本发明涉及雷公藤内酯甲(wilforlideA)用于增强化学治疗药物之效力的用途。
背景技术：
在持续的化学治疗过程中总是产生抗药性。克服该问题是癌症治疗中的一个重大挑战。事实上，肿瘤细胞利用多种机制来提高其对化学治疗药物的抗性。例如，肿瘤细胞可过表达多抗药性转运蛋白和癌蛋白表皮生长因子受体基因以及诱导NF-E2相关因子2(一种上调参与谷胱甘肽代谢和药物解毒作用之广谱基因的氧化还原敏感转录因子)的活性。参见(Huang等，2005a；Makarovskiy等，2002；Wang等，2010)；(Salzberg等，2007；Sirotnak等，2000)；(Singh等，2010；Zhang等，2010)；以及(Huang和Sadee，2003；Seruga等，2010)。刺猬通路(Hedgehogpathway)是参与化学抗性的另一细胞信号传导通路(Domingo-Domenech等，2012)。
迄今为止，还未发现设计用于有效靶向特定抗性机制的单一物质。然而，可从中草药雷公藤(Triperygiumwilfordii)提取的小分子雷公藤内酯甲可使对化学治疗药物治疗已经具有抗性的癌细胞敏感，以使得癌症再次对化学治疗药物变得敏感。
技术实现要素：
本发明涉及通过共施用化学治疗药物和雷公藤内酯甲的组合来治疗患有癌症的患者的方法，所述患者已获得了对所述化学治疗药物的抗性。因此，所述方法向有此需要的患者施用雷公藤内酯甲和化学治疗药物的组合。本发明还涉及雷公藤内酯甲(雷公藤内酯甲单独或与化学治疗药物组合)的组合物。可使用本发明方法和组合物克服抗药性之化学治疗药物的类型包括拓扑异构酶药物、紫杉烷类和双重酪氨酸激酶抑制剂。
通常，本文中应理解，通过本发明的方法或组合物所治疗的癌症至少部分地对化学治疗药物单独的治疗具有抗性。因此，与单独施用化学治疗药物的效力相比，本发明的方法以一定的剂量共施用雷公藤内酯甲而提高了化学治疗药物的效力。本发明的治疗方法和组合物可用于治疗多种器官的实体肿瘤和血液肿瘤，包括乳腺癌、血癌和前列腺癌。
可以依次施用或共施用雷公藤内酯甲和化学治疗药物。当依次施用它们时，至少一部分的雷公藤内酯甲在施用化学治疗药物之前施用。可以以相同的方式并使用相似或相同的化学治疗组合物施用雷公藤内酯甲。如上所述，在本发明的一种方法中，可共施用雷公藤内酯甲和化学治疗药物，并且可以以包含雷公藤内酯甲和化学治疗药物两者的单一组合物施用。因此，本发明的另一个实施方案涉及包含雷公藤内酯甲和化学治疗药物之组合的化学治疗组合物，其中以有效治疗癌症的组合量施用雷公藤内酯甲和所述化学治疗药物；以及可药用载体。
表格简述
表1提供了用于确定多西他赛抗性前列腺癌细胞系PC3-TxR中雷公藤内酯甲之IC50的72小时长雷公藤内酯甲剂量-响应分析的磺酰罗丹明B(sulforhodamineB，SRB)细胞生存力测定结果。表1与图1相关。
表2提供了多西他赛、拉帕替尼和柔红霉素的浓度以及用于确定这些药物的IC50浓度的细胞系。
表3提供了在存在和不存在雷公藤内酯甲预处理的情况下，多西他赛、柔红霉素和拉帕替尼的IC50浓度的结果。
表4报告了用0.6μg/ml的雷公藤内酯甲预处理，随后用多种浓度的多西他赛处理72小时之多西他赛敏感性PC3细胞的SRB细胞生存力测定结果。表4和5与图2A相关。
表5报告了在用多种浓度的多西他赛处理72小时后且不用雷公藤内酯甲预处理之多西他赛敏感性PC3细胞的SRB细胞生存力测定结果。
表6报告了用1.25μg/ml的雷公藤内酯甲预处理，随后用多种浓度的多西他赛处理72小时之多西他赛敏感性PC3细胞的SRB细胞生存力测定结果。表6和7与图2B相关。
表7报告了用多种浓度的多西他赛处理72小时后且不用雷公藤内酯甲预处理之多西他赛敏感性PC3细胞的SRB细胞生存力测定结果。
表8报告了用2.5μg/ml的雷公藤内酯甲预处理，随后用多种浓度的多西他赛处理72小时之多西他赛敏感性PC3细胞的SRB细胞生存力测定结果。表8和9与图2C相关。
表9报告了用多种浓度的多西他赛处理72小时后且不用雷公藤内酯甲预处理之多西他赛敏感性PC3细胞的SRB细胞生存力测定结果。
表10报告了用0.6μg/ml的雷公藤内酯甲预处理，随后用多种浓度的多西他赛处理72小时之多西他赛抗性PC3-TxR细胞的SRB细胞生存力测定结果。表10和11与图3A相关。
表11报告了用多种浓度的多西他赛处理72小时后且不用雷公藤内酯甲预处理之多西他赛抗性PC3-TxR细胞的SRB细胞生存力测定结果。
表12报告了用1.25μg/ml的雷公藤内酯甲预处理，随后用多种浓度的多西他赛处理72小时之多西他赛抗性PC3-TxR细胞的SRB细胞生存力测定结果。表12和13与图3B相关。
表13报告了用多种浓度的多西他赛处理72小时后且不用雷公藤内酯甲预处理之多西他赛抗性PC3-TxR细胞的SRB细胞生存力测定结果。
表14报告了用2.5μg/ml的雷公藤内酯甲预处理，随后用多种浓度的多西他赛处理72小时之多西他赛抗性PC3-TxR细胞的SRB细胞生存力测定结果。表14和15与图3C相关。
表15报告了用多种浓度的多西他赛处理72小时后且不用雷公藤内酯甲预处理之多西他赛抗性PC3-TxR细胞的SRB细胞生存力测定结果。
表16报告了用5.0μg/ml的雷公藤内酯甲预处理，随后用多种浓度的多西他赛处理72小时之多西他赛抗性PC3-TxR细胞的SRB细胞生存力测定结果。表16和17与图3D相关。
表17报告了用多种浓度的多西他赛处理72小时后且不用雷公藤内酯甲预处理之多西他赛抗性PC3-TxR细胞的SRB细胞生存力测定结果。
表18报告了用2.5μg/ml的雷公藤内酯甲预处理，随后用多种浓度的多西他赛处理72小时之多西他赛抗性DU145-TxR细胞的SRB细胞生存力测定结果。表18和19与图4相关。
表19报告了用多种浓度的多西他赛处理72小时后且不用雷公藤内酯甲预处理之多西他赛抗性DU145-TxR细胞的SRB细胞生存力测定结果。
表20报告了用2.5μg/ml的雷公藤内酯甲预处理，随后用多种浓度的多西他赛处理72小时之柔红霉素抗性K562/Dox细胞的SRB细胞生存力测定结果。表20和21与图5相关。
表21报告了用多种浓度的多西他赛处理72小时后且不用雷公藤内酯甲预处理之柔红霉素抗性K562/Dox细胞的SRB细胞生存力测定结果。
表22报告了用2.5μg/ml的雷公藤内酯甲预处理，随后用多种浓度的多西他赛处理72小时之拉帕替尼抗性、HER2阳性乳腺腺癌SkBr3-TxR细胞的SRB细胞生存力测定结果。表22和23与图6相关。
表23报告了用多种浓度的多西他赛处理72小时后且不用雷公藤内酯甲预处理之拉帕替尼抗性、HER2阳性乳腺腺癌SkBr3-TxR细胞的SRB细胞生存力测定结果。
表24报告了用2.5μg/ml的雷公藤内酯甲预处理，随后用多种浓度的多西他赛处理72小时之拉帕替尼抗性、HER2阳性乳腺导管癌Bt474-TxR细胞的SRB细胞生存力测定结果。表24和25与图7A相关。
表25报告了用多种浓度的多西他赛处理72小时后且不用雷公藤内酯甲预处理之拉帕替尼抗性、HER2阳性乳腺癌导管癌Bt474-TxR细胞的SRB细胞生存力测定结果。
表26报告了用25μg/ml的雷公藤内酯甲预处理，随后用多种浓度的多西他赛处理72小时之拉帕替尼抗性、HER2阳性乳腺导管癌Bt474-TxR细胞的SRB细胞生存力测定结果。表24和25与图7B相关。
表27报告了用多种浓度的多西他赛处理72小时后且不用雷公藤内酯甲预处理之拉帕替尼抗性、HER2阳性乳腺导管癌Bt474-TxR细胞的SRB细胞生存力测定结果。
附图简述
图1示出了用于确定多西他赛抗性前列腺癌细胞系PC3-TxR中雷公藤内酯甲之IC50的72小时长雷公藤内酯甲剂量-响应测定的磺酰罗丹明B(SRB)细胞生存力测定结果。参见表1。
图2示出了在用0.6μg/ml(图2A)、1.25μg/ml(图2B)、或2.5μg/ml(图2C)的雷公藤内酯甲预处理，随后用多种浓度的多西他赛处理72小时之多西他赛敏感性PC3细胞的磺酰罗丹明B(SRB)细胞生存力测定结果。参见表4-9。
图3示出了用0.6μg/ml(图3A)、1.25μg/ml(图3B)、2.5μg/ml(图3C)、或5.0μg/ml(图3D)的雷公藤内酯甲预处理，随后用多种浓度的多西他赛处理72小时之多西他赛抗性PC3-TxR细胞的磺酰罗丹明B(SRB)细胞生存力测定结果。参见表10-17。
图4示出了用2.5μg/ml的雷公藤内酯甲预处理，随后用多种浓度的多西他赛处理72小时之多西他赛抗性DU145-TxR细胞的磺酰罗丹明B(SRB)细胞生存力测定结果。参见表18-19。
图5示出用2.5μg/ml的雷公藤内酯甲预处理，随后用多种浓度的柔红霉素处理72小时之柔红霉素抗性K562/Dox细胞的磺酰罗丹明B(SRB)细胞生存力测定结果。参见表20-21。
图6示出了用2.5μg/ml的雷公藤内酯甲预处理，随后用多种浓度的柔红霉素处理72小时之拉帕替尼抗性、HER2阳性乳腺腺癌SkBr3-TxR细胞的磺酰罗丹明B(SRB)细胞生存力测定结果。参见表22-23。
图7示出了用2.5μg/ml(图7A)或25μg/ml(图7B)的雷公藤内酯甲预处理，随后用多种浓度的柔红霉素处理72小时之拉帕替尼抗性、HER2阳性乳腺导管癌Bt474-TxR的磺酰罗丹明B(SRB)细胞生存力测定结果。参见表24-27。
图8示出了(图8A)经腹膜内(i.p.)、(图8B)经口管饲(p.o.)和(图8C)静脉内(i.v.)向CD-1小鼠施用雷公藤内酯甲的血浆浓度时间进程曲线。
图9示出了对SCID小鼠中多西他赛抗性人PC3-TxR细胞肿瘤的化学致敏作用，其中所述小鼠在15天长的多西他赛处理期间接受了不同量的雷公藤内酯甲，如实施例9所述。
发明详述
本文描述了治疗患有癌症的患者的方法，所述患者已获得对化学治疗剂的抗性，如果不是由于获得的抗性，化学治疗药剂可用来有效地治疗所述患者。更具体地，根据本发明的治疗方法共施用一定剂量的小分子化合物3-相思子内酯甲(3-epiabruslactoneA)与治疗方法所靶向的癌症已变得有抗性的化学治疗药物。
本文中，3-相思子内酯甲会通常以其通用名雷公藤内酯甲被提及。可合成或从植物源中提取雷公藤内酯甲(其分子式为C30H46O3，分子量为454.684)。例如，可以用有机溶剂从雷公藤(一种中国本土的药用植物)的根皮或木质部提取雷公藤内酯甲。参见Luo等，J.Sep.Sci.30(9)：1284-91(2007)，其全部内容并入本文。雷公藤内酯甲使已对化学治疗药物治疗具有抗性的癌症细胞变得敏感，以使得癌症再次对所述化学治疗药物变得敏感。
在多个实施方案中，本发明的方法通过使雷公藤内酯甲与化学治疗药物抗性癌细胞相接触并实现细胞对化学治疗药物抗性的逆转来克服抗癌化学治疗抗药性，从而使得化学治疗药物引起药物抗性癌细胞死亡或白细胞淤积(cytostasis)。因此，本发明的治疗方法用于抑制、延缓或防止对化学治疗剂有抗性之肿瘤细胞的生长。
本文所使用的术语“治疗”指的是向患有对化学治疗药物治疗有抗性之癌症的对象共施用雷公藤内酯甲与化学治疗药物，目的是治疗、治愈、减轻、缓解、改变、补救、改进、改善或影响癌症。在多个实施方案中，本发明的方法将雷公藤内酯甲和与雷公藤内酯甲共施用的化学治疗药物同时施用或即时依次(immediatesuccession)施用，而在另一些实施方案中，在施用化学治疗药物之前施用雷公藤内酯甲以使得所治疗的癌症细胞在与化学治疗药物接触之前已通过雷公藤内酯甲至少部分地变得敏感。在本文中应理解，本发明的方法包括用于组合雷公藤内酯甲和化学治疗药物的灵活且有效的方案。
如本文中所理解的，雷公藤内酯甲的“有效量”指的是使癌细胞对指定化学治疗药物的抗性降低所需的雷公藤内酯甲的量。如本领域技术人员所公认的，有效量可根据施用途径、赋形剂的使用以及与其他药剂共同使用的可能性而变化。
根据本发明的方法，向患者施用的雷公藤内酯甲的剂量足以逆转癌症对与雷公藤内酯甲共施用之化学治疗药物的抗性。在多个实施方案中，通过本发明的方法施用的雷公藤内酯甲的剂量为0.5mg至40mg雷公藤内酯甲/千克体重。例如，在一个实施方案中，本发明的方法施用约1.2mg/kg的雷公藤内酯甲，而在另一个实施方案中，本发明的方法施用6mg/kg，而在又一个实施方案中，本发明的方法施用30mg/kg。
可通过本发明的方法治疗的癌症包括多种器官的实体肿瘤和血液肿瘤。实体肿瘤的非限制性实例是转移性乳腺癌和前列腺癌(包括雄激素依赖性前列腺癌和雄激素非依赖性前列腺癌)。通过本发明的方法可以治疗的血液肿瘤包括，例如，慢性髓性白血病(chronicmyelogenousleukemia，CML)，其特征是在血液、骨髓、脾、肝以及有时在其他组织中未成熟粒细胞(例如，嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)的异常增殖。
在根据本发明治疗癌症的方法中，可与雷公藤内酯甲共施用的化学治疗药物包括拓扑异构酶抑制剂，例如盐酸柔红霉素。因此，在一个不同的实施方案中，通过本发明的方法治疗的癌症已对拓扑异构酶抑制剂敏感，例如，在施用CDP-拓扑异构酶抑制剂缀合物、颗粒或组合物之前，对象已经接受辐射和/或对象已经接受磷酸酶抑制剂(例如，冈田酸(okadiacacid)。在一个实施方案中，癌症对拓扑异构酶抑制剂敏感或已对拓扑异构酶抑制剂敏感且所述癌症是乳腺细胞癌，而在另一个实施方案中，癌症是前列腺癌；在又一个实施方案中，癌症是白血病。
在多个实施方案中，在第一治疗周期(即，疗程)的第1、2和3天，和后续周期的第1、2天，本发明的方法共施用雷公藤内酯甲与25mg/m2/天至45mg/m2/天静脉内(IV)施用的盐酸柔红霉素。
在根据本发明治疗癌症的方法中，可与雷公藤内酯甲共施用的另一些化学治疗药物是抗有丝分裂紫杉类(anti-mitotictaxoid)药物，也称为紫杉烷类，例如多西他赛(TaxotereTM)。在一个实施方案中，癌症对紫杉烷敏感或已对紫杉烷敏感且所述癌症是乳腺细胞癌，而在另一个实施方案中，癌症是前列腺癌，在又一个实施方案中，癌症是白血病。
在多个实施方案中，本发明的方法每三周1次共施用雷公藤内酯甲与50mg/m2/天至80mg/m2/天静脉内(Ⅳ)施用的多西他赛水合物，持续1至10个周期。在本发明的另一些实施方案中，在3至4周的间隔中，每天一次施用静脉内(IV)施用的50mg/m2/天至80mg/m2/天的多西他赛水合物(剂量可适当地增加或减少)。
本发明的方法还包括使用双重酪氨酸激酶抑制剂(TKI)(例如拉帕替尼，其以商品名市售)的治疗，所述双重酪氨酸激酶抑制剂(TKI)中断HER2/neu和表皮生长因子受体(EGFR)途径。因此，通过本发明的方法有利地治疗的患者包括以下患者群体：(a)TKI未接受过治疗的(naive)癌症患者，其中治疗预防或延迟了对TKI治疗的抗性，(b)具有表达野生型EGFR之肿瘤的患者，(c)具有表达突变形式的EGFR之肿瘤的患者，(d)之前用EGFR抑制剂(例如吉非替尼或厄洛替尼、阿法替尼、达克米替尼或其他)治疗的患者，其中治疗克服了对EGFR抑制剂的原发性或获得性抗性，(e)对用TKI(例如吉非替尼或厄洛替尼、阿法替尼、达克米替尼或其他)的治疗具有获得性抗性的患者，其中治疗克服了对TKI治疗的抗性，(g)具有由T790M(T790M+)引起的原发性或获得性抗性的患者群体，其中治疗预防或克服了对TKI治疗的抗性，和(h)具有未由T790M(T790M-)引起(例如通过其他机制(如MET癌基因)或通过不明原因)的原发性或获得性抗性的患者群体，其中治疗预防或克服了对TKI治疗的抗性。
与雷公藤内酯甲共施用的二甲苯磺酸拉帕替尼(lapatinibditosylate)的一个优选剂量是每日经口施用一次1,250mg(5片)，持续21天，在21天周期中的1至14天，与卡培他滨2000mg/m2/天(以相隔约12小时的两个剂量经口施用)组合施用。
本发明还涉及雷公藤内酯甲的药物组合物，因此，在多个实施方案中，本发明之含雷公藤内酯甲的组合物是用于治疗患有癌症之患者的化学治疗组合物。在一个实施方案中，化学治疗组合物包含雷公藤内酯甲，并且不包含其他化学治疗药物组分。在这样的实施方案中，雷公藤内酯甲的剂量足以克服患者对化学治疗药物的抗性，其中雷公藤内酯甲的剂量不具有细胞毒性。然而，在另一些实施方案中，本发明的化学治疗组合物包含雷公藤内酯甲与化学治疗药物的组合。与单独的雷公藤内酯甲组合物一样，雷公藤内酯甲的剂量足以克服患者对所述化学治疗药物的抗性，但该剂量不是细胞毒性剂量。
如上所述，包含在雷公藤内酯甲单独组合物或雷公藤内酯甲组合组合物中的雷公藤内酯甲的剂量足以克服患者对化学治疗药物的抗性。在灵活且有效(flexibleandactive)的治疗方案的进程中，雷公藤内酯甲的足够剂量可以变化。在多个实施方案中，包含在本发明化学治疗组合物中的雷公藤内酯甲的剂量是50μg/ml至500μg/ml配制用于静脉内施用的液体组合物。
本发明之组合化学治疗组合物的实例包括其中雷公藤内酯甲与拓扑异构酶抑制剂组合、与紫杉烷化合物组合或与双重酪氨酸激酶抑制剂(TKI)(其中断HER2/neu和表皮生长因子受体(EGFR)途径)组合的组合物。在多个实施方案中，本发明的组合化学治疗组合物可将雷公藤内酯甲与拓扑异构酶抑制剂盐酸柔红霉素组合。在另一些实施方案中，本发明的组合化学治疗组合物可将雷公藤内酯甲与紫杉烷化合物多西他赛水合物组合。在又一个实施方案中，本发明的组合化学治疗组合物可将雷公藤内酯甲与TKI二甲苯磺酸拉帕替尼组合。
可经口、肠胃外、通过吸入喷雾、表面地、经直肠、经鼻、经颊、经阴道或通过植入库(implantedreservoir)来施用上述组合物。本文中所使用的术语“肠胃外”包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内和颅内注射或输注技术。在多个实施方案中，根据本领域中已知的用于与雷公藤内酯甲组合施用的化学治疗药物的配方和施用方法来配制并施用本发明的化学治疗组合物(包括雷公藤内酯甲单独组合物和雷公藤内酯甲与其他化学治疗药物组合的组合物)。
用于经口施用的组合物还可以是任何经口可接受的剂型，包括但不限于：胶囊剂、片剂、乳剂和水混悬剂、分散剂和溶液剂。在经口使用片剂的情况下，通常使用的载体包括乳糖和玉米淀粉。通常还添加润滑剂，例如硬脂酸镁。对于以胶囊剂形式经口施用，可用的稀释剂包括乳糖和干燥的玉米淀粉。当经口施用水混悬剂或乳剂时，可将活性成分与乳化剂或助悬剂组合来混悬或溶解于油相中。
本发明的组合物还可含有一种或更多种赋形剂。合适的赋形剂是例如，水、盐水、葡萄糖、甘油或乙醇。此外，如果需要的话，待施用的药物组合物还可含有少量无毒辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、稳定剂、溶解增强剂和其他这类试剂，例如乙酸钠、脱水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯和环糊精。
本发明的组合物包含多种辅料乳化剂以增强雷公藤内酯甲的生物利用度，所述乳化剂包括羟丙基β环糊精(HBCD，RoquetteAmerica，Keokuk，IA)和甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯乳化剂，例如以CapmulTM产品线(ABITECCorp.)市售的乳化剂。在一些实施方案中，组合物可以以选自0.5mg/ml至5mg/ml的浓度(雷公藤内酯甲/乳化剂)包含与甘油单酯乳化剂、甘油二酯乳化剂、甘油三酯乳化剂、或其组合进行组合的雷公藤内酯甲。在一个实施方案中，(雷公藤内酯甲/乳化剂)的浓度为3mg/ml。
实施例
实施例1
雷公藤内酯甲IC50的测定。出于鉴定雷公藤内酯甲浓度的目的，在体外测定了雷公藤内酯甲的IC50，所述雷公藤内酯甲的浓度可用于确定其在多西他赛抗性前列腺癌细胞系PC3-TxR(从EvanT.Keller教授，UniversityofMichigan获得)的细胞培养物中的化学致敏作用(chemosensitizingeffect，CE)。通过向有盖平底96孔细胞培养板(目录号#655180，购自GreinerBio-one，Monroe，NC)的各孔添加混悬于100μl培养基中的3000个细胞来制备PC3-TxR培养物。细胞培养基为补充有10％胎牛血清(ThermoScientific，Logan，UT)以及青霉素(100U/ml)和链霉素(100μg/ml)溶液(LifeTechnologies，GrandIsland，NY)的基础RPMI1640培养基。为每个所测试的实验条件分配一式七份(septuplicate)的孔(即，每个数据点n＝3)，并在向孔接种后允许细胞有24小时的恢复期。在恢复期期间，在37℃和5％CO2下孵育细胞。
恢复后，从细胞培养物吸出铺板培养基(platingmedia)，并用每孔50μl之含指定浓度雷公藤内酯甲的RPMI进行替换。然后，在雷公藤内酯甲培养基的存在下，将细胞孵育72小时。通过将雷公藤内酯甲的储备溶液(在DMSO中0.5mg/ml)制成1∶3的连续稀释液以达到浓度为1×102μg/ml至1×10-3μg/ml来制备50μl雷公藤内酯甲等分试样。
在72小时的雷公藤内酯甲处理后，使用磺酰罗丹明B(SRB)测定来定量活细胞。为了进行该测定，从每个孔吸出雷公藤内酯甲培养基，并用10％的冷三氯乙酸(TCA)溶液(目录号#：T6399，购自Sigma-Aldrich)进行替换，并在4℃下孵育一小时。在TCA孵育后，吸出TCA溶液，用自来水将细胞洗涤5次。除去最后一次的洗涤液后，在室温下将板的盖子打开，直到表面干燥，这需要一至两个小时。然后，向每个孔添加50μl的0.4％的磺酰罗丹明B(SRB)钠盐溶液(目录号#：S9012，购自Sigma-Aldrich)，并将板在室温下孵育20至30分钟。之后，用10mMTRIS碱中的1％的乙酸溶液(目录号#：161-0719，购自Bio-RadLaboratories，Hercules，CA)将孔洗涤五次。随后将板放置以干燥数小时或过夜。通过向每个孔添加100μl的SRB增溶溶液(10mMTRIS碱)来增溶留在干燥的孔中的SRB，并将板放置在轻轻运动的摇动器上或使板在室温下保持静止直到SRB溶解，这将需要约五至十分钟。通过酶标仪在565nm处的吸光度经分光光度测定与固定的活细胞数目直接相关的各孔中SRB的量。在本实施例中描述的雷公藤内酯甲剂量响应分析的细胞生存力结果示于表1中，并以图形的形式示于图1中。
表1
实施例2
在多个不同的化学治疗药物和癌细胞系的情况下，雷公藤内酯甲化学致敏作用(CE)值的比较。在这些比较中，将细胞培养物中受试的化学治疗药物(D)的体外IC50与当用雷公藤内酯甲(购自中国广州的PI&PITechnologyInc.或中国北京的theNationalInstitutesforFoodanddrugControl)预处理细胞后进行药物处理之药物的IC50进行比较。被评估的化学治疗药物是多西他赛(购自Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA，Ca目录号01885)、柔红霉素(也称为阿霉素，购自Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)和拉帕替尼(从XiaoiiangCui教授，Cedars-Sinai，BeverlyHills，CA获得)。
在以下多西他赛抗性前列腺癌细胞系中测定多西他赛IC50和多西他赛IC50(WA+D)：(i)DU145-TxR和PC3-TxR(这两个细胞系均从DepartmentofMedicine，UniversityofPittsburghandPartnersHealthcare获得)和(ii)多西他赛敏感性细胞系，PC3和DU145(购自ATCC，Manassas，VA，USA)。
在柔红霉素敏感性和抗性髓性白血病细胞系K562和K562/Dox(从KennethChan教授，OhioStateUniversity获得)中分别测定柔红霉素IC50和柔红霉素IC50(WA+D)。
在拉帕替尼敏感性、HER2阳性乳腺腺癌系SkBr3和拉帕替尼抗性亚系SkBr3-TxR(从XiaojiangCui教授，Cedars-Sinai，BeverlyHills，CA获得)中测定拉帕替尼IC50和拉帕替尼IC50(WA+D)。
为了获得IC50值，通过将RPMI1640中补充有10％胎牛血清(ThermoScientific，Logan，UT)以及青霉素溶液(100U/ml)和链霉素(100μg/ml)溶液(LifeTechnologiesGrandIsland，NY)的100μl培养基置于每个孔中来将所期望的细胞铺板到无菌的有盖平底CellstarTM96孔细胞培养板(目录号#655180，购自GreinerBio-one，Monroe，NC)中，所述培养基含有3000个细胞(对于PC3、PC3-TxR、DU145、DU-145-TxR)或5000个细胞(对于K562、K562/Dox、BT474、BT474-TxR、SkBr3和SkBr3-TxR)。为每个所测试的实验条件分配一式三份的孔，并在向孔接种后允许细胞有24小时的恢复期。在恢复期期间，在37℃和5％CO2下孵育细胞。
如下进行雷公藤内酯甲对细胞的预处理：通过从孔中吸出培养基，随后添加50μl含有浓度为1.25μg/ml、2.5μg/ml或5μg/ml的雷公藤内酯甲(这些是从在DMSO中0.5mg/ml的雷公藤内酯甲储备溶液制备的)的RPMI培养基，并在37℃和5％CO2的条件下将细胞孵育两小时。在两小时的预处理期结束时，根据表2中提供的量添加50μl等分试样的所需化学治疗药物RPMI培养基。
表2
如上所述，添加不同剂量的化学治疗药物后，在与用于预处理步骤之相同的温度和大气条件下将细胞再孵育72小时。72小时的多西他赛处理期后，如实施例1中所述进行磺酰罗丹明B(SRB)测定以定量活细胞。表3总结了受试化学治疗药物的IC50和IC50(WA+D)量的结果。
表3
实施例3
雷公藤内酯甲预处理并未显著地增强多西他赛敏感性胰腺肿瘤细胞对多西他赛的敏感性。研究了雷公藤内酯甲预处理对多西他赛处理的PC3细胞的化学致敏作用。在这项研究中，如实施例1所述，将PC3细胞铺板于96孔板中，不同之处在于，为每个实验条件下制备一式三份的孔，而不是一式七份的孔。细胞在第8代时进行铺板。在24小时的休息期后，从孔中吸出将铺板培养基，并用50μl含有0.6μg/ml、1.25μg/ml或2.5μg/ml雷公藤内酯甲的RPMI进行替换。然后在37℃和5％CO2下，将细胞孵育两小时。两小时孵育后，通过立即添加100nM、33.3nM、10nM、3.33nM、1.0nM、0.333nM、0.1nM或0.001nM的多西他赛来进行细胞对多西他赛的剂量响应分析。然后将细胞在37℃和5％CO2下孵育72小时。72小时孵育后，如实施例1中所述进行磺酰罗丹明B(SRB)测定以定量活细胞。表4、6和8报告了分别用0.6μg/ml、1.25μg/ml和2.5μg/ml的雷公藤内酯甲预处理后获得的多西他赛剂量响应细胞生存力数据。表5、7和9报告了从在多西他赛处理之前未用雷公藤内酯甲预处理的细胞获得的对照数据。图2以图形的形式总结了表4-9的数据。
表4
表5
表6
表7
表8
表9
实施例4
雷公藤内酯甲使多西他赛抗性前列腺癌细胞系PC3-TrX对多西他赛敏感。研究了雷公藤内酯甲预处理对于多西他赛处理对PC3-TrX细胞的化学致敏作用。在这项研究中，如实施例3中所述将PC3-TxR细胞铺板于96孔板中。在24小时的休息期后，从孔中吸出接种培养基，并用50μl含有浓度为0.6μg/ml、1.25μg/ml、2.5μg/ml或5.0μg/ml的雷公藤内酯甲的RPMI进行替换。用1.25μg/ml和2.5μg/ml雷公藤内酯甲预处理的铺板细胞在第37代进行铺板。用0.6μg/ml和5.0μg/ml雷公藤内酯甲预处理的铺板细胞在第42代进行铺板。然后将细胞在37℃和5％CO2下孵育两小时。两小时孵育后，通过立即添加100nM、33.3nM、10nM、3.33nM、1.0nM、0.333nM、0.1nM或0.001nM的多西他赛进行细胞对多西他赛的剂量响应分析。然后将细胞在37℃和5％CO2下孵育72小时。72小时孵育后，如实施例1中所述进行磺酰罗丹明B(SRB)测定以定量活细胞。表10、12、14和16报告了分别用0.6μg/ml、1.25μg/ml、2.5μg/ml和5.0μg/ml的雷公藤内酯甲预处理后获得的多西他赛剂量响应细胞生存力数据。表11、13、15和17报告了从在多西他赛处理之前未用雷公藤内酯甲预处理的细胞获得的对照数据。图3以图形的形式总结了表10-17的数据。
表10
表11
表12
表13
表14
表15
表16
表17
实施例5
雷公藤内酯甲使多西他赛抗性前列腺癌细胞系DU145-TXR对多西他赛敏感。研究了雷公藤内酯甲预处理对于多西他赛处理对DU145-Txr细胞的化学致敏作用。在这项研究中，如在实施例3中对PC3细胞所述，将DU145-Txr细胞铺板于96孔板中。在24小时的休息期后，从孔中吸出铺板培养基，并用50μl含0μg/ml或2.5μg/ml的雷公藤内酯甲的RPMI进行替换。然后将细胞在37℃和5％CO2下孵育两小时。在两小时孵育后，通过立即添加100nM、33.3nM、10nM、3.33nM、1.0nM、0.333nM、0.1nM或0.001nM的多西他赛进行细胞对多西他赛的剂量响应分析。然后将细胞在37℃和5％CO2下孵育72小时。72小时孵育后，如实施例1中所述进行磺酰罗丹明B(SRB)测定以定量活细胞。表18报告了用2.5μg/ml的雷公藤内酯甲预处理后获得的多西他赛剂量响应细胞生存力数据，而表19报告了从在多西他赛处理之前未用雷公藤内酯甲预处理的细胞获得的对照数据。图4以图形的形式总结了表18和19的数据。
表18
表19
实施例6
雷公藤内酯甲使柔红霉素抗性髓性白血病细胞系K562/Dox对柔红霉素敏感。研究了雷公藤内酯甲预处理对于柔红霉素处理对K562/Dox细胞的化学致敏作用。在这项研究中，如实施例3中对PC3细胞所述，将K562/Dox细胞铺板于96孔板中，不同之处在于，每孔铺板5000个细胞，而不是3000个细胞。24小时的休息期后，从孔中吸出铺板培养基，并用50μl含0μg/ml或2.5μg/ml的雷公藤内酯甲的RPMI进行替换。然后将细胞在37℃和5％CO2下孵育两小时。两小时的孵育后，通过立即添加100μM、33.3μM、10μM、3.33μM、1.0μM、0.333μM、0.1μM或0.001μM的柔红霉素进行细胞对柔红霉素的剂量响应分析。然后将细胞在37℃和5％CO2下孵育72小时。72小时孵育后，如实施例1中所述进行磺酰罗丹明B(SRB)测定以定量活细胞。表20报告了用2.5μg/ml的雷公藤内酯甲预处理后获得的柔红霉素剂量响应细胞生存力数据，而表21报告了从在柔红霉素处理之前未用雷公藤内酯甲预处理的细胞获得的对照数据。图5以图形的形式总结了表20和21的数据。
表20
表21
实施例7
雷公藤内酯甲使拉帕替尼抗性、HER2阳性乳腺腺癌细胞系SkBr3-TxR对拉帕替尼敏感。研究了雷公藤内酯甲预处理对于拉帕替尼处理对SkBr3-TxR细胞的化学致敏作用。在这项研究中，如实施例3中对PC3细胞所述，将SkBr3-TxR细胞铺板于96孔板中，不同之处在于每孔铺板5000个细胞，而不是3000个细胞。24小时的休息期后，从孔中吸出铺板培养基，并用50μl含浓度为2.5μg/ml的雷公藤内酯甲，或者完全不含雷公藤内酯甲的RPMI进行替换。然后将细胞在37℃和5％CO2下孵育两小时。两小时孵育后，通过向指定的孔立即添加在50μlRPMI等份试样中的20μM、6.7μM、2.0μM、0.67μM、0.2μM、0.067μM、0.002μM和0.001μM拉帕替尼进行细胞对拉帕替尼的剂量响应分析。然后将细胞在37℃和5％CO2下孵育72小时。72小时孵育后，如实施例1中所述进行磺酰罗丹明B(SRB)测定以定量活细胞。表22报告了用2.5μg/ml雷公藤内酯甲预处理后获得的多西他赛剂量响应细胞生存力数据，而表23报告了从在拉帕替尼处理之前未用雷公藤内酯甲预处理的细胞获得的对照数据。图6以图形的形式总结了表22和23的数据。
表22
表23
实施例8
雷公藤内酯甲使拉帕替尼抗性、HER2阳性乳腺导管癌细胞系BT474-TxR对拉帕替尼敏感。研究了雷公藤内酯甲预处理对于拉帕替尼处理对Bt474-TxR细胞的化学致敏作用。在这项研究中，如实施例3中对PC3细胞所述，将Bt-474-Txr细胞铺板于96孔板中，不同之处在于每孔铺板5000个细胞，而不是3000个细胞。在24小时的休息期后，从孔中吸出铺板培养基，并用50μl含0μg/ml、2.5μg/ml或25μg/ml雷公藤内酯甲的RPMI进行替换。然后将细胞在37℃和5％CO2下孵育2小时。两小时孵育后，通过向指定的孔立即添加在50μlRPMI等份试样中的20μM、6.7μM、2.0μM、0.67μM、0.2μM、0.067μM、0.002μM和0.001μM拉帕替尼进行细胞对拉帕替尼的剂量响应分析。然后将细胞在37℃和5％CO2下孵育72小时。72小时孵育后，如实施例1中所述进行磺酰罗丹明B(SRB)测定以定量活细胞。表24和26报告了分别用2.5μg/ml和25μg/ml的雷公藤内酯甲预处理后获得的拉帕替尼剂量响应细胞生存力数据，而表25和27报告了从在拉帕替尼处理之前未用雷公藤内酯甲预处理的细胞获得的对照数据。图7以图形的形式总结了表24-27的数据。
表24
表25
表26
表27
实施例9
雷公藤内酯甲是体内多西他赛有效的化学致敏剂。基于以上表明雷公藤内酯甲是体外多西他赛的化学致敏剂的结果，使用CD-1小鼠(CharlesRiverLaboratoriesInternationalInc.Wilmington，MA)进行了体内研究以评估经口施用雷公藤内酯甲对多西他赛的化学治疗作用的效力。对于单剂量MTD(sdMTD)和多剂量MTD(mdMTD)方案测定了雷公藤内酯甲的最大耐受剂量(maximumtolerateddose，MTD)。MTD被定义为这样的剂量：1)非致命的；2)比对照动物相比，引起对体重增加不超过10％的延迟；和3)不引起明显的器官功能障碍或副作用。进行了七天长的sdMTD研究，其中在第一天施用单剂量。还进行了七天长的mdMTD研究，其中每天施用雷公藤内酯甲。
在这些研究中所用的施用途径是静脉内(i.v.)、经口管饲(p.o)和腹膜内(i.p.)施用。因为雷公藤内酯甲水溶性差，所以将其溶解于二甲基亚砜(DMSO，Sigma-aldrich，St.Louis，MO)、CapmulTMMCMC8EP(辛酸甘油单酯/辛酸甘油二酯，ABITEC，Columbus，OH)，或羟丙基β环糊精(HBCD，RoquetteAmerica，Keokuk，IA)。更具体地，通过以下步骤制备工作浓度的雷公藤内酯甲：(i)在80℃下以3mg/ml的浓度将雷公藤内酯甲溶解于DMSO中以用于腹膜内施用；(ii)以3mg/ml的浓度将雷公藤内酯甲溶解于CapmulTM中以用于经口管饲施用；和(iii)在80℃下以1.5mg/ml的浓度将雷公藤内酯甲溶解于DMSO中，然后在40％HBCD(w/v)中稀释十倍以用于静脉内施用。由于雷公藤内酯甲溶解性差，因此对于腹膜内、经口管饲和静脉内，可以实现的最大剂量分别为约6mg/kg、30mg/kg和1.2mg/kg。因此，用这些剂量开始MTD研究。
对于每个受试给药方案，12只CD-1小鼠(6只雄性和6只磁性)接受适当体积的每种雷公藤内酯甲制剂。将小鼠圈养，随意供给食物和水。在施用雷公藤内酯甲后，立即对所有的小鼠进行四小时时段的监测以观察急性毒性的迹象，并且每天至少监测3次，持续一周以观察延迟毒性的迹象。处理后24小时以及在为期一周的研究过程中每隔一天对小鼠进行称重。结果表明，对于单剂量和多剂量方案二者，小鼠对腹膜内、经口管饲和静脉内分别为6mg/kg、30mg/kg和1.2mg/kg的剂量都具有良好的耐受性。基于这些结果，没有测试另外的较低剂量，并且在随后的药代动力学和异种移植研究中使用这些剂量。
为了确定小鼠中雷公藤内酯甲的药代动力学，如上所述配制了用于腹膜内、经口管饲和静脉内施用的雷公藤内酯甲，剂量分别为6mg/kg、30mg/kg和1.2mg/kg。在雷公藤内酯甲施用之前以及在：(i)腹膜内施用后5、10、15、20、30和60分钟；(ii)经口管饲施用后2、5、10、15、20和30分钟；以及(iii)静脉内后施用后1、2、3和4小时的时候，处死四只CD-1小鼠。在每个时间点，通过心脏穿刺抽取血液并通过在10000rpm下离心五分钟来分离血浆。使用经过验证的HPLC-MS/MS法测量血浆雷公藤内酯甲浓度。直接从血浆浓度时间过程数据读出峰药物浓度(Cmax)和达到峰药物浓度的时间(Tmax)，而末端消除半衰期(T1/2)计算为0.693/Ke，其中Ke是末期消除速率(terminalphaseeliminationrate)。在图8A-C中分别示出了腹膜内、经口管饲和静脉内后的血浆浓度时间进程曲线。腹膜内、经口管饲和静脉内施用后雷公藤内酯甲的Cmax值分别为0.75μg/ml、0.03μg/ml和2.82μg/ml，对应于41.0、25.6和11.2分钟的T1/2时间。基于这些结果，显示经口管饲施用不能够达到合理的血浆浓度，因此，不包含在后续的体内异种移植研究中。
对于多西他赛，进行了体内肿瘤异种移植研究以评估腹膜内和静脉内施用的雷公藤内酯甲对通过PC3-TxR细胞的异种移植引起之多西他赛抗性人前列腺癌症肿瘤的化学致敏作用。简言之，如上所述配制并通过静脉内和腹膜内途径施用雷公藤内酯甲，并且与多西他赛组合使用，其以20mg/kg的剂量经静脉内施用。将在14天时间过程结束时的肿瘤大小与仅接受多西他赛的宿主小鼠的肿瘤大小进行了比较。为了进行这项研究，通过在小鼠中皮下注射PC3-TxR细胞以在其中形成肿瘤，所述小鼠为56只严重的4-6周龄重症联合免疫缺陷(severecombinedimmunodeficient，SCID)雄性小鼠(TaconicFarms，Inc.Oxnard，CA)，获得重15g至20g的小鼠并圈养在具有HEPA过滤空气的笼中(12小时亮/暗周期)。为了制备用于注射的细胞，将细胞混悬于基质胶(Matrigel)(BCBiosciences，FranklinLakes，NJ，U.S.A.)和RPMI1640(Mediatech，Manassas，VA，或LifeTechnologies，GrandIsland，NY)1∶1的混合物中。然后通过注射将细胞经皮下植入到小鼠的胁(plank)中。将细胞注射后14天中始终显示肿瘤生长的小鼠用于肿瘤研究。更具体地，当异种移植肿瘤达到约120mm3的肿瘤大小时(通过半椭圆体(semiepplipoid)的公式来计算，即，体积＝宽2×(长度/2))时，起始这些研究。
在该研究中，将具有肿瘤的小鼠根据其处理随机分为如下7组：组(1)无处理(即，阴性对照)；组(2)静脉内施用的多西他赛(20mg/kg)，每周一次；组(3)静脉内施用的多西他赛(20mg/kg)，每周一次，加上静脉内施用的雷公藤内酯甲(1.2mg/kg)，每周一次，多西他赛施用后立即施用，加上腹膜内施用的雷公藤内酯甲(6mg/kg)，每天一次；组(4)静脉内施用的多西他赛(20mg/kg)，每周一次，加上静脉内施用的雷公藤内酯甲(0.6mg/kg)，每周一次，多西他赛施用后立即施用，加上腹膜内施用的雷公藤内酯甲(3mg/kg)，每天一次；组(5)静脉内施用的多西他赛(20mg/kg)，每周一次，加上静脉内施用的雷公藤内酯甲(0.3mg/kg)，每周一次，多西他赛施用后立即施用，加上腹膜内施用的雷公藤内酯甲(1.5mg/kg)，每天一次；组(6)静脉内施用的雷公藤内酯甲(1.2mg/kg)，每周一次，加上腹膜内施用的雷公藤内酯甲(6mg/kg)，每天一次；以及组(7)腹膜内施用的雷公藤内酯甲(0.3mg/kg)，每周一次，加上腹膜内施用的雷公藤内酯甲(1.5mg/kg)，每天一次。图9示出了响应于上述条件的肿瘤体积的变化。与其他组相比，组(3)的处理方案示出肿瘤生长的显著延迟。雷公藤内酯甲本身并不显著地抑制肿瘤生长，但雷公藤内酯甲显著地增强了多西他赛的抗肿瘤作用。
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