识别、捕获和抑制循环肿瘤细胞的功能纳米材料载药系统的制作方法
【专利摘要】本发明属于纳米材料包被技术在循环肿瘤细胞识别、捕获和活性调控的应用领域，尤其针对癌症转移的预警和预防方面，特别是涉及一种特异性识别、捕获和抑制循环肿瘤细胞的功能纳米材料载药系统。该功能纳米材料载药系统由中心纳米材料载体、表面靶向抗体或适配体、抗癌或预防癌症转移的药物组成。该功能纳米材料载药系统可用于体外对模拟和临床病人血液样本微量循环肿瘤细胞的特异性识别和捕获研究，且可用于对所捕获的循环肿瘤细胞活性进行调控，从而在肿瘤转移的预警和预防方面开拓应用前景。
【专利说明】识别、捕获和抑制循环肿瘤细胞的功能纳米材料载药系统
【技术领域】
[0001] 本发明属于纳米材料包被技术在循环肿瘤细胞识别、捕获和活性调控的应用领 域，尤其针对癌症转移的预警和预防方面，特别是涉及一种特异性识别、捕获和抑制循环肿 瘤细胞的功能纳米材料载药系统。
【背景技术】
[0002] 50多年来，多种重大疾病（如心脏病）的死亡率已下降了> 60%，但癌症死亡率仅 减少约5%，其中绝大多数死于手术后肿瘤的再转移。传统的"抗癌药"主要针对那些恶性 增殖的肿瘤细胞而非处于休眠状态的循环肿瘤细胞，故不仅不能选择性地杀死循环肿瘤细 胞，而且也击垮了人体的免疫系统，使"疾病-人体自身抗病力"之间的平衡朝着不利方面 倾斜，甚至引起致突变、致癌。因此，抗癌药物的研发走的是一条"癌症转移后再抗癌"的迟 愚路线，收效甚微。当前纳米技术在癌症方面的应用途径也主要侧重于将术后转移的化学 药物与单抗体包被的纳米材料结合在一起，而这种方式由于其毒性和非特异性问题，并不 能有效地干预由循环肿瘤细胞引起的癌症转移过程。故研发能特异性识别和捕获血中微量 循环肿瘤细胞并下调其活性的功能化纳米材料载药系统，可有效预防因循环肿瘤细胞激活 后诱发的肿瘤转移，进而消除手术后肿瘤再转移和复发的隐患。
[0003] 发明目的 本发明的目的在于避免了传统纳米技术检测和捕获循环肿瘤细胞的非特异性问题，进 而提供了一种特异性识别、捕获和抑制循环肿瘤细胞的功能纳米材料载药系统，该类纳米 材料载药系统因可特异性地捕获并抑制所捕获的循环肿瘤细胞，有望应用于癌症转移的预 警和预防方面。
[0004] 本发明的一种功能纳米材料载药系统，所述功能纳米材料载药系统由中心纳米材 料载体、表面靶向抗体或适配体、抗癌或预防癌症转移的药物组成。
[0005] 所述的中心纳米材料载体为PAMAM dendrimers、金纳米颗粒AuNPs、娃纳米颗粒 SiNPs、磁性纳米颗粒MNPs或氧化石墨烯graphene oxide。
[0006] 所述的表面靶向靶向抗体或适配体由两种或两种以上能特异性识别和结合循 环肿瘤细胞表面生物标记物的靶向抗体或适配体组成，所述生物标记物为EpCAM、Sialyl Lewis X、HER2、EGFR、ALDHl 或 CD44。
[0007] 所述的抗癌或预防癌症转移的药物包括熊果酸及其衍生物、米非司酮及其衍生 物、卡托普利及其衍生物、大黄素及其衍生物。
[0008] 所述的中心纳米材料载体与表面靶向抗体或适配体采用共价连接方式进行，所述 共价连接方式为1-乙基-(3-甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐/ N-羟基丁二酰亚胺法、 亲和素/生物素法或N-羟基丁二酰亚胺/顺丁烯二酰亚胺化学法。
[0009] 所述的功能纳米材料载药系统通过将所述抗癌或预防癌症转移的药物与中心纳 米材料载体进行化学偶联、静电吸附、物理包埋的方式来制备。
[0010] 所述的中心纳米材料载体表面具有反应官能团，所述反应官能团 为-OH、-NH2、-COOH 或-SH。 toon] 所述的中心纳米材料载体与表面靶向抗体或适配体采用中间连接体进行连接， 所述中间连接体为羧基化的聚乙二醇、巯基化的聚乙二醇、hydrazide-polyethylene glycol-dithiol 或 0PSS-PEG-NHS 。
[0012] 本发明的一种特异性识别、捕获和抑制循环肿瘤细胞的功能纳米材料载药系统， 由中心纳米材料载体、表面靶向抗体或适配体及抗癌或预防癌症转移的药物组成，其中中 心部分是由具有多价络合效应、良好尺寸效应、高度负载能力及表面官能团丰富的纳米材 料支架构成；外围部分则是由能特异性识别和结合循环肿瘤细胞（CTCs)表面生物标记物 的两种或两种以上靶向抗体或适配体构成；抗癌或预防癌症转移的药物则是由抗癌或预防 癌症转移的低毒高效的小分子量化学药物构成。本发明得到的纳米材料载药系统，不仅结 构稳定，并能同时保持纳米材料和靶向抗体或适配体本身的优良特性，还可用于体外对模 拟和临床病人血液样本中微量CTCs的特异性识别和捕获研究，且可用于对所捕获的CTCs 活性进行调控，从而在肿瘤转移的预警和预防方面开拓应用前景。
[0013] 本发明详细描述如下： 可用于本发明的纳米材料应有多价络合效应、良好的尺寸效应和生物稳定性及高度的 负载能力，可采用但不局限于下列物质：树状物（dendrimers )、金纳米颗粒（AuNPs )、娃纳 米颗粒（SiNPs)、磁性纳米颗粒（MNPs)、氧化石墨烯（graphene oxide)。优先用于本发明 的为聚酰胺-胺型树枝状大分子（PAMM dendrimers)，除了具有普通纳米材料共有的特性 (外部规整精细的球状结构，内部呈疏水性空腔特性，可为疏水性药物以及无机探针分子的 负载提供场所，达到药物的控释和缓释及无机探针的靶向递送等目的）外，其表面还有大量 可控功能基团(氨基)，可以对其进行化学修饰、多价络合靶向抗体、配体及药物分子等，从 而构建安全有效的生物复合物（bioconjugate)。
[0014] 可用于本发明的靶向抗体选择针对那些能在肿瘤细胞尤其是循环肿瘤细胞表面 高度表达，而在正常细胞尤其是血细胞和白细胞上低表达或不表达的生物标记物，可采用 但不局限于下列标记物：EpCAM、Sialyl Lewis 乂、冊1?246?1?40)!11、0)44。优先用于本发明 的为针对上皮循环肿瘤细胞高表达的EpCAM和Sialyl Lewis X的抗体，其中EpCAM又称为 CD326, TACSTD1，C017-1A，GA733-2和KSA等，属单次跨膜I型糖蛋白，分子质量为30?40 kD，由3部分构成，即胞外结构域、单次跨膜结构域和胞内结构域。胞外结构域以一个信号 序列开始，其后紧接着一个上皮生长因子样重复序列、一个人类甲状腺球蛋白序列和一个 缺乏半胱氨酸的结构域，上皮生长因子样重复序列和人类甲状腺球蛋白序列形成一个球状 结构，负责EpCAM分子的同源细胞黏附特性。胞内结构域为一个具有26个氨基酸的短链，含 有2个a-辅肌动蛋白（a-actinin)结合位点，可以与肌动蛋白结合，从而和细胞骨架相互 作用。生理情况下EpCAM不同程度地表达于除鳞状上皮之外所有的正常上皮中，且多位于 细胞间紧密连接。在结缔组织及造血系统来源的细胞、脑组织和血管内皮细胞中缺乏明显 的EpCAM的表达。病理情况下EpCAM几乎表达于所有的腺癌中，包括结直肠腺癌、胃腺癌、 乳腺癌、卵巢癌、肺腺癌、前列腺癌、胰腺癌以及肝细胞癌和视网膜母细胞瘤。因此，EpCAM 常作为癌症早期检测和诊断的指标。另外一个抗体是针对抗原Sialy Lewis X (Slex)。 Slex又称为⑶15s，是肿瘤标志物单唾液酸神经节糖苷脂CA19-9的同分异构体，也是黏附 分子选择素（E-selectin，即⑶62)所识别的比较确定的配基之一，由半乳糖（Gal)、葡萄糖 (61(3)、唾液酸（他1^(：)、^乙酰基（嫩(3)、岩藻糖斤11(3)5个分子结合而成。细胞粘附分子 作为介导细胞与细胞或细胞与基质的相互识别和作用的分子基础，在肿瘤侵袭、转移过程 中发挥着重要作用。糖抗原的高表达，反映了肿瘤细胞膜糖抗原糖链的变化。通过化学修 饰作用产生的糖链异质性改变及分布，可能掩盖某些肿瘤抗原，降低肿瘤细胞免疫原性，增 加分子的净负电荷，减弱淋巴细胞和巨噬细胞结合与杀伤肿瘤细胞的作用，促使肿瘤细胞 发生免疫逃避。由于细胞表面相互间的排斥力增大，吸附和结合能力降低，因而使肿瘤细胞 易于从组织脱落转移。粘附分子在肿瘤细胞的侵袭和转移过程中发挥着双重作用，一方面 肿瘤细胞必须先通过细胞粘附分子下调，从原发灶脱落；另一方面又需要通过细胞外基质 受体或内皮细胞配体的上调，与细胞外基质或血管内皮细胞粘附而移动，才能形成转移灶。 ⑶15s高表达与灶性去分化是肿瘤转移倾向的重要标志。因此，⑶15s也作为CTCs研究的 革巴点之一。
[0015] 可用于本发明的构成功能纳米材料载药系统的药物，通常指那些高效低毒的抗癌 或预防癌症转移的化学药物，可采用但不局限于下列化合物：熊果酸及其衍生物、米非司酮 及其衍生物、卡托普利及其衍生物、大黄素及其衍生物。优先推荐用于本发明的米非司酮及 其衍生物。因它们可抑制血液中循环肿瘤细胞对血管内膜的粘附及对外周组织的侵袭，故 可在癌症转移的预防中发挥重要作用。
[0016] 可用于本发明的中心纳米材料与表面靶向抗体或适配体的共价连接方式，可采用 但不局限于下列方法：1-乙基-(3-甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐（EDC)/ N-羟基丁 二酰亚胺（NHS)法、亲和素（avidin) /生物素（biotin)法和N-羟基丁二酰亚胺（NHS) / 顺丁烯二酰亚胺（maleimide)化学法。优先用于本发明的EDC/NHS催化法，不仅可使双抗 体（anti-EpCAM、anti_Slex)依次共价连接在PAMAM dendrimers表面，还可减少抗体在材 料表面的物理吸附（anti-fouling effect)，降低纳米材料本身的毒性，增加纳米材料-抗 体络合物在生物环境中的稳定性。
[0017] 可用于本发明的功能纳米材料载药系统的制备，可采用但不局限于下列方法实 现：将化学药物共价偶联在纳米材料表面、将化学药物静电吸附在纳米材料表面、将化学药 物包埋在纳米材料空腔中。优先推荐用于本发明的物理包埋法，即将化学药物米非司酮及 其衍生物在一定环境中包埋到PAMAM dendrimers的3D空腔结构中。该方法既避免了化学 药物与抗体共同连接在PAMAM dendrimers表面所产生的空间位阻效应，又最大程度地利用 了 PAMAM dendrimers的空间结构，提高了药物装载量。
[0018] 可用于本发明的中心纳米材料，表面应具有反应官能团，便于与靶向抗体的共价 连接，可选用但不局限于下列基团：-0H、-NH 2、-C00H、-SH。
[0019] 可用于本发明的纳米材料与靶向抗体进行连接时，减少空间位阻效应的中 间体，可采用但不局限于下列物质：羧基化的聚乙二醇、巯基化的聚乙二醇（PEG-SH)、 hydrazide-polyethylene glycol-dithiol Λ orthopyridyl-disulfide-polyethyleneglyc ol-N-hydroxy-succinimide (OPSS-PEG-NHS)。
[0020] 可用于本发明的中心纳米材料与表面靶向抗体，为了实现最大多价络合效应，靶 向抗体的用量要远比纳米材料本身多，具体多少要依据纳米材料表面裸露的反应官能团而 定。
[0021 ] 可用于本发明的体外循环肿瘤细胞模型应选取那些研究集中、术后转移和复发程 度中高的癌细胞株，可采用但不局限于下列癌细胞株：乳腺癌细胞株、前列腺癌细胞株、结 肠癌细胞株、肝癌细胞株、宫颈癌细胞株、胃癌细胞株、肺癌细胞株。优先推荐选用人结肠癌 细胞株HT29作为体外循环肿瘤细胞模型。因结肠癌细胞株HT29的转移和复发程度适中， 风险性较小；且生物标记物EpCAM和Slex在该细胞表面稳定性高度表达，故选取HT29为体 外CTCs模型，将会有助于本研究的顺利开展。
[0022] 可用于本发明的体外含有循环肿瘤细胞的血液样本取自那些研究集中、术后转移 和复发程度中高的中晚期癌症病人，可选取并不局限于下列癌症病人：结肠癌病人、乳腺癌 病人、肝癌病人、前列腺癌病人、宫颈癌病人、胃癌病人、肺癌病人。
[0023] 可用于本发明的功能纳米材料载药系统的理化性质表征手段，可采用但不局限于 下列方法：核磁共振谱（ 1H NMR)、红外光谱（FTIR)、紫外可见光谱（UV-Vis)、荧光光谱或图 谱、激光粒度（DLS)/ Zeta电位、场发射扫描电镜（FSEM)图、原子力显微镜（AFM)图、投射 电镜图、电泳图。
[0024] 可用于本发明的功能纳米材料载药系统体外CTCs捕获研究的手段，可采取但不 局限于下列方法：按照病人血液中CTCs含量（1/10 3_106)，首先向大量的干扰细胞(诸如白 细胞、红细胞、生物标记物不表达的正常细胞或其它肿瘤细胞）中添加一定量的目标肿瘤 细胞或向全血中添加一定量的目标肿瘤细胞，后加入定量的纳米材料-双/多靶向抗体或 适配体络合物开展捕获研究。优先推荐使用本发明中通过单独考察PAMAM dendriemrs-双 抗络合物对悬浮和贴壁HT29细胞的识别和捕获作用，或考察在大量干扰细胞（白血病细胞 HL-60或红细胞RBCs)存在下，对少量HT29细胞的捕获情况，采用荧光拍照和流式细胞仪分 析法评估双抗络合物体外在模拟血液样本中对CTCs模型的特异性捕获效果。
[0025] 可用于本发明的功能纳米材料载药系统对临床病人血液样本中CTCs的捕获研究 手段，可采用但不局限于本方法：获取术后或化疗后肿瘤病人的血液样本，经处理获取淋巴 细胞层后，加入纳米材料-双/多靶向抗体或适配体络合物共孵育或直接全血中加入纳米 材料-双/多靶向抗体或适配体络合物开展捕获研究。优先推荐使用本发明中通过获取肿 瘤医院的术后结肠癌血液样本，添加定量的PAMAM dendrimers-双抗络合物进行捕获实验， 血液后期处理后，流式定量分析其捕获CTCs数目，激光共聚焦分析其捕获情况。
[0026] 可用于本发明的功能纳米材料载药系统对捕获CTCs的活性调控研究手段，可采 用但不局限于下列评估措施：用MTT、XTT、LDH法测试纳米材料-双/多靶向抗体络合物的 细胞毒性，用PI染色法、BrdU掺入法等测试络合物影响细胞周期的分布情况，用Annexin V-FITC/PI、TUNEL、Annexin V-PE/7-AAD、DAPI、AO/EB、Caspase 3/8/9 等染色法评估细胞 的凋亡状况。优先推荐本发明中采用MTT法、形态学染色观察法、流式细胞仪分析细胞周期 和细胞凋亡法深入探索PAMAM dendrimers-双抗络合物对捕获CTCs活性的抑制机理。
[0027] 本发明的有益效果： (1) 本发明提供了一种特异性识别、捕获和抑制循环肿瘤细胞的功能纳米材料络合物 载药系统，该载药系统可特异性地识别、捕获和抑制血中的循环肿瘤细胞，从而有望在癌症 转移的预警和预防领域发挥重要作用； (2) 本发明提供了将两种或两种以上抗体或适配体偶联到同一种纳米材料表面的技术 信息，该制备方法简单，易于操作，反应条件温和，对设备的要求低，且具有产业化实施的前 旦 -5^ 〇
【专利附图】
【附图说明】
[0028] 图1为识别、捕获和抑制循环肿瘤细胞的功能纳米材料载药系统的发明示意 图。i,纳米材料PAMAM dendrimers表面进行羧基化修饰；ii,修饰的dendrimers表面 共价连接两种抗体（aEpCAM和aSlex); iii-v,所制备的dendrimers-双抗体载药系统 在有无干扰细胞存在下对目标结肠癌细胞株HT29的特异性识别和捕获；vi，所制备的 dendrimers-双抗体载药系统对捕获的癌细胞进行活性抑制作用。
[0029] 图2为实施例1、2所得的G6 PAMAM dendrimers对应衍生物（CC G6)及抗体络合 物（G6-5aEpCAM-5aSlex)的氢核磁图谱。
[0030] 图3为实施例1、2所得的G6 PAMAM dendrimers对应衍生物（CC G6)及抗体络合 物（G6-5aEpCAM-5aSlex)的红外图谱。
[0031] 图4为实施例1、2所得的G6 PAMAM dendrimers对应衍生物（CC G6)及抗体络合 物（G6-5aEpCAM-5aSlex)的紫外吸收图谱。
[0032] 图5为实施例1、2所得的双抗络合物G6-5aEpCAM-5aSlex的扫描电镜图。
[0033] 图6为实施例3所得到的荧光标记双抗络合物PE-5aEpCAM-G6-3aSlex_FITC体外 对贴壁HT29细胞的识别和结合荧光图谱。
[0034] 图7为实施例3所得到的荧光标记双抗络合物PE-5aEpCAM-G6-3aSlex_FITC体外 对非贴壁HT29细胞的识别和捕获荧光图谱。
[0035] 图8为实施例3所得到的荧光标记双抗络合物PE-5aEpCAM-G6-3aSlex-FITC在大 量RBCs干扰下对微量目标HT29细胞的捕获效率流式分析。
[0036] 图9为实施例4所得到的荧光标记双抗络合物PE-5aEpCAM-G6-3aSlex_FITC对术 后结肠癌病人血样中微量CTCs的捕获荧光图谱。
[0037] 图10为实施例4所得到的荧光标记双抗络合物PE-5aEpCAM-G6-3aSlex_FITC对 术后结肠癌病人血样中微量CTCs的捕获流式图谱。
[0038] 图11为实施例5所得的不同浓度的双抗络合物G6-5aEpCAM_3aSlex对HT29细胞 的周期分布影响。**表示同等条件下与空白对照组的比较，/7〈0. 01。
[0039] 图12为实施例5所得的不同浓度的双抗络合物G6-5aEpCAM_3aSlex对HT29细胞 的凋亡影响。*和**表示同等条件下与空白对照组的比较， #和##表示同等条件下同一样 品不同浓度间的比较；当为*或#时，/?〈〇. 05 ;当为**或##时，/?〈0. 01。
【具体实施方式】
[0040] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。
[0041] 实施例1 :双抗体包被的聚酰胺-胺型树枝状大分子络合物的制备 有无荧光标记抗体包被的聚酰胺-胺型树枝状大分子络合物可通过将抗体与聚酰 胺-胺型树枝状大分子共价连接而获得，从而用于体外对CTCs的特异性识别、捕获和活性 调控，具体制备过程如图1所示。
[0042] ( I)聚酰胺-胺型树枝状大分子的完全羧基化修饰： 取甲醇溶解的含有60 mg末端为氨基的第6代聚酰胺-胺型树枝状大分子（G6 PAMM dendrimers)，旋转蒸发掉甲醇溶液后，用2 ml DMSO溶液溶解完全，后加入246 mg琥珀酰 酐，室温下避光强磁力搅拌反应24 h，随后将反应产物用截留分子量为8, 000?14, 000的 纤维素透析膜在超纯水中500 ml X 3中透析24 h，待完全纯化后，最后冷冻干燥得到树状 大分子表面氨基完全羧酸化的产物CC G6 (G6 -(COOH) 256); (2) 聚酰胺-胺型树枝状大分子的部分乙酰化修饰： 将G6 -(COOH) 256溶于pH 7. 4的磷酸盐缓冲溶液中，使其浓度为0.276 μ g/ml，取8 ml 浓度为0·276 μg/ml的G6-(C00H) 256，加入EDC 302 ng和NHS18L5ng，室温避光搅拌 活化I h，从而得到树状大分子表面部分乙酰化的中间产物； (3) 聚酰胺-胺型树枝状大分子的双抗体（aEpCAM)和（aSlex)修饰 取活化后的中间产物溶液lml，加入118.6 μ?浓度为50 yg/ml的aEpCAM溶液和 7. 12 μ 1浓度为500 μ g/ml的aSlex溶液，室温下避光搅拌过夜，然后经透析纯化，冷冻 干燥得到树状大分子表面偶联抗体aEpCAM和aSlex的G6-5aEpCAM-3aSle X双抗络合物； (4) 聚酰胺-胺型树枝状大分子的双抗体（aEpCAM)和（aSlex)修饰 取活化后的中间产物溶液lml，加入118.6 μ 1浓度为50 μ g/ml的aEpCAM溶液和 11.86 μ 1浓度为500 μ g/ml的aSlex溶液，室温下避光搅拌过夜，然后经透析纯化，冷冻 干燥得到树状大分子表面偶联抗体aEpCAM和aSlex的G6 -5aEpCAM-5aSleX双抗络合物。
[0043] (5)荧光标记的聚酰胺-胺型树枝状大分子的双抗体（aEpCAM和aSlex)修饰 取Iml上述活化的产物CC G6,先加入3.56 μ?的aSlex及3.56 μ?的二抗IgG-FITC 溶液室温下避光反应12 h，后加入15 μ 1的aEpCAM-ΡΕ溶液继续反应12 h，然后经产物 透析纯化24 h，最后冷冻干燥得到双荧光标记的PE-5aEpCAM-G6-3aSlex-FITC络合物。
[0044] (6)荧光标记的聚酰胺-胺型树枝状大分子的双抗体（aEpCAM和aSlex)修饰 取Iml上述活化的产物CC G6,先加入5.93 μ?的aSlex及5.93 μ?的二抗IgG-FITC 溶液室温下避光反应12 h，后加入15 μ 1的aEpCAM-ΡΕ溶液继续反应12 h，然后经产物 透析纯化24 h，最后冷冻干燥得到双荧光标记的PE-5aEpCAM-G6-5aSlex-FITC络合物。
[0045] 实施例2:双抗体包被的聚酰胺-胺型树枝状大分子络合物的表征 (1)取新制备的一定量的CC G6、G6-5aEpCAM-5aSlex物质，分别用700 μ 1的D2O溶 解充分后放置在核磁管中，后用400 MHz超导核磁共振仪做1H NMR分析。（2)取新制备的 一定量的CC G6、G6-5aEpCAM-5aSlex物质，用I3BS (pH 7. 4)溶解充分后，经超声波处理5 min,经0.22 μ m的一次性水溶性过滤器过滤后，于DLS/Zeta potential仪测定各自的水 溶性粒径及电势分布。（3)取新制备的一定量的CC G6、G6-5aEpCAM-5aSleX物质，用适量 KBr粉末混匀经压片后，于红外仪中分别测试其FTIR图谱。
[0046] (4)取新制备的一定量的 CC G6、G6-5aEpCAM-5aSlex 物质，用 PBS (pH 7.4)将其 溶解配制成一定浓度后，并以PBS (pH 7. 4)为基准，于Q5000超微量分光光度计上分别测 定这些物质在波长210-600 nm的紫外吸收图谱。
[0047] (5)取新制备的G6-5aEpCAM-5aSlex络合物，先将导电胶粘结在样品座上，后用 毛细管吸取超声分散的0.1% (W/W)的该络合物水溶液，逐滴滴加在导电胶上，风干后放入 扫描电镜中观察。
[0048] 表征结果分析知，CC G6和G6-5aEpCAM_5aSlex的1H NMR图谱差异（如图2所 示）显示出抗体连接前后物质结构的不同，尤其是酯峰的出现，说明了抗体在G6 PAMM dendrimers表面的存在。FTIR图谱(如图3所示)中，当CCG6连接上抗体aEpCAM和aSlex 后,虽保持在1680-1630 cnT1处的C=O伸缩振动，但在1420-1400 cnT1处的C-N伸缩的酰 胺键特征吸收峰增强，可见物质表面基团的差别也反映出双抗体在纳米材料表面的成功偶 联。因 CC G6本身在220 nm处没有紫外吸收，而抗体aEpCAM和aSlex均在220 nm处有 特征紫外吸收值，故选择220 nm的吸收峰作为判断抗体是否连接到纳米材料上的指标。UV 图谱显示(如图4所示)，虽是低浓度的G6-5aEpCAM-5aSlex络合物，但在220 nm处仍有特 征吸收峰，可见纳米材料表面已成功包被了抗体。所制备的双抗络合物G6-5aEpCAM-5aSlex 有何理化特性呢，将其单分散的水溶液粒子进行粒径和电势测定表明（见表1)，当纳米材料 CC G6共价连接双抗体后，虽电负特性未有明显变化，但其水溶性粒径急剧增大，可见抗体 的存在会造成一定的聚集趋势。扫描电镜图谱(如图5所示)也进一步确定了所制备双抗络 合物的形貌和直径，该络合物表面近似球形，水平直径在100 nm左右。
[0049] 表1为G6 PAMAM dendrimers对应的衍生物（CC G6)及抗体络合物 (G6-5aEpCAM_5aSlex)的水溶性直径和Zeta电势。
【权利要求】
1. 一种功能纳米材料载药系统，其特征在于：所述功能纳米材料载药系统由中心纳米 材料载体、表面靶向抗体或适配体、抗癌或预防癌症转移的药物组成。
2. 根据权利要求1所述的功能纳米材料载药系统，其特征在于：所述的中心纳米材料 载体为PAMAM dendrimers、金纳米颗粒AuNPs、娃纳米颗粒SiNPs、磁性纳米颗粒MNPs或氧 化石墨烯 graphene oxide。
3. 根据权利要求1所述的功能纳米材料载药系统，其特征在于：所述的表面靶向靶向 抗体或适配体由两种或两种以上能特异性识别和结合循环肿瘤细胞表面生物标记物的靶 向抗体或适配体组成，所述生物标记物为EpCAM、Sialyl Lewis X、HER2、EGFR、ALDH1或 CD44。
4. 根据权利要求1所述的功能纳米材料载药系统，其特征在于：所述的抗癌或预防癌 症转移的药物包括熊果酸及其衍生物、米非司酮及其衍生物、卡托普利及其衍生物、大黄素 及其衍生物。
5. 根据权利要求1所述的功能纳米材料载药系统，其特征在于：所述的中心纳米 材料载体与表面靶向抗体或适配体采用共价连接方式进行，所述共价连接方式为1-乙 基-(3-甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐/ N-羟基丁二酰亚胺法、亲和素/生物素法或 N-羟基丁二酰亚胺/顺丁烯二酰亚胺化学法。
6. 根据权利要求1所述的功能纳米材料载药系统，其特征在于：所述的功能纳米材料 载药系统通过将所述抗癌或预防癌症转移的药物与中心纳米材料载体进行化学偶联、静电 吸附、物理包埋的方式来制备。
7. 根据权利要求2所述的功能纳米材料载药系统，其特征在于：所述的中心纳米材料 载体表面具有反应官能团，所述反应官能团为-〇H、_NH2、-C00H或-SH。
8. 根据权利要求5所述的功能纳米材料载药系统，其特征在于：所述的中心纳米材料 载体与表面靶向抗体或适配体采用中间连接体进行连接，所述中间连接体为羧基化的聚乙 二醇、疏基化的聚乙二醇、hydrazide-polyethylene glycol-dithiol 或 OPSS-PEG-NHS。
【文档编号】A61K47/34GK104353082SQ201410639414
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年11月13日 优先权日:2014年11月13日
【发明者】贾力, 谢静静, 陈红宁 申请人:福州大学