背景技术：
许多环境和遗传因素导致皮肤癌的发生，而日光中紫外线(UV)则是其中最重要的危险因素(NicholsJA，KatiyarSK.Skinphotoprotectionbynaturalpolyphenols：anti-inflammatory，antioxidantandDNArepairmechanisms.ArchDermatolRes.2010；302：71-83.[PubMed：19898857]；ZhengD，BodeAM，ZhaoQ，ChoYY，ZhuF，MaWY，etal.Thecannabinoidreceptorsarerequiredforultraviolet-inducedinflammationandskincancerdevelopment.CancerRes.2008；68：3992-3998.[PubMed：18483286])。UV照射可以激活细胞信号转导通路，促进皮肤炎症和肿瘤的发生。如UV诱发DNA损伤，产生环丁烷嘧啶二聚体，可促进肿瘤发生(MabrukMJ，TohLK，MurphyM，LeaderM，KayE，MurphyGM.InvestigationoftheeffectofUVirradiationonDNAdamage：comparisonbetweenskincancerpatientsandnormalvolunteers.JCutanPathol.2009；36：760-765.[PubMed：19519607])。日光中UV光谱按波长可以分成三个类型：UVA(320-400nm)、UVB(280-320nm)和UVC(200-280nm)。但是，几乎所有的UVC照射被平流层的臭氧所吸收，90％-99％的UVA和1％-10％的UVB可到达地球表面(MatsuiMS，DeLeoVA.Longwaveultravioletradiationandpromotionofskincancer.CancerCells1991；3：8-12)。长期、大量的UV辐照可引起DNA损伤，导致皮肤炎症、免疫抑制、光老化和皮肤肿瘤(Jinlian，L.，Yingbin，Z.，andChunbo，W.(2007)J.Biomed.Sci.14，303-312)。某些光线性皮肤病，如慢性光化性皮炎、银屑病和皮肤癌与UV密切相关(SvobodovaA，WalterovaD，andVostalovaJ.Ultravioletlightinducedalterationtotheskin.BiomedPapMedFacUnivPalackyOlomoucCzechRepub.2006；150：25-38)。
环氧合酶-2(Cyclooxygenase-2，COX-2)是花生四烯酸(AA)合成各种前列腺素(PGs)限速酶(Vane，J.R.etal.(1998)Cyclooxygenases1and2.Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.，38，97-120)，参与人体炎症、肿瘤的发生，此外与许多病理过程密切相关。前列腺素E2(PGE2)是UV暴露下中皮肤组织中已发现的主要PG产物(TrippCS，BlommeEA，ChinnKS，HardyMM，LaCelleP，PentlandAP.EpidermalCOX-2inductionfollowingultravioletirradiation：suggestedmechanismfortheroleofCOX-2inhibitioninphotoprotection.JInvestDermatol2003；121：853-61.[PubMed：14632205])。已发现COX-2在皮肤癌、结肠癌、胃癌、胰腺癌、肺癌和乳腺肿瘤中过度表达(Subbaramaiah，K.etal.(2003)Cyclooxygenase2：amoleculartargetforcancerpreventionandtreatment.TrendsPharmacol.Sci.，24，96-102)。多种因素可以诱导COX-2的表达，UV辐照就是其中的因素之一(FischerSM.Iscyclooxygenase-2importantinskincarcinogenesis？JEnvironPatholToxicolOncol2002；21：183-91)。UV辐照下，COX-2表达增高，参与到炎症、细胞增殖、肿瘤的生长转移和新生血管生成等病理过程(Dubois，R.N.etal.(1998)Cyclooxygenaseinbiologyanddisease.FASEBJ.，12，1063-1073；Buckman，S.Y.etal.(1998)COX-2expressionisinducedbyUVBexposureinhumanskin：implicationsforthedevelopmentofskincancer.Carcinogenesis，19，723-729)。本发明阐述了UV辐照下COX-2活性增高，与皮肤炎症发生密切相关。
丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号传导级联，包括ERK1/2、c-JunN-末端激酶(JNK)和p38，与细胞应激、增殖、分化、迁移和凋亡等生理病理过程密切相关(DhillonAS，HaganS，RathO，KolchW.MAPkinasesignallingpathwaysincancer.Oncogene.2007：26：3279-3290.[PubMed：17496922]；KimEK，ChoiEJ.PathologicalrolesofMAPKsignalingpathwaysinhumandiseases.BiochimBiophysActa.2010；1802：396-405.[PubMed：20079433]；SegerR，KrebsEG.TheMAPKsignalingcascade.FASEBJ.1995；9：726-735.[PubMed：7601337])。其中，p38和JNKs信号通路作为MAPK应激信号通路中重要激酶，参与到UV诱导炎症的重要通路。P38是TNF-α、IL-1β和COX-2等的促炎因子(Vermeulen，L.，VandenBerghe，W.，Beck，I.M.，DeBosscher，K.，andHaegeman，G.(2009)TrendsBiochem.Sci.34，311-318)生成中的关键调节因子，p38也可以调控下游转录因子TNF-α的表达。
非类固醇抗炎药被广泛用以抑制前列腺素和COX-2的表达(FamaeyJP.Invitroandinvivopharmacologicalevidenceofselectivecyclooxygenase-2inhibitionbynimesulide：anoverview.InflammRes1997；46：437-46；FutakiN，TakahashiS，YokoyamaM，AraiI，HiguchiS，OtomoS.NS-398，anewanti-inflammatoryagent，selectivelyinhibitsprostaglandinG/Hsynthase/cyclooxygenase(COX-2)activityinvitro.Prostaglandins1994；47：55-9)。以往研究表明，COX-2抑制剂如塞来考昔可抑制UVB诱导的皮肤炎症和肿瘤形成(Wilgus，T.A.etal.(2003)InhibitionofcutaneousultravioletlightB-mediatedinflammationandtumorformationwithtopicalcelecoxibtreatment.Mol.Carcinog.，38，49-58)[19]。然而，临床研究显示，选择性COX-2抑制剂具有心血管毒性(BresalierRS，SandlerRS，QuanH，BologneseJA，OxeniusB，HorganK，etal.Cardiovasculareventsassociatedwithrofecoxibinacolorectaladenomachemopreventiontrial.NEnglJMed2005；352：1092-102；SolomonSD，McMurrayJJ，PfefferMA，WittesJ，FowlerR，FinnP，etal.Cardiovascularriskassociatedwithcelecoxibinaclinicaltrialforcolorectaladenomaprevention.NEnglJMed2005；352：1071-80)。因此，发现新型和安全的COX-2抑制剂成为研究热点。
中药作为民族瑰宝源远流长，在预防治疗疾病中发挥重要作用。红景天是一种传统中药，且具有抗缺氧、抗疲劳、抗衰老、抗肿瘤等保健及药用价值。药用植物来源于红景天属景天科Crassulaceae红景天属Rhodiola植物。目前，红景天经过化学成分预试验及提取分离，分得40多种化学物质，包括黄酮、苷、香豆素、挥发油、蒽醌、脂肪、蛋白质、有机酸多糖等。通过化学结构虚拟筛选分析，发现红景天中红景天苷(Salidroside)是一种新的COX-2抑制剂，本发明中通过免疫病理、生化实验及动物实验，验证其可干预UV导致的COX-2活性升高引起的皮肤炎症，发挥有效预防和/或治疗炎症的作用。
技术实现要素：
本发明的目的是：
1.发现红景天苷可以直接与COX-2相结合。
2.发现红景天苷抑制COX-2活性，降低COX-2及下游信号传导通路中p38、JNK的磷酸化水平及炎症因子IL-6和TNF-α的分泌。
3.发现UV导致的光线性皮肤病中COX-2及下游激酶及炎症因子表达增高。
4.确定红景天苷预防和/或治疗UV诱发COX-2活性异常增高导致的光线性皮肤病。
本发明是这样实现的
1.红景天苷可以直接和COX-2结合。
分子建模表明，红景天苷的糖基形成氢键可以与COX-2的蛋白质氨基酸残基ARG106和TYR341相结合。因此可以说红景天苷能够与COX-2结合。验证此预测进行体外蛋白质结合试验，结果表明，COX-2可以与红景天苷-琼脂糖4B珠相结合，但不能与琼脂糖4B珠结合。实验数据证实，红景天苷可直接与COX-2相结合。
分别用不同浓度的红景天苷(0，500，1000，2000μM)的处理HaCaT和JB6CL41的细胞，通过MTS测定法测量，结果表明，红景天苷对HaCaT细胞和JB6CL41细胞存活率无影响。
2.红景天苷抑制COX-2及下游p38或JNKs的活化及炎症因子IL-6和TNF-α的分泌。
1)观察不同红景天苷及预处理时间下，观察红景天苷对COX-2活化的抑制效果，红景天苷(400μM)、预处理12小时后红景天苷对COX-2活化具有明显抑制作用。
2)采用ELISA法测定细胞中PGE2(代表COX-2活性)含量。结果显示，细胞中PGE2的含量随红景天苷的预处理浓度、时间的增加而降低。
3)免疫印迹结果显示，经红景天苷预处理后UV辐照，HaCaT细胞和JB6CL41细胞中p38和JNKs磷酸化水平随预处理剂量、预处理时间的增加而成低表达状态。
4)测定HaCaT和JB6CL41细胞中IL-6和TNF-α的分泌情况，结果显示红景天苷可显著抑制这些细胞释放IL-6和TNF-α。
综上所述，红景天苷可抑制UV诱导COX-2活性异常增高，并抑制其下游p38或JNKs的活化，抑制IL-6，TNF-α等炎性细胞因子的释放。
3.UV导致的光线性皮肤病中COX-2表达增高。
1)COX-2、P38或JNKs的磷酸化水平在光线性皮肤病中均升高。5例光线性皮肤病患者的皮损和及2例正常人的皮肤样本中COX-2，p38和JNKs信号通路的磷酸化水平进行了检测。光线性皮肤病组织病理HE染色中，表皮角化过度，表皮增生，棘突延长，细胞间水肿，真皮浅血管扩张，真皮浅层及血管周围以淋巴细胞浸润为主。免疫组化结果显示，光线性皮肤病的皮损中COX-2，p-p38或p-JNKs表达水平增加。
2)UV辐照导致COX-2的表达和p38，JNKs的磷酸化增加。UV辐照后，HaCaT细胞和JB6CL41细胞中COX-2分别在15分钟和60分钟诱导产生，P38和JNKs磷酸化水平升高。
3)抑制COX-2表达可抑制UV辐照导致的p38和JNKs磷酸化水平升高。采用HaCaT细胞shMock和shCOX-2细胞系进行实验，并测量两者中PGE2(#1-#5)的产生量。结果表明，shCOX-2细胞中，COX-2和PGE-2的水平明显减少(#1和#3)。UV照射5分钟后，我们收获了shMock和shCOX-2#1和#3细胞。免疫印迹结果显示，与shMock细胞相比，shCOX-2#1和#3细胞中p38的活化明显受到抑制。然而，抑制COX-2表达对JNKs的激活则影响较小。
4.动物实验中，红景天苷抑制UV导致COX-2表达增产生的光线性皮肤病。
UV辐照小鼠产生皮肤炎症(日晒伤)的模型中，HE染色结果表现，表皮增生，细胞间水肿，棘突延长，炎细胞浸润明显。加用红景天苷，可抑制表皮增厚及炎症反应。免疫组化结果表明，UV可以显著增加未经红景天苷处理的小鼠表皮COX-2、p38、JNKs的活化水平，以及PGE2，IL-6和TNF-α含量显著升高。红景天苷处理组中，UV引起的小鼠表皮COX-2、p38、JNKs的活化水平，以及PGE2，IL-6和TNF-α的分泌则显著降低。
本发明具有如下优点：
1.本发明首次发现红景天苷可直接与COX-2相结合。
2.首次发现红景天苷抑制COX-2活性，降低COX-2及下游信号传导通路中p38、JNK和HA2X的磷酸化水平及炎症因子IL-6和TNF-α的分泌。
3.首次确定红景天苷预防和/或治疗UV诱发COX-2活性异常增高导致的光线性皮肤病。
4.根据以上发明优点推测，红景天苷可以预防和/或治疗UV诱发COX-2活性异常增高导致的其他炎症(银屑病、红斑狼疮等)和肿瘤(皮肤鳞状细胞癌、基底细胞癌等)。
附图说明
图1：本发明技术路线图。
图2：红景天苷，从红景天提取，可与COX-2直接结合。
(A)红景天甙的化学结构。
(B)COX-2和红景天苷结合分子模型。红景天的糖基形成氢键可以与COX-2的蛋白质氨基酸残基ARG106和TYR341相结合。
(C)红景天苷与COX-2的体外结合实验。用HaCaT细胞的细胞裂解液进行蛋白质体外结合实验。应用免疫印迹评估。泳道1是控制组(COX-2蛋白标准)；泳道2是阴性对照组，表明COX-2和琼脂糖凝胶4B珠之间没有结合；泳道3是阳性对照组，这表明，COX-2与红景天-琼脂糖4B珠结合。
(D)红景天苷HaCaT及JB6CL41细胞生存率无影响。通过MTS测定法测定不同红景天苷浓度(0，500，1000或2000μM)下及培养不同时间(24，48，72小时)的细胞存活率。使用酶标仪在490nm处测定各孔的吸光度。三次试验求平均值。
图3：红景天抑制COX-2的活性和其下游的p38或JNKs信号通路的活化，并且降低HaCaT和JB6CL41细胞中炎症因子的分泌。
(A)红景天苷对不能抑制COX-2表达。以1×106及2×106密度将HaCaT细胞和JB6CL41细胞接种到10cm的培养皿中培养24小时，然后在无血清培养基中饥饿培养12小时，UV照射前，我们以红景天苷(400μmol/L)预处理细胞3，6，12小时，同时，我们以不同浓度的红景天苷(100，200，400μmol/L)的预处理细胞12小时，分别进行实验，然后用40KJ/m2UV进行辐照。上述细胞裂解物(30微克)加入10％SDS-PAGE进行电泳。蛋白质带由Westernblot检测。
(B)红景天苷抑制HaCaT细胞和JB6CL41细胞中COX-2的活性，明显降低PGE2产生。塞来考昔，已知COX-2抑制剂，作为阳性对照。PGE2由PGE2测定试剂盒按照“材料和方法”中描述的指示进行测量。数据用平均值±SEM表示。和单独用UV辐照组相比，药物组对于PGE2具有明显抑制作用，(*p＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001)。
(C和D)红景天苷预处理后，UV照射下，HaCaT和JB6CL41细胞中p38和JNKs的磷酸化水平成剂量和时间依赖的方式基本上衰减。进行Westernblot检测。
(E)红景天苷抑制UV诱导IL-6和TNF-α分泌。与单独用UV照射组相比具有显著差异(*p＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001)。
图4：COX-2，P38和JNKs磷酸化水平在人类光线性皮肤病均高表达。
(A)光线性皮肤病和正常皮肤相比，H&E染色示：表皮角化过度，表皮增生，棘突延伸，细胞间水肿，真皮浅层血管扩张，血管周围炎性细胞浸润，以淋巴细胞为主。
(B-D)免疫组织化学分析来测定人类光线性皮肤病和正常皮肤组织中COX-2，磷酸化p38和磷酸JNKs的水平。五个组间数据比较以平均值±SEM表示。
图5：UV照射诱导HaCaT和JB6CL41细胞中COX-2的活性及p38，JNKs的磷酸化水平。
(A)UV照射可诱导HaCaT和JB6CL41细胞中的COX-2的表达。以1×106及2×106密度将HaCaT细胞和JB6CL41细胞接种到10-cm的培养皿中培养24小时，然后在无血清培养基中饥饿培养12小时，然后进行UV光照。裂解物30微克加入到含10％SDS明胶的SDS-PAGE中，用Westernblot检测。
(B、CandD)UV照射诱导的HaCaT和JB6C141细胞中COX-2的表达和p38，JNKs的磷酸化成时间-剂量依赖性表达水平明显增高。三组实验结果相似。
图6：抑制COX-2活性可抑制UV诱导HaCaT细胞中P38和JNKs的磷酸化。
(A)Westernblot检测COX-2活性抑制后，HaCaT细胞中P38和JNKs的表达情况。用shMock和shCOX-2(#1～#5)转染HaCaT细胞，以Westernblot进行结果分析。
(B)用ELISA测量shMock和shCOX-2(#1～#5)中PGE-2含量。将HaCaT及JB6CL41细胞(2×105)接种于六个孔培养皿，培养细胞生长融合至80％，用40KJ/m2的UV进行辐照18小时。接着测定上清液中PGE2的测量。shCOX-2#1和shCOX-2#3被用于进一步分析。数据表示为平均值±SEM(N＝3)，*P＜0.05，***P＜0.001，与shMock细胞相比，shCOX-2组PGE2显著下降。
(C)COX-2抑制后可抑制UV诱导p38和JNKs磷酸化水平。HaCaTshMock细胞和shCOX-2(#1和#3细胞)无血清培养基中饥饿培养12小时后进行UV(40KJ/m2)辐照。UV照射5分钟后收获细胞裂解物。用蛋白质免疫印迹法进行分析。三次试验求平均值。
图7：红景天苷对UV照射诱导下体内炎症的抑制作用。
(A)红景天苷可抑制UV引起的炎症反应和下调小鼠皮肤COX-2的表达，P38和JNKs的磷酸化水平。成年BABL/c小鼠背部皮肤用红景天苷预处理3小时预处理的后，以UV(100KJ/m2)进行照射24小时，采集皮肤样品，进行H&E染色和免疫组织化学检测。COX-2，P38，JNKs磷酸化主要在小鼠表皮中表达。十个样本数据以平均值±SEM表示。
(B和C)经红景天苷预处理后进行UV辐照，小鼠组织中PGE2，IL-6和TNF-α的分泌量均显著减少。分别用ELISA试剂盒检测IL-6和TNF-α浓度。数据以平均值±SEM表示，星号表示和单独用UV治疗组相比，红景天苷+UV组具有显著抑制作用(***P＜0.001)。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明进行详细地说明。需要说明的是，本发明的实施例仅限于对本发明进行说明，而没有限制作用。实施例中所涉及的有关试验方法和其它各种实验操作，均为本领域的常规技术，文中没有特别说明的部分，本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等予以实施。
统计分析：所有数据以为平均值±SEM表示。对数据进行单因素方差分析(ANOVA)或t检验。P＜0.05有统计学意义。
实施例一红景天苷可以直接和COX-2结合。
中药具有特殊的药理作用，寻找一种天然无毒的药物可为我们临床治疗疾病提供新方法、新思路。因此，我们在中药中应用基于结构的虚拟筛选来确定新的COX-2抑制剂。我们确定了红景天苷，它由从红景天提取，可以作为一个COX-2抑制剂。分子建模表明，红景天的糖基形成氢键可以与COX-2的蛋白质氨基酸残基ARG106和TYR341相结合。因此可以说红景天苷能够与COX-2结合。为了验证此预测，我们进行体外蛋白质结合试验，探究红景天苷是否可以与HaCaT细胞裂解物中的COX-2结合。结果表明，COX-2可以和红景天苷-琼脂糖4B珠相结合，但不能与琼脂糖4B珠结合。实验数据证实，红景天苷可直接与COX-2相结合。
为了确定红景天苷作用下HaCaT和JB6CL41的细胞存活率，我们将其用分别用不同浓度的红景天苷(0，500，1000，2000μM)的处理后，通过MTS测定法测量，结果表明，当浓度高达2000μM时，分别培养24，48，72小时后，红景天苷对HaCaT细胞和JB6CL41细胞存活率无显著影响。综上所述，红景天苷可以直接与COX-2相结合，且对HaCaT细胞和JB6CL41细胞存活率无影响。
研究所用的红景天苷(纯度＞99％)购置于上海比翼化工科技有限公司(中国上海)。
细胞培养：人类表皮角质形成细胞永生化细胞株株，小鼠表皮JB6C141细胞株(JB6)购买于ATCC，Virginia，USA(ATCC，USA)。HaCaT以DMEM作为培养基(内含100u/ml青霉素和100u/ml链霉素，10％FBS)，将其置于37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱。JB6细胞株以MEM作为培养基(内含5％FBS)，将其置于37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱。所有操作均严格按照ATCC说明进行。
MTS法：将细胞以1000/孔的密度接种到96孔板，37℃，5％CO2培养箱中培养24小时，计数细胞的存活率。然后以不同浓度的红景天苷(0，500，1000，2000μM/L)分别孵育细胞不同时间(24，48，72)。孵育完成后，用MTS测定试剂盒(Promega，麦迪逊，WI)检测细胞存活率，根据说明，使用酶标仪在490nm处测定各孔的吸光度。
分子模拟：我们从蛋白质数据库(PDB)下载COX-2的三维结构，用于对接研究和与红景天苷的结合，COX-2(PDB代码1PXX)是一种具有分辨率的X射线衍射结构。用X射线晶体学来检测红景天苷-COX-2的实际结构并从中国医学文献数据库中进行虚拟配体筛选。依照标准程序，利用AUTODOCK软件进行建模研究和结构分析。
蛋白质体外结合实验：HaCaT细胞的细胞裂解物(1mg)分别与红景天琼脂糖4B及琼脂糖4B(作为对照)在缓冲液[50mM磷酸酯(pH值7.5)，5mM的EDTA，150mM的氯化钠，1mM的二硫苏糖醇(DTT)，0.01％NP-40，2μg/ml牛血清白蛋白，0.02毫苯甲基磺酰氟(PMSF)和1μg/ml蛋白酶抑制剂混合物]中进行孵育。在4℃下轻轻摇动孵育过夜后，将串珠用缓冲液[50mmol/L的Tris-HCl(pH为7.5)，5mmol/LEDTA，150mmol/L的NaCl，1mmol/LDTT，0.01％NP-40和0.02mmol/LPMSF]洗涤五次，然后将串珠结合蛋白用Western来分析。
实施例二红景天苷抑制COX-2的激活及其下游的p38或JNKs的活化，并且降低HaCaT和JB6CL41细胞中炎症因子的分泌。
因为红景天可直接与COX-2结合，接下来我们探究其是否能抑制COX-2的活性。首先，我们用红景天(400μM)，40KJ/m2，分别照射15分钟(HaCaT细胞)及60分钟(JB6CL41细胞)，观察不同预处理时间下，两者细胞中红景天苷对COX-2水平的抑制效果，并观察到预处理12小时后红景天苷对其具有抑制作用。其次，我们用红景天(400μM)，40KJ/m2，分别照射15分钟(HaCaT细胞)及60分钟(JB6CL41细胞)，观察不同红景天苷预处理剂量对于其的作用，观察到400μM预处理红景天苷对COX-2具有抑制作用。PGE2代表COX-2活性，接下来，我们用ELISA对于两者细胞中PGE2含量进行了测定。结果显示，细胞中PGE2的含量随红景天苷的预处理浓度的增高而降低，预处理时间的延长而降低。实验表明，红景天苷能抑制HaCaT细胞和JB6CL41细胞中COX-2的活性。我们接着研究了红景天苷对COX-2的下游信号通路的影响。免疫印迹的结果表明，经红景天苷预处理，UV照射后，HaCaT细胞和JB6CL41细胞中p38和JNKs磷酸化水平随预处理剂量的增加，预处理时间的延长整体成低表达状态。为了确认红景天苷是否能抑制炎症过程，我们测定了HaCaT和JB6CL41细胞中IL-6和TNF-α的分泌情况。结果表明红景天苷可显著抑制这些细胞释放IL-6和TNF-α。综上所述，红景天苷可抑制UV诱导COX-2活性，然后抑制其下游的p38或JNKs的活化，由此抑制IL-6，TNF-α等炎性细胞因子的释放。
UV，试剂和抗体：SUV灯(UVA-340nm)购置Q-Lab公司(Cleveland，OH)。SUV中，UVA、UVB辐照各占92.5％、7.5％，以配套的测量仪测量其剂量。在以下描述中SUV剂量由UVA取代表述。Eagle的MEM，Dulbecco的DMEM，FBS均购自“Gibco公司”(美国)。COX-2抗体，p-p38抗体(Tyr180/Tyr182)，所有的p38抗体，P-JNKs抗体(Thr183/Thr185)，所有的JNKs抗体等主要抗体均购自CellSignalingTechnology公司(美国)，内参蛋白和双抗购自于“圣克鲁斯公司”(美国)和“EarthOx”生命科学公司(美国旧金山)。前列腺素E2(PGE2)的EIASA试剂盒购自CaymanChemical公司，IL-6，TNF-αELISA试剂盒购自达科为生物科技有限公司(中国北京)购买。其他普通试剂购自于其他公司，品质上乘。
前列腺素E2(PGE2)，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)测定：将HaCaT及JB6CL41细胞(2×105)接种于六个孔培养皿，培养细胞生长融合至80％，然后在无血清培养基中饥饿培养12小时。40kJ/m2辐照之前，细胞以400μmol/L的红景天苷预处理3，6，12小时，另外分别以不同浓度红景天苷(0，100，200，或400μmol/L)，及塞来昔布(1μmol/L)的预处理细胞，孵育12小时，辐照18小时后收获。用PGE-2EIA试剂盒(CaymanChemicalCompany)测定释放到培养基中的PGE-2含量。塞来昔布组用作阳性对照。用IL-6和TNF-αELISA试剂盒测定IL-6和TNF-α释放量。小鼠皮肤组织释放PGE2，TNF-α和IL-6用相应的ELISA试剂盒根据标准进行测定。
Western印迹：以1×106及2×106密度将HaCaT细胞和JB6CL41细胞接种到10-cm的培养皿中培养24小时，然后在无血清培养基中饥饿培养12小时，以消除FBS对MAPK的影响。将细胞以不同剂量SUV(0，10，20，30，40，50KJ/m2)分别在不同的时间(0，15，30，60分钟)条件下进行孵育后收获。为了研究红景天苷的效果，SUV照射前，我们以红景天苷(400μmol/L)预处理细胞3，6，12小时，同时，我们以不同浓度的红景天苷(100，200，400μmol/L)的预处理细胞12小时，分别进行实验。
用裂解缓冲液(50mM的Tris-HCl(pH为7.4)，150mMNaCl，1mMEDTA中，1mMEGTA，10mg/mL抑肽酶，10mg/mL亮肽素，5mmPMSF，1mM含有1％TritonX-100DTT)1以2,000rpm的速率进行声波降解，离心操10分钟后收获细胞。用Bradford方法进行蛋白质含量测定。裂解物的蛋白质加入到含10％SDS明胶的SDS-PAGE中，转染至PVDF膜(Millipore，美国)上。用5％脱脂奶粉或5％BSA封闭后，将此膜与一体进行4℃过夜，孵育，与辣根过氧化物酶标记二抗进行反应后，通过ECL系统(BIO-RAD，USA)使该蛋白质条带显像。
实施例三UV导致的光线性皮肤病中COX-2表达增高。
1)COX-2、P38或JNKs的磷酸化水平在人光线性皮肤病(慢性光化性皮炎)中均升高。
紫外线(UVB)照射可引起的机体氧化损伤和炎症发生，最终增加皮肤癌变风险，而COX-2，p38，JNKs信号通路则参与到此过程中。光线性皮肤病与UV辐射密切相关，因此，我们对5例光线性皮肤病患者的皮损和及2例正常人的皮肤样本中COX-2，p38和JNKs信号通路的磷酸化水平进行了检测。光线性皮肤病组织病理的H&E染色与正常皮损相比，表皮角化过度，表皮增生，棘突延长，细胞间水肿，真皮浅血管扩张，真皮浅层及血管周围以淋巴细胞浸润为主。免疫组化结果显示，光线性皮肤病的皮损中COX-2，p-p38或p-JNKs表达水平增加。以上结果表明，COX-2，p38和JNKs信号通路与光线性皮肤病的发生有关。
免疫组化：光线性皮肤病(慢性光化性皮炎)患者皮肤组织切片(5μm)进行微波脱蜡，枸缘酸柠檬酸钠缓冲液处理10分钟进行抗原修复。然后用3％过氧化氢酶处理10分钟，5％山羊血清室温下封闭1小时，后进行4℃过夜。如下：1∶100的抗COX-2抗体；1∶200抗磷酸化p38(Tyr180/Tyr182)(CellSignalingTechnology公司)和1∶200的抗p-JNKs(Thr183/Thr185)。然后经二抗，DAB显色，苏木复染观察一抗在组织细胞中的表达情况。切片经酒精二甲苯逐级分化，脱水后封片镜检。
实施例四UV照射诱导的HaCaT和JB6C141细胞中COX-2的表达和p38，JNKs的磷酸化。
为了进一步研究光线性皮肤病的机理，我们应用HaCaT细胞或小鼠表皮JB6CL41细胞系模拟炎症过程。对COX-2，p38和JNKs的磷酸化水平以剂量和时间依赖性进行了研究。结果表明，以40KJ/m2的UV照射后，HaCaT细胞和JB6CL41细胞中COX-2分别在15分钟和60分钟诱导产生。另外，两种细胞中P38和JNKs磷酸化水平开始升高，并于5分钟后达到最高，然后开始下降。这些数据与光线性皮肤病免疫组化结果相似，我们可以用上述细胞模型体外模拟光线性皮肤病。
动物实验：6-8周龄成年Balb/c小鼠是从疾病预防中心(中国湖北)购买，研究之前，自由进食水两周。将小鼠分成三组：安慰剂组(n＝10)，安慰剂/SUV组(n＝10)，50mg/kg的红景天苷/SUV组(n＝10)。小鼠实验前24小时进行剃毛。在安慰剂组中，小鼠的背部皮肤，用丙酮涂3小时。在安慰剂/SUV组，小鼠的背部皮肤用用丙酮涂3小时后，进行100KJ/m2的SUV辐照。在50mg/kg红景天苷/SUV组，50mg/kg的红景天苷加入丙酮后涂抹小鼠背部皮肤3小时后，进行100KJ/m2的SUV辐照。照射后24小时后，将小鼠安乐死，并收集曝光部位皮肤样品。一半样品以4％多聚甲醛固定用以HE染色(H&E)染色和免疫组织化染色(IHC)。其它样品冷冻，用于ELISA分析。所有动物研究操作均符合华中科技大学实验动物中心准则。
实施例五抑制COX-2表达可抑制UV诱导的HaCaT细胞中p38和JNKs的磷酸化水平。
应用上述细胞模型，我们探究了p38，JNKs及COX-2是否存在彼此调控。据报道，在UV照射下，p38和JNKs可以调节COX-2表达水平。然而，目前还不清楚COX-2是否能够调控p38和JNKs的活化。因此我们采用HaCaT细胞shMock和shCOX-2细胞系进行实验，并测量两者中PGE2(#1-#5)的产生量。结果表明，shCOX-2细胞中，COX-2和PGE-2的水平明显减少(#1和#3)，接下来我们对此进行进一步的研究。接着，以40KJ/m2的UV照射5分钟后，我们收获了shMock和shCOX-2#1和#3细胞。免疫印迹结果显示，与shMock细胞相比，shCOX-2#1和#3细胞中p38的活化明显受到抑制。然而，抑制COX-2表达对JNKs的激活(图3C)则影响较小。已有报道指出，COX-2，p38和JNKs在紫外线相关性皮肤疾病中具有重要作用。我们实验结果表明，COX-2能够参与UV辐照引起的p38和JNKs激活。因此，COX-2可以作为光线性皮肤病治疗的理想靶点。
实施例六体内实验中，红景天苷对UV诱导的反应的作用。
UV照射引起表皮增厚和炎症因子的分泌增加，从而导致皮肤炎症的发生。为了进一步研究红景天苷的抗炎作用，我们以UV诱导皮肤炎症的小鼠为模型，评估红景天苷效果。HE染色结果表明，100KJ/m2UV照射下，与正常组相比，实处理治疗，可抑制表皮增厚及炎症反应。我们观察表皮COX-2，P38和JNKs磷酸化水平。免疫组化结果表明，与UV+丙酮处理的小鼠相比，UV可以显著增加未经处理组小鼠表皮COX-2，磷酸化p38和JNKs的水平。下一步，我们测试红景苷对小鼠皮肤组织中PGE2，IL-6和TNF-α的影响。UV照射组与未暴露组相比，PGE2，IL-6和TNF-α含量显著升高。但是，与红景天苷处理组相比，PGE2，IL-6和TNF-α的分泌则显著降低。总之，我们研究证明，红景天苷可抑制体内COX-2活化，抑制皮肤炎症反应。
环氧合酶-2(Cyclooxygenase-2，COX-2)是花生四烯酸(AA)合成各种前列腺素(PGs)限速酶，参与人体炎症、肿瘤的发生，此外与许多病理过程密切相关。前列腺素E2(PGE2)是UV暴露下中皮肤组织中已发现的主要PG产物。已发现COX-2在皮肤癌、结肠癌、胃癌、胰腺癌、肺癌和乳腺肿瘤中过度表达。多种因素可以诱导COX-2的表达，UV辐照就是其中的因素之一。UV辐照下，COX-2表达增高，参与到炎症、细胞增殖、肿瘤的生长转移和新生血管生成等病理过程。本发明阐述了UV辐照下COX-2活性增高，与皮肤炎症发生密切相关。
通过以上实施例，结合COX-2的生理、病理生理学方面的分子生物学功能，可以看出，除了在本发明中红景天苷通过结合并抑制COX-2活性预防和/或治疗COX-2活性异常增高的皮肤炎症，如UV诱发的光线性皮肤病(日晒伤和慢性光化性皮炎)之外，推测红景天苷也可以通过结合并抑制COX-2的活性预防和/或治疗COX-2活性异常增高的其他皮肤炎症和肿瘤，如各型银屑病、红斑狼疮、日光角化症、黑色素瘤、皮肤鳞癌等，以及人体其他系统器官组织COX-2活性异常增高的炎症和肿瘤。同时，推测红景天苷更大的用药剂量，可能产生更好的效果。