与中医哮喘临床辨证难W完全匹配。因此单纯 外来抗原诱导复制的动物模型无法体现中医辨证思想的优势，也不适合中医哮喘临床证型 的研究。
[0003] 儿童哮喘患者在哮喘人群中占有较大的比例，并且随着社会的发展，儿童哮喘人 数有增加的趋势。随着人们生活水平不断提高，现今的青少儿摄入过多的脂肪和蛋白，且活 动量比W往减少，出现服胖率增长的倾向。儿童因生理病理有别于成人，肺脾不足，且为纯 阳之体，不论外感湿热之邪，或饮食不节，过食膏梁厚味，脾失健运，湿热内生，大肠传导失 司，部分患儿易表现为病情迁延，咳喘姨多，伴腹胀、恶也、呕吐，大便粘腻，舌红苔黄厚腻， 该种饮食情况和生活方式使青少儿的体质中医辨证属于湿热证候。该因素在患儿罹患哮喘 疾病过程中有相关性。而传统的哮喘模型仅考虑外部抗原的因素，无法将湿热因素纳入到 模型当中，因此无法准确将中医辨证论治思想贯彻执行于动物实验研究过程中，更无法体 现中药辨证组方应用实际意义。因此，研究将儿童湿热性体质因素纳入到哮喘动物模型的 建立之中，对开展中医药在儿童哮喘药物的药效学研究更有实际意义，并推进中医治疗哮 喘药物的技术进步。
[0004] 而将成功的中医证候动物模型与哮喘动物模型相结合是一种行之有效的方式，适 应中医临床需要。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种湿热哮喘动物模型的建立方法，采用该方法能够得到具 有湿热症状的哮喘动物模型，更加接近于当今儿童体质，更利于儿童哮喘湿热证型的研究。
[0006] 本发明建立大鼠的湿热哮喘动物模型，为进行中医哮喘湿热证型研究提供动物模 型，并可进一步拓展应用于哮喘的防治技术的使用。
[0007] 本发明是该样实现的： 一种湿热哮喘动物模型的建立方法，其特征是：用高脂饲料喂养大鼠，并灌喂大肠杆 菌，造成大鼠湿热证型；在喂养高脂饲料期间用卵蛋白氨氧化铅生理盐水混息液对大鼠致 敏；致敏后进行卵蛋白生理盐水溶液激发，得到湿热哮喘动物模型。
[0008] 上述湿热哮喘动物模型的建立方法，具体包括W下步骤： (1) 在正常喂养的同时，于每日上午和夜间对大鼠分别灌胃高脂饲料，用量为2ml/只， 连续喂养14天； (2) 在第12天进行大肠杆菌灌服，用量为2ml/只，灌服大肠杆菌后1化再次灌服大肠 杆菌，用量为1ml/只； (3) 从第13天开始将大鼠放入温度31-35C、相对湿度92-98%的环境中造模3天，每 天8小时； (4) 分别在第7天和第14天用10%卵蛋白氨氧化铅生理盐水混息液对大鼠进行致敏， 致敏方式为：将1ml混息液对大鼠腹腔进行注射或者将2ml混息液对大鼠进行灌胃； (5) 从第16天开始将大鼠放入雾化箱中，使大鼠吸入2%卵蛋白生理盐水溶液激发哮 喘，每日一次，每次30min，连续7d;激发过程中大鼠出现哮喘发作症状，湿热哮喘造模成 功。
[0009] 上述建立方法中，所述高脂饲料由猪油、白糖、奶粉、蛋黄按照1 ;1 ;1: 1的质量比 配制而成。
[0010] 上述建立方法中，步骤（2)中，灌服的大肠杆菌的浓度为109个/ ml。
[0011] 上述建立方法中，10%卵清蛋白氨氧化铅生理盐水混息液由W下成分组成；卵蛋 白lOOmg，氨氧化铅lOOmg，生理盐水1ml。
[0012] 上述建立方法中，2%卵蛋白生理盐水溶液由W下成分组成；卵蛋白2g，生理盐水 100ml〇
[0013] 上述建立方法中，所用大鼠为SPF级大鼠，体重140-160g，月龄1-1. 5月。
[0014] 上述建立方法中，所述大肠杆菌为侵袭性大肠杆菌。
[0015] 上述建立方法中，哮喘症状包括烦躁、不停抓挽头面部，呼吸加快和紫巧中的至少 一种。
[0016] 本发明针对现有哮喘模型针对性低的问题，针对现今儿童体质普遍存在湿热症状 的特征，将中医湿热证型动物模型引入哮喘模型中，通过对造模参数的大量筛选，研制出了 本发明适合于现今生活状态下的青少儿的动物哮喘模型，该模型能更好的反应出现今儿童 哮喘的特点，对儿童哮喘药物的研究更加有益。本发明并非简单的将湿热证模型和哮喘模 型进行简单的叠加，还针对该两种方法的结合对建模参数都进行了优化和调整，使该两种 方法能很好的搭配在一起，不会出现相互抵触和矛盾的问题。例如将湿热环境与致敏步骤 进行重叠保证大鼠对于过敏原的敏感性，也使试验时间缩短减少其他不稳定因素干预的机 会。将细菌接种、湿热环境和卵蛋白激发紧密衔接来模拟患儿外感加湿热诱发哮喘的过程。 此外，本发明方法造模成功率高，模型重复性好，造模过程中大鼠死亡率低，能够大批量获 得动物模型。
[0017] 本发明将传统哮喘动物模型与中医湿热证型动物模型有机结合，形成中医湿热证 型哮喘动物模型，切合中医临床哮喘研究应用，方便中医平喘药物筛选的研究。
【专利附图】
【附图说明】
[001引 图1为正常对照组的肥染色图。
[0019] 图2为湿热哮喘模型组的肥染色图。
【具体实施方式】
[0020] 为了更好的解释本发明，下面对具体的建模过程进行详细的描述。
[00川 实施例1 1、所需材料 1. 1实验动物 SPF级大鼠20只（山东中医药大学实验动物中也，许可证号：SCXK (冀）2008-1-003,合 格证编号：1011003)体重150 ± lOg，月龄1-1. 5月左右。
[002引 1.2实验药品 卵清蛋白干粉：0VA(Ova化umin)，Ig/瓶，5g/瓶，北京鼎盛昌盛生物技术有限责任 公司公司分装，临用前配置成10%和2%溶液。
[0023] 侵袭性大肠杆菌干燥菌种；购于山东省卫生防疫站菌种室，菌号8099。
[0024] 氨氧化铅粉剂；分析纯AR, 500g/瓶，天津恒兴化学试剂制造有限公司，生产口 期：2013年3月01日。
[0025] 水合氯酵：分析纯AR, 250g/瓶，天津市科密欧化学试剂有限公司，批号 201001100,临用前用生理盐水配制成10%的溶液置4 0°C冰箱备用。
[002引 1. 3局脂饲料 高脂饲料的配制方法：猪油，白糖，奶粉，蛋黄根据1 ;1 ;1 ;1的质量比配制。
[0027] 1. 4仪器设备 超声雾化器；S666F型超声雾化器，北京芬道实验器材有限公司生产。
[0028] 电子天平；赛多利斯科学仪器(北京）有限公司，型号，BSA124S。
[0029] 数字化温计；上海华辰医用仪表有限公司。
[0030] 离也机；湖南仪器仪表总厂离也机厂，型号，化20A。
[0031] 光学显微镜；奧林己斯CHC双目生物显微镜。
[0032] 温箱；电热恒温水浴箱DHG-9031，上海。
[003引 1. 5实验试剂 大鼠比-2 ELISA试剂盒：上海研辉生物科技有限公司； 大鼠比-4 ELISA试剂盒：上海研辉生物科技有限公司； 大鼠比-5 ELISA试剂盒：上海研辉生物科技有限公司； 大鼠比-6 ELISA试剂盒：上海研辉生物科技有限公司； 大鼠IFN-Y ELISA试剂盒：上海研辉生物科技有限公司； 肥染液：广州威佳生物科技有限公司。
[0034] 2、方法 2. 1动物分组 大鼠称重，随机(随机数字表法）分为正常对照组、湿热哮喘模型组，每组10只。
[0035] 2. 2湿热证哮喘模型的建立 造模时，湿热造模和哮喘造模有机的结合、重叠进行。
[0036] 2. 2. 1湿热证型造模 实验开始，在正常喂养的同时，模型组于每日上午（10时)和夜间（20时)分别灌胃高脂 饲料，用量2ml/只，连续喂养14天；正常对照组相同时间给与生理盐水灌胃，2ml/只。
[0037] 在实验第12天模型组进行大肠杆菌灌服(浓度109个/ml),用量为2ml/化灌服 1化后再加强灌服大肠杆菌(浓度10 9个/ml),用量为1ml/只。
[003引从实验第13天开始将模型组大鼠放入温度（33±。C，相对湿度巧5±如％中造 模3d，每天她。
[0039] 2. 2. 2哮喘模型造模 在实验第7天和第14天用10%卵蛋白氨氧化铅生理盐水混息液（lOOmg卵蛋白+100mg 氨氧化铅+lml生理盐水)对模型组大鼠进行致敏；致敏方式为；用ImllO%卵蛋白氨氧化铅 生理盐水混息液对大鼠腹腔注射致敏，或者用2mll0%卵蛋白氨氧化铅生理盐水混息液对 大鼠灌服致敏。
[0040] 哮喘模型激发：从实验第16天开始将模型组大鼠放入密闭有机玻璃雾化箱中，使 大鼠吸入2%卵蛋白生理盐水溶液巧日蛋白2g，生理盐水100ml)激发哮喘，每日1次，每次 30min，连续7d。正常对照组组则给予生理盐水雾化吸入。激发过程中模型组大鼠出现烦 躁、不停抓挽头面部，呼吸加快、紫巧等哮喘发作等症状为哮喘造模成功。
[0041] 3、湿热证哮喘模型各性能指标检测 3. 1标本采集 最后一次激发后24内W 10%水合氯酵3ml/kg腹腔注射麻醉，腹主动脉取血5ml ;4°C 5000 r/min离也，15 min后提取血清，置-8(TC低温冰箱待测。打开胸腔采集左肺上叶， 浸泡于10%福尔马林液体中待测。
[0042] 3. 2观查指标 3. 2. 1 -般指标观察：自造模之日起，观察并记录两组大鼠体温、体重、食量、饮水量、 症状和舌苔的变化。
[0043] 3. 2. 2标本检测 ELISA法测定大鼠血清比-2、比-4、比-5、比-6、IFN- Y水平，步骤参照试剂盒说明书。 进行大鼠肺组织常规肥染色：10%甲酵固定常规脱水，透明，浸蜡包埋，制作蜡块，分别进行 肥染色。
[0044] 3. 3统计方法 采用SPSS17. 0软件进行分析，计量资料采用方差分析，计数资料采用秩和检验。
[0045] P<0. 05表示差异具有统计学意义。
[004引 3. 4结果 3. 4. 1 -般指标 3. 4. 1. 1体重，如表1所示：
【权利要求】
1. 一种湿热哮喘动物模型的建立方法，其特征是：用高脂饲料喂养大鼠，并灌服大肠 杆菌，造成大鼠湿热证型；在喂养高脂饲料期间用卵蛋白氢氧化铝生理盐水混悬液对大鼠 致敏；致敏后进行卵蛋白生理盐水溶液激发，得到湿热哮喘动物模型。
2. 根据权利要求1所述的湿热哮喘动物模型的建立方法，其特征是，包括以下步骤： (1) 在正常喂养的同时，于每日上午和夜间对大鼠分别灌胃高脂饲料，用量为2ml/只， 连续喂养14天； (2) 在第12天进行大肠杆菌灌服，用量为2ml/只，灌服大肠杆菌后12h再次灌服大肠 杆菌，用量为lml/只； (3) 从第13天开始将大鼠放入温度31-35°C、相对湿度92-98%的环境中造模3天，每 天8小时； (4) 分别在第7天和第14天用10%卵蛋白氢氧化铝生理盐水混悬液对大鼠进行致敏， 致敏方式为：将lml混悬液对大鼠进行腹腔注射或者将2ml混悬液对大鼠进行灌胃； (5) 从第16天开始将大鼠放入雾化箱中，使大鼠吸入2%卵蛋白生理盐水溶液激发哮 喘，每日一次，每次30min，连续7d;激发过程中大鼠出现哮喘发作症状，湿热哮喘造模成 功。
3. 根据权利要求1所述的湿热哮喘动物模型的建立方法，其特征是：所述高脂饲料由 猪油、白糖、奶粉、蛋黄按照1 :1 :1: 1的质量比配制而成。
4. 根据权利要求1所述的湿热哮喘动物模型的建立方法，其特征是：步骤（2)中，灌服 的大肠杆菌的浓度为1〇7 ml。
5. 根据权利要求1所述的湿热哮喘动物模型的建立方法，其特征是：10%卵清蛋白氢氧 化铝生理盐水混悬液由以下成分组成：卵蛋白l〇〇mg，氢氧化铝100mg，生理盐水lml ;2%卵 蛋白生理盐水溶液由以下成分组成：卵蛋白2g，生理盐水100ml。
6. 根据权利要求1所述的湿热哮喘动物模型的建立方法，其特征是：所用大鼠为SPF 级大鼠，体重140_160g，月龄1-1. 5月。
7. 根据权利要求1所述的湿热哮喘动物模型的建立方法，其特征是：所述大肠杆菌为 侵袭性大肠杆菌。
8. 根据权利要求1所述的湿热哮喘动物模型的建立方法，其特征是：哮喘症状包括烦 躁、不停抓挠头面部，呼吸加快和紫绀中的至少一种。
【文档编号】A61K35/74GK104396880SQ201410613549
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年11月5日 优先权日:2014年11月5日
【发明者】季旭明, 张桂菊, 吴金勇, 袭雷鸣, 卢立伟, 李燕宁 申请人:季旭明