本发明涉及一种弱毒疫苗及其制备方法和用途，特别涉及一种山羊痘、羊口疮二联细胞弱毒疫苗及其制备方法和用途，本发明属于兽医生物制品领域。
背景技术：
羊痘病毒(Capripoxvirus,CPV)为痘病毒科脊椎动物痘病毒亚科羊痘病毒属成员。该属成员有山羊痘病毒(Goatpoxvirus,GTPV)、绵羊痘病毒(Sheeppoxvirus,SPV)和牛结节性疹块病病毒(Lumpyskindiseasevirus,LSDV)。羊痘是由羊痘病毒引起的一种急性、接触性传染病，被世界动物卫生组织(FAO/OIE)列为93种必须报告的动物疫病之一，我国将其列为一类传染病。其发病率可达75％以上，死亡率可达50％以上，羔羊死亡率可达100％，同时还可导致母羊流产。羊痘是古老的疾病之一，1879年Hansen首次报道了挪威的山羊痘。后来，陆续在世界其他地区报道了该病。广泛分布于非洲、中东、印度次大陆、北欧、地中海各国及德国、澳大利亚、美国等,特别是非洲北部、中东和亚洲的部分国家流行较为严重。与我国接壤的周边国家，如印度、孟加拉、尼伯尔、巴基斯坦、俄罗斯、蒙古等不少国家均有本病的流行。近几年我国的江苏、广东、贵州、山东、浙江、广西、甘肃、黑龙江等地均有本病流行。该病的爆发和流行使家畜的生产力下降，活畜及畜产品贸易停滞，给养羊业的发展造成极大的经济损失。羊传染性脓疱病(Contagiousecthyma,CE)又名羊传染性脓疱性皮炎(Contagiouspustulardermatitis)，俗称“羊口疮(Orf)”，是由副痘病毒成员羊传染性脓疱病毒(Orfvirus,ORFV)感染引起山羊、绵羊和人的一种急性、接触性和嗜上皮性的人兽共患传染病,以在患羊的口唇、蹄、乳房、外阴等处皮肤和黏膜形成红斑、丘疹、脓疮、溃疡和疣状厚痂为特征。世界动物卫生组织(OIE)将该病列为需申报类动物疾病，我国将其列为一类动物疫病。该病最早发现于欧洲，目前，几乎在所有养羊国家和地区均存在。自然情况下主要侵害绵羊和山羊，山羊较为多发。此外，骆驼、牛、鹿、麝牛、猫、幼犬、猴和人均有易感性。本病常呈群发性流行的趋势，3～6月龄羔羊最易感染，常引起群体发病，尤其是饲养密集的羊群。范春玲等报道了我国2006年在北京市亚福动物养殖中心暴发该病，该病传播速度快，发病率高达95.4％。近年来随着肉羊产业的发展和羊频繁流动，该病时有发生，甚至在一些大型种羊场都有该病的流行，给养羊业带来了巨大的经济损失，严重危害肉羊产业的健康发展。更为严重的是，此病可以通过伤口感染饲养人员，感染者表现为手背、指间和前臂部疱疹和破溃。例如2005年8月福建省永安市有8名羊场养殖工人因感染羊传染性脓疱病毒而发病。可见，羊传染性脓疱不但严重危害肉羊产业的健康发展，而且威胁人类的身体健康，是一种危害较为严重的人畜共患传染病。近年来，国内外羊痘、羊口疮频繁爆发，而羊痘、羊口疮尚无有效的治疗方法，免疫接种是预防羊口疮唯一行之有效的措施。目前尚无一种能够一针防两病的山羊痘、羊口疮二联细胞弱毒疫苗。目前羊痘、羊口疮疫苗的研发和应用主要集中在常规疫苗，如灭活疫苗和细胞弱毒疫苗，以及新型疫苗，如囊膜亚单位疫苗、核酸疫苗和重组疫苗上。但是目前，羊痘、羊口疮新型疫苗的研制还处于试验阶段，且新型疫苗往往制备过程繁琐、技术要求高，应用于临床还有很长一段路要走。羊痘、羊口疮灭活疫苗虽然国内外学者均有研究，但其免疫效果有限，从未真正应用于临床。目前，在临床上应用较为广泛的仍然是羊痘、羊口疮弱毒疫苗，因为它具有用量少，能诱导机体产生较强的细胞免疫和体液免疫能力，且产生免疫保护力的时间持久的特点。在国内，虽然羊口疮弱毒疫苗在青海省畜牧兽医科学院兽医研究所和甘肃省畜牧兽医研究所均有研制，但其生产工艺复杂、落后，冻干保护剂不耐热等诸多生产工艺瓶颈问题，是该疫苗无法量产，目前该疫苗处于有品无苗的局面。另外，该弱毒都是上世纪80年代前后的毒株，目前国内流行毒可能发生变异，很难保证其免疫的有效性。山羊痘弱毒疫苗在国内几家疫苗厂家均有生产，但该疫苗生产过程需要羊睾丸原代细胞，冻干保护剂不耐热等工艺问题，使该疫苗生产、运输及保存成本过高。山羊痘、羊口疮病毒二联细胞弱毒疫苗研究，尚属空白。国内外学者现已证实，羊痘弱毒疫苗对处于同科的羊口疮病毒具有部分交叉免疫保护。因此，研制一种抗原谱广、免疫原性好、制苗工艺简单的山羊痘、羊口疮病毒二联细胞弱毒疫苗，对预防国内羊痘、羊口疮爆发和流行具有一加一大于二的现实意义。本发明选用自行分离获得的ORFV湖北通山县分离毒株(OrfvirusHB09株)和GTPV河南信阳市分离毒株(GoatpoxvirusHN2010株)作为疫苗研制的候选毒株，利用牛/羊睾丸支持细胞系和鸡胚成纤维原代细胞传代致弱，培育出符合“兽用新生物制品质量标准”的ORFV和GTPV弱毒疫苗株，配比一定比例的耐热冻干保护剂制备冻干弱毒疫苗。攻毒保护试验结果显示所制备的山羊痘、羊口疮二联细胞弱毒疫苗能够产生有效的免疫保护力。因此，本发明利用ORFV、GTPV流行毒株研制安全、高效的弱毒疫苗对于羊痘、羊口疮的防治具有重要的现实意义。
技术实现要素：
针对现有羊痘、羊口疮弱毒疫苗的不足，本发明的目的在于提供一种山羊痘、羊口疮二联细胞弱毒疫苗及其制备方法，以实现用简单实用的制备方法生产出产量高、抗原谱广、稳定性好、成本低、安全可靠的疫苗。本发明的目的是通过如下技术方案实现的：用MDBK细胞系对湖北株羊口疮病阳性料进行适应分离的OrfVirusHB-TS09株病毒传代至17代，再将该细胞毒接种新生牛睾丸原代细胞进行传代致弱，传代至55代时进行本动物安全试验发现，该细胞毒已致弱。然后继续传代至85代，每隔五代取病毒(滴度TCID50不低于10-6.0/0.1mL)的细胞毒进行本动物安全试验，证实该毒株传代至55代后对绵羊羔羊、成年绵羊以及山羊羔羊以及成年山羊均安全。其中，选择OrfVirusHB-TS09第65代细胞传代致弱毒作为羊传染性脓疱病毒弱毒疫苗株，命名为羊传染性脓疱病毒细胞传代致弱毒OrfVirusHB-TS09F65株，分类命名为羊传染性脓疱病毒细胞传代致弱毒，并于2014年3月19日送交中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号CCTCCNO：V201406，保藏地址在武汉大学。用羊睾丸原代细胞对河南株山羊痘病料进行适应分离的GoatpoxvirusHN2010株病毒传代至16代，GTPV毒价lgTCID50≥3.5时，将该细胞毒接种鸡胚成纤维原代细胞进行传代致弱，传代至36代时进行本动物安全试验发现，该细胞毒在传代至28代时已致弱。然后继续在羊睾丸原代细胞传代至56代，分别取传代致弱毒21代、25代、30代、35代、40代、45代、50代7代次细胞毒(各代次细胞病毒TCID50不小于103.5/0.1mL)进行本动物安全试验，证实接种各代次GoatpoxvirusHN-XY2010株致弱毒株的羊只组在观察期内，各试验组羊只，在口腔粘膜均出现红点，在接种后3天自行消失。对照羊正常。证明致弱毒株GoatpoxvirusHN-XY2010株对绵羊、山羊均安全、无致病性，是一株安全的疫苗弱毒株。选择GoatpoxvirusHN-XY2010株第43代致弱毒株作为羊痘病毒弱毒疫苗株，命名为山羊痘病毒细胞传代致弱疫苗株GoatpoxVirusHN-XY2010F43株，分类命名为山羊痘病毒细胞传代致弱疫苗株GoatpoxVirusHN-XY2010F43株，并于2015年1月14日送交中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号CCTCCNO：V201503，保藏地址在武汉大学。本发明的一种山羊痘、羊口疮病毒二联细胞弱毒疫苗，其特征在于其有效成分包括山羊痘病毒细胞传代致弱毒以及羊传染性脓疱病毒细胞传代致弱，其中，所述的山羊痘病毒细胞传代致弱毒为山羊痘毒细胞传代致弱毒GoatpoxVirusHN-XY2010F43株，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2015年1月14日，保藏编号为CCTCCNO：V201503，所述的羊传染性脓疱病毒细胞传代致弱毒为羊传染性脓疱病毒细胞传代致弱毒OrfVirusHB-TS09F65株，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2014年3月19日，保藏编号为CCTCCNO：V201406。此外，本发明还提供了一种制备山羊痘、羊口疮病毒二联细胞弱毒疫苗的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)病毒抗原的制备选生长良好布满单层的新生牛睾丸原代细胞和新生羊睾丸原代细胞，倾去营养液，按原营养液体积的1-10％分别接种所述的羊传染性脓疱病毒细胞传代致弱毒OrfVirusHB-TS09F65株以及山羊痘病毒细胞传代致弱毒GoatpoxVirusHN-XY2010F43株的病毒液，吸附5-15分钟后加DMEM维持液，调PH至7.0～7.2，加青霉素、链霉素各100单位/ml，于37℃、5％CO2浓度培养箱中进行培养；培养40～72h，细胞病变达到75％以上时收获病毒，置-20℃冰箱反复冻融两次，然后进行无菌检验、安全检验、支原体检验、外源病毒检验，达到《中华人民共和国兽医生物制品质量标准》中规定的各项指标，且病毒滴度不低于10-3.5TCID50/0.1ml时，作为山羊痘、羊传染性脓疱病毒细胞传代致弱毒抗原，备用；(2)疫苗的配制和冻干将步骤(1)制备的各项指标都合格的山羊痘、羊传染性脓疱病毒细胞传代致弱毒抗原以体积比1︰1混合，再与耐热冻干保护剂以体积比1︰1的比例混匀后，以2mL/瓶无菌条件下封装于链瓶内，在低温冷冻干燥机内进行冻干，即为山羊痘、羊口疮病毒二联细胞弱毒疫苗，将其在2℃-8℃下保存。在本发明所述的方法中，优选的，按原营养液体积的5％分别接种所述的羊传染性脓疱病毒细胞传代致弱毒以及山羊痘病毒细胞传代致弱毒的病毒液，吸附10分钟后加DMEM维持液，调PH至7.0～7.2，加青霉素、链霉素各100单位/ml，于37℃、5％CO2浓度培养箱中进行培养。在本发明所述的方法中，优选的，所述耐热冻干保护剂中含有海藻糖30～70g/L，脱脂奶粉10～30g/L，聚乙烯吡咯烷酮10～30g/L，明胶5～15g/L，精氨酸0.5～4g/L，维生素C1～5g/L，剩余成分为超纯水。更优选的，所述耐热冻干保护剂中含有海藻糖50g/L，脱脂奶20g/L，聚乙烯吡咯烷酮20g/L，明胶10g/L，精氨酸1.5g/L，维生素C2.5g/L，剩余成分为超纯水。所述的耐热冻干保护剂的制备方法包括：(1)对可高压灭菌的物质：海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、脱脂奶粉、明胶按各自比例溶于超纯水中，加热至50～60℃溶解后，116℃灭菌30分钟；(2)将不耐高温的物质精氨酸、维生素C也按各自比例溶于超纯水中，用孔径为0.22μm滤膜过滤除菌：各组分别将(1)、(2)两组份混合，得到所述的耐热冻干保护剂。相较于现有技术，本发明的优点在于：1、选用流行毒株的细胞传代致弱毒来制备疫苗，保证了疫苗的免疫保护力；2、利用本实验室研制的针对GTPV和ORFV病毒的耐热冻干保护剂，解决了痘病毒活疫苗仅能在-15℃条件下保存和运输的瓶颈技术，使该疫苗储存、运输更方便。本发明将为临床上针对羊痘、羊口疮病的防控以及羊痘、羊口疮病毒在羊群中的清除提供了重要的物质基础和技术支撑，具有广阔的应用前景。具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随具体实施例的描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不多本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明精神和范围下可以对本发明的技术方案和细节形式和形式进行修改...