人核仁磷酸化蛋白nolc1的原核表达和纯化方法
【专利摘要】本发明公开了一种人核仁磷酸化蛋白NOLC1的原核表达和纯化方法。涉及基因工程【技术领域】。本发明中构建pET28a-NOLC1原核表达载体，并将其转化于BL21菌株中，经诱导产生His-NOLC1融合蛋白，使用镍离子螯合柱(Ni-NTA)纯化菌体破碎后的上清以获得较为单一的融合蛋白，纯化后的蛋白可为抗肿瘤细胞的药物靶点设计提供理论依据，从而为NOLC1蛋白在临床中的应用提出新的视角和途径。
【专利说明】人核仁磷酸化蛋白N0LC1的原核表达和纯化方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程【技术领域】，尤其涉及一种真核蛋白的原核重组质粒的构建、 蛋白表达及纯化的方法。
【背景技术】
[0002] 人核仁磷酸化蛋白N0LC1，又名hNoppl40,是一个高度磷酸化的哺乳动物蛋白，与 RNA聚合酶I相互结合，参与核仁的发生，调节rDNA的转录，参与炎症发生、细胞生长、细胞 凋亡、肿瘤发生等相关信号通路的调控。正因为NOLCl蛋白对信号通路中起到的重要的调 节作用，所以能够得到单一纯化的NOLCl蛋白将对其在临床抗肿瘤方面的应用奠定基础。
[0003] 传统的分离、纯化真核蛋白的方法，其成本高、效率低，最主要的困难是对技术方 面要求特别高，而且分离纯化得到的目的蛋白纯度相对也较低。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种操作方便、表达量大、需时较短，纯度高的人核仁磷酸化 蛋白NOLCl的原核表达和纯化方法。
[0005] 本发明采用的技术方案是：一种重组质粒pET28a-N0LCl，由原核表达载体pET28a 和氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示的人核仁磷酸化蛋白NOLCl经Nco I和Not I双酶切后 连接而成。其制备方法包括以下步骤：
[0006] 1)合成人核仁磷酸化蛋白NOLCl基因，以P为引物，通过PCR扩增反应，制得扩增 产物；所述的引物P的序列为：
[0007] 上游引物 F : CCGCCATGGCGATGGTTCCCAGCGACCTGTATC
[0008] 下游引物 R : GCGGCGGCCGCCTCGCTGTCAAACTTAATAG
[0009] 2)将扩增产物和原核表达载体pET28a同时进行Nco I和Not I双酶切，连接，制 得重组质粒pET28a-N0LCl。
[0010] 一种人核仁磷酸化蛋白NOLCl的原核表达和纯化方法，包括如下步骤：
[0011] 1)转化：将上述的重组质粒pET28a-N0LCl转化于感受态大肠杆菌BL21中，获得 阳性表达菌株BL21 ;
[0012] 2)目标蛋白的表达：将阳性表达菌株BL21接种于LB液体培养基中，37°C 180r/ min过夜培养至0D600 = 0. 5-0. 7,于菌液中加入IPTG至终浓度为0. 6mmol/L，置于24°C、 160r/min的摇床中培养过夜，4°C、12000r/min离心，富集菌体，PBS洗菌体3次后重悬菌 体，超声破碎至菌悬液澄清，4°C，12000r/min将破碎后的液体离心15min，收集上清液，获 得His-NOLCl融合蛋白；
[0013] 3)目标蛋白的纯化：每IOOmg His-NOLCl融合蛋白加入5ml PBS和终浓度为ImM 的蛋白酶抑制剂，超声破碎菌体，4°C、12000r/min离心，取上清液，负载上镍离子螯合柱，以 Binding Buffer冲洗柱子，使用Elution Buffer洗脱，收集洗脱液，即为目标蛋白N0LC1。
[0014] 本发明，首先构建pET28a-N0LCl原核表达载体，并将其转化于大肠 BL21菌株中， 经诱导产生His-NOLCl融合蛋白。通过对诱导温度和时间等条件的优化，得到大量可溶性 的His-NOLCl融合蛋白。同时使用镍离子螯合柱（Ni-NTA)纯化菌体破碎后的上清，利用镍 离子螯合柱吸附含有组氨酸His-tag的蛋白，而pET28a载体上携带His-tag，pET28a-N0LCl 表达含His-NOLl的目的蛋白能够被镍柱的异性吸附而实现，从而获得单一的融合蛋白。
[0015] 本发明的有益效果是：本发明将人核仁磷酸化蛋白NOCLl克隆到携带His-tag的 表达载体pET28a上，通过转化，使得大肠杆菌BL21中获得可以表达His-NOLCl融合蛋白的 重组子。这种新的表达系统可以在诱导剂的作用下高效地表达可融性的目的蛋白，再通过 镍柱纯化系统纯化目的蛋白。本发明的构建、表达、纯化系统可以高效地表达和纯化人核 仁磷酸化蛋白NOCLl。本发明提供的纯化方法可使融合蛋白His-NOLCl纯化后的纯度高达 95%，而以往的蛋白质纯化方法纯化出蛋白质的纯度只能达到60%-70%左右，本发明提 供的表达及纯化方法比其他方法纯化出蛋白质的纯度高出30%左右，且纯化的效率可达到 40mg/ml。本发明表达和纯化的人核仁磷酸化蛋白N0CL1，在鼻咽癌细胞中NOLCl蛋白明显 上调，下调NOLCl蛋白可以促进肿瘤细胞发生凋亡。本发明提供的高纯度NOLCl蛋白有望 可以被应用到抗肿瘤药物的研究当中。
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 图1是融合蛋白His-NOLCl的SDS-PAGE检测图；
[0017] 其中，M是标准蛋白分子量；1是融合蛋白His-NOLCl。
[0018] 图2是目标蛋白NOLCl的电泳图；
[0019] 其中，M是标准蛋白分子量；1是蛋白NOLCl。
【具体实施方式】
[0020] 本发明所采用的技术手段，本领域的技术人员均可依据《分子克隆》和其他技术手 册而获知。
[0021] 实施例1人核仁磷酸化蛋白NOLCl的原核表达和纯化方法
[0022] ( -）引物设计
[0023] 扩增人核仁磷酸化蛋白NOLCl基因，同时引入Nco I和Not I双酶切位点；
[0024] 引物设计如下：上游引物F和下游引物R的序列如下：
[0025] F: CCGCCATGGCGATGGTTCCCAGCGACCTGTATC (斜体表示 Nco I 酶切位点）
[0026] R:GCGGCGGCCGCCTCGCTGTCAAACTTAATAG (斜体表示 Not I 酶切位点）
[0027] (二）PCR 扩增
[0028] 以pCMV-flag-NOLCl (由辽宁大学，生命科学院208实验室成功构建并提供）作为 模板。
[0029]
【权利要求】
1. 一种重组质粒pET28a-N0LCl，其特征在于：由原核表达载体pET28a和氨基酸序列如 SEQ ID NO. 1所示的人核仁磷酸化蛋白N0LC1经Nco I和Not I双酶切后连接而成。
2. 如权利要求1所述的重组质粒pET28a-N0LCl，其特征在于：制备方法包括以下步 骤： 1) 合成人核仁磷酸化蛋白N0LC1基因，以P为引物，通过PCR扩增反应，制得扩增产物； 所述的引物P的序列为： 上游引物 F :CCGCCATGGCGATGGITCCCAGCGACCTGTATC 下游引物 R :GCGGCGGCCGCCTCGCTGTCAAACTTAATAG 2) 将扩增产物和原核表达载体pET28a同时进行Nco I和Not I双酶切，连接，制得重 组质粒 pET28a-N0LCl。
3. 人核仁磷酸化蛋白N0LC1的原核表达和纯化方法，其特征在于：包括如下步骤： 1) 转化：将权利要求1或2所述的重组质粒pET28a-N0LCl转化于感受态大肠杆菌BL21 中，获得阳性表达菌株BL21 ; 2) 目标蛋白的表达：将阳性表达菌株BL21接种于LB液体培养基中，37°C 180r/min过 夜培养至0D600 = 0. 5-0. 7,于菌液中加入IPTG至终浓度为0. 6mmol/L，置于24°C、160r/ min的摇床中培养过夜，4 °C、12000r/min离心，富集菌体，PBS洗菌体3次后重悬菌体， 超声破碎至菌悬液澄清，4°C，12000r/min将破碎后的液体离心15min，收集上清液，获得 His-NOLCl融合蛋白； 3) 目标蛋白的纯化：将His-NOLCl融合蛋白利用镍离子螯合柱提纯。
4. 如权利要求3所述的人核仁磷酸化蛋白N0LC1的原核表达和纯化方法，其特征在于 所述的目标蛋白的纯化是：每l〇〇mg His-NOLCl融合蛋白加入5ml PBS和终浓度为ImM的 蛋白酶抑制剂，超声破碎菌体，4°C、12000r/min离心，取上清液，负载上镍离子螯合柱，以 Binding Buffer冲洗柱子，使用Elution Buffer洗脱，收集洗脱液，即为目标蛋白N0LC1。
5. 权利要求3或4所述的人核仁磷酸化蛋白N0LC1在制备治疗抗肿瘤药物中的应用。
【文档编号】A61P35/00GK104480132SQ201410677516
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年11月21日 优先权日:2014年11月21日
【发明者】刘宏生, 朱春玉, 郑方亮, 佘晓双, 朱俊峰, 张力 申请人:辽宁大学