本发明涉及植物提取领域，具体涉及一种龙胆提取物及其制备方法和用途。
背景技术：
1956年Harman提出了自由基衰老学说[Harman,D.Aging:A theory based on free radical and radiation chemistry.J.Gerontol.1956,11:289-300.]，其认为过多的自由基是造成生物老化的重要原因。根据这一理论，体内过量的活性氧自由基与不饱和脂肪酸作用产生丙二醛等物质，丙二醛将与细胞膜上的蛋白质等作用生产褐色素，沉淀于皮肤便成为各种色斑。过量的自由基还能使皮肤内的胶原纤维、弹性纤维发生交联和变性、变脆、失去弹性，当皮肤水分不足时，容易使弹性纤维断裂，出现暗纹、细纹、皱纹等皮肤老化现象。此外，环境中的离子辐射以及诸如空气污染与化学物质等的环境污染物，也会使生物体内不断的产生自由基。例如环境中的紫外线会使皮肤真皮中的纤维母细胞及粒线体受到刺激，进而释放出超氧阴离子，而过量的超氧阴离子则会转换成其它破坏性更强的自由基。虽然人体内具有能够维持氧化与抗氧化之间平衡状态的抗氧化防御系统，用以减缓活性氧及自由基的产生，但若是长期过度的曝晒在阳光下，则人体内大量产生的自由基会导致皮肤的抗氧化防御能力降低，造成皮肤的伤害，例如光老化、表皮皱纹、皮肤免疫力失调等。抗氧剂是具有捕捉自由基能力的物质，可以清除皮肤中的活性自由基，减轻自由基引起的皮肤氧化应激损伤，从而改善由氧化应激等造成的皮肤老化。目前已知有维生素E、维生素C等生物体内的清除自由基型抗氧化剂，另外也报道了植物来源的抗氧化剂如莲花、梅果提取物等(专利文献CN201110158540.9含有莲花提取物和乌梅提取物作为有效成分而具有抗氧化活性的皮肤外用剂组合物)。
关于皮肤黑色素的形成，目前研究表明主要是由于黑素细胞内的生物化学反应引起，即酪氨酸在作为催化剂的酪氨酸酶的作用下，生成多巴醌，再通过酶的催化作用或非酶的氧化作用形成黑色素。关于抑制上述黑色素生成的美白活性物，通常以抑制酪氨酸酶活性为主要靶点。来源于植物提取物的酪氨酸酶抑制剂作为潜在的美白活性物，同时又具有安全性和对皮肤低刺激性的预期，目前已有各种开发的报道，例如专利文献CN201310411195.4白蔹提取物美白功效的检测方法；CN201310382406.6白木香果皮提取物在制备美白化妆品中的应用。
皮肤老化的原因可以分为光老化和内因引起的老化，UV暴露引起的光老化会引起皮肤弹性蛋白酶的活性增加。弹性蛋白酶(Elastase)分布于多种组织和细胞中，弹性蛋白酶活性增加可导致皮肤弹性纤维的水解，从而加速真皮内胶原蛋白和弹性蛋白的分解，使皮肤失去弹性，出现皱纹等皮肤老化现象。目前已知有植物来源的抗老化活性物具有弹性蛋白酶抑制作用，如蓼蓝(专利文献CN200680023570.6皮肤外用剂)、香豌豆(专利文献CN200680009020.9含有香豌豆提取物的化妆料)等。
龙胆属(Gentiana(Tourn.)L.)植物在中国大陆、俄罗斯、日本、朝鲜等均有分布，生长于海拔400米至1,700米的地区。中国有龙胆属240多种，多产于西南高山地区，北京周边只有少数几种，与杜鹃、报春合称为世界三大高山花卉。龙胆也是重要的药用植物，其根和根茎入药具有清热、泻肝、定惊之功效。龙胆根含有龙胆苦苷、龙胆碱、三萜类等化合物。未见龙胆作为酪氨酸酶抑制剂、弹性蛋白酶抑制剂、抗氧化活性剂和抗老化活性剂的应用的报道。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供了一种龙胆提取物及其制备方法和用途。本发明的龙胆提取物的制备方法简单，制得的龙胆提取物可以作为酪氨酸酶抑制剂、弹性蛋白酶抑制剂、抗氧化活性剂和抗老化活性剂的应用； 进一步优选在制备护肤品或化妆品中的应用。
本发明提供了一种龙胆提取物的制备方法，其采用下述方法中的任意一种，
方法一、包括下述步骤：将龙胆与溶剂混合，提取，过滤，减压脱除溶剂，即可；
方法二、包括下述步骤：
(1)将龙胆与溶剂混合，提取，过滤，减压脱除溶剂，即可得到龙胆粗提物；
(2)将龙胆粗提物溶解于水后，上样到树脂填充柱，依次用水和乙醇溶液洗脱，分别收集洗脱液，减压脱除乙醇和水，即可。
其中，所述的龙胆一般为龙胆属(Gentiana(Tourn.)L.)植物，较佳地为高山龙胆(Gentiana algida Pall.)、蓝玉簪龙胆(Gentiana Veitchiorum Hemsl)、长白山龙胆(Gentiana jamesii Hemsl.)、大花龙胆(Gentiana szechenyii Kanitz)、大理龙胆(Gentiana taliensis Balf.f.&Forrest)、多花龙胆(Gentiana striolata T.N.Ho)、高贵龙胆(Gentiana gentilis Franch)、红花龙胆(Gentiana rhodantha Franch.ex Hemsl.)、黄花龙胆(Gentiana flavomaculata Hayata)、景天叶龙胆(Gentiana crassula H.Smith)、菊花参(Gentiana sarcorrhiza Ling&Ma ex T.N.Ho)、林芝龙胆(Gentiana nyingchiensis T.N.Ho)、流苏龙胆(Gentiana panthaica Prain&Burk.)、美丽龙胆(Gentiana formosa H.Smith)、秦艽(Gentiana macrophylla Pall.)、青藏龙胆(Gentiana futtereri Diels&Gilg)、丝萼龙胆(Gentiana filisepala T.N.Ho)、天山秦艽(Gentiana tianschanica Rupr.)、西域龙胆(Gentiana clarkei Kusnez.)、锡金龙胆(Gentiana sikkimensis C.B.Clarke)、喜马拉雅龙胆(Gentiana venusta(G.Don)Wall.ex Griseb.)、小龙胆(Gentiana parvula H.Smith)、新疆龙胆(Gentiana karelinii Griseb.)、新疆秦艽(Gentiana walujewii Regel&Schmalh.)、秀丽龙胆(Gentiana bella Franch.ex Hemsl.)、银萼龙胆(Gentiana albicalyx Burk.)、玉山龙胆(Gentiana scabrida Hayata)、云南龙胆(Gentiana yunnanensis Franch.)、中国龙胆(Gentiana chinensis Kusnez.)、 珠峰龙胆(Gentiana stellata Turrill)和紫花龙胆(Gentiana syringea T.N.Ho)中的一种或多种，更佳地为高山龙胆(Gentiana algida Pall.)。
其中，步骤(1)中，所述的提取较佳地为超声提取、搅拌提取或逆流循环提取，所述的超声提取的时间较佳地为0.5～1.5小时，所述的搅拌提取的时间较佳地为1.5～2小时，所述的逆流循环提取的时间较佳地为0.3～1小时。
其中，步骤(1)中，所述的溶剂较佳地为体积百分比为50～95％的乙醇水溶液，更佳地为体积百分比为70％的乙醇水溶液。
其中，所述的龙胆与溶剂的体积质量比较佳地为15～30mL/g。
其中，所述的水较佳地为去离子水。
其中，步骤(2)中，所述的乙醇溶液洗脱较佳地为依次用10％～50％乙醇水溶液、51％～90％乙醇水溶液和91％～99％乙醇水溶液进行浓度梯度洗脱，更佳地为依次用30％乙醇水溶液、70％乙醇水溶液和95％乙醇水溶液进行浓度梯度洗脱；百分比为体积百分比。
其中，所述的树脂可为本领域常规使用的大孔树脂，较佳地为D101树脂或AB-8树脂。
本发明还提供了由上述制备方法得到的龙胆提取物，所述的龙胆提取物较佳地为51％～90％乙醇水溶液洗脱得到的提取物；更佳地为70％乙醇水溶液洗脱得到的提取物；百分比为体积百分比。
本发明还提供了上述龙胆提取物作为酪氨酸酶抑制剂、弹性蛋白酶抑制剂、抗氧化活性剂或抗老化活性剂的应用；进一步优选在制备护肤品或化妆品中的应用。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明的龙胆提取物的制备方法简单，制得的龙胆提取物可以作为非疾病诊断和/或治疗用途的酪氨酸酶抑制剂、弹性 蛋白酶抑制剂、抗氧化活性剂和抗老化活性剂的应用，可以将龙胆提取物配合在外用剂中，作为防止肌肤老化、维持年轻健康的肌肤状态的抗老化剂使用。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1
高山龙胆提取物的制备
将50g高山龙胆(Gentiana algida Pall.)干燥后粉碎，与1000mL 70％乙醇溶液(v/v，本发明中所有乙醇溶液均为体积浓度)混合浸泡，超声辅助提取1小时，过滤，滤液经减压脱除溶剂后，得到高山龙胆粗提物7.0g。
取高山龙胆粗提物，用去离子水溶解后，上样到AB-8树脂填充柱，依次用去离子水、30％乙醇、70％乙醇和95％乙醇梯度洗脱(百分比为体积百分比)，分别收集洗脱液，减压脱除乙醇和水，称重，分别得到水洗脱部位4.7g、30％乙醇洗脱部位0.6g、70％乙醇洗脱部位1.0g和95％乙醇洗脱部位0.7g的高山龙胆提取物。
实施例2
高山龙胆提取物中总黄酮含量的测定
将实施例1制得的高山龙胆提取物，按照中华人民共和国药典(2010版)方法，以芦丁为标准品，测定高山龙胆提取物中总黄酮含量。
测定步骤为：1)标准曲线制作：精密量取标准品溶液1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml，分别置25ml量瓶中，各加30％乙醇至6.0ml，加5％亚硝酸钠溶液(质量百分比浓度)1ml。混匀，放置6分钟，再加10％硝酸铝溶液(质量百分比浓度)1ml，摇匀，放置6分钟。加氢氧化钠试液10ml，再加30％乙醇至刻度，摇匀，放置15分钟，以相应试剂为空白，用紫外-可见 分光光度法，在510nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。
2)取实施例1制得的各洗脱部位的高山龙胆提取物完全溶于去离子水，配制成1mg/mL水溶液。将一定量样品置于25ml容量瓶中，其它按照标准曲线制备步骤，自“加5％亚硝酸钠溶液1ml”起，操作同步骤1)，依次测定吸光度，同时取样品溶液3ml，除不加氢氧化钠试液外，其余同上操作，作为空白，计算高山龙胆提取物中总黄酮含量(以芦丁计)，如下表1所示。
表1高山龙胆提取物总黄酮含量
由表1可见，高山龙胆经提取后获得的粗提物含有较多的黄酮类化合物，黄酮是高山龙胆的主要活性成分，经吸附树脂分离后，高山龙胆70％乙醇洗脱部位富集的黄酮最多，比粗提物中黄酮含量有很大提高，其生物活性也相应增强。
实施例3
酪氨酸酶抑制活性的检测
将实施例1制备的各洗脱部位的高山龙胆提取物完全溶于去离子水，配制成1.0mg/mL水溶液，即样品溶液，用于测定酪氨酸酶抑制活性，以熊果苷为参照物。
测定步骤为：磷酸盐缓冲溶液(pH6.8，30mM)70μL、1.66mM酪氨酸溶液80μL、样品溶液80μL混合均匀，在37℃恒温水槽中温育5分钟以上，加入酪氨酸酶溶液(125U/ml)10μL，在37℃恒温10min后，用酶标仪测定 475nm波长的吸光度A475。用去离子水替换样品水溶液，作为参比溶液同样测定吸光度，结果见表2。
酪氨酸酶活性抑制率计算公式为：抑制率(％)＝(A0-(A475-B))/A0×100％，其中A0是参比溶液的吸光度，A475是样品溶液的吸光度，B是样品空白溶液的吸光度。
表2酪氨酸酶抑制活性的测定结果
由表2可见，高山龙胆经提取后获得的粗提物具有对酪氨酸酶活性的抑制作用，经吸附树脂分离后，所得的乙醇洗脱部位均能实现对酪氨酸酶活性的抑制，其中高山龙胆70％乙醇洗脱部位对酪氨酸酶活性比粗提物的抑制作用大大增强。
实施例4
抗氧化活性的检测
按实施例1方法制备得到的高山龙胆粗提物和提取物，用DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)法测定其清除自由基抗氧化活性。测定步骤为：将高山龙胆提取物分别用去离子水配制成0.01mg/mL水溶液，移取2mL于10mL具塞试管中，加入2mL DPPH乙醇溶液(2×10-4mol/L)，充分混匀，室温静置30min后用分光光度计测定517nm波长的吸光度A517；同时测定2mL提取物溶液与2mL乙醇混合后的吸光度A0，2mL水与2mL DPPH乙醇溶液混 合后的吸光度C以及2mL水与2mL乙醇溶液混合后的吸光度C0。平行测定三次，取平均值，根据以下公式计算自由基清除率，清除率越大，说明提取物的抗氧化能力越强。
自由基清除率(％)＝[1-(A517-A0)/(C-C0)]×100％
表3 DPPH法清除自由基活性的检测结果
由表3可见，高山龙胆经提取后获得的粗提物，能实现对DPPH自由基的清除作用，经吸附树脂分离后，所得乙醇洗脱部位均能实现对DPPH自由基的清除，其中高山龙胆70％乙醇洗脱部位对自由基的清除作用与粗提物相比较，有很大的提高。
实施例5
按实施例1方法制备得到的高山龙胆粗提物和提取物，溶于去离子水，配制成1.0mg/mL水溶液，即为样品溶液，用于测定弹性蛋白酶抑制活性。
测定方法按照文献(Am.J.Pharmacol.Toxicol.,2009,4,127-129)方法进行，测定步骤为：在96孔板中加入10μL样品溶液和130μL含有1.015mM反应底物Succ-Ala-Ala-Ala-p-硝基酰替苯胺的0.1M Tris-HCl缓冲溶液(pH8.0)，在25℃下温育5分钟，加入15μL弹性蛋白酶溶液(0.5U/mL)，继续在25℃下温育30min，然后用酶标仪测定410nm波长的吸光度A410。用去离子水替换样品水溶液，作为参比溶液同样测定吸光度，结果见表4。
弹性蛋白酶活性抑制率计算公式为：抑制率(％)＝(A0-(A410-B))/A0×100％，其中A0是参比溶液的吸光度，A410是样品溶液的吸光度，B是 样品空白溶液的吸光度。
表4弹性蛋白酶活性抑制的测定结果
由表4可知，在本发明中使用的高山龙胆提取物均具有抑制弹性蛋白酶作用，其中高山龙胆提取物70％乙醇洗脱部位抑制弹性蛋白酶作用最强，因此可以将高山龙胆提取物配合在外用剂中，作为防止肌肤老化、维持年轻健康的肌肤状态的抗老化剂使用。