用于治疗和预防血管疾病的方法与流程

相关申请

本申请要求于2014年9月5日提交的标题为“methodfortreatmentandpreventionofvasculardisease”的澳大利亚临时专利申请第2014903547号的优先权，该澳大利亚临时专利申请的内容通过引用并入。

本发明涉及治疗和或预防血管疾病(vasculardisease)的方法。本发明还涉及用于植入接受脉管系统(vasculature)治疗的患者中的医疗装置，所述装置包含治疗量的fxyd1或其能够与内皮型一氧化氮合酶相互作用的衍生物。本发明还涉及fxyd1及其能够与内皮型一氧化氮合酶相互作用的衍生物和变体用于治疗或预防血管疾病的用途。

背景技术：

异常的血管功能是高血压、动脉粥样硬化、糖尿病和衰老的关键特征，因此是发病和死亡的主要促成因素。驱动这些疾病状态中的血管功能障碍的常见因素是活性氧类(ros)的过量产生。超氧阴离子(o2^.-)和相关的ros不仅淬灭一氧化氮(no)，而且它们还通过氧化翻译后修饰直接损害细胞蛋白质的功能，驱动炎症、细胞增殖、纤维化、动脉粥样硬化和膜运输中的损害。血管疾病中该升高的ros的主要促成因素是肾素-血管紧张素系统的活化，其产生血管紧张素ii(angii)-活化nadph氧化酶，以及内皮型一氧化氮合酶(enos)的解偶联。

仍然需要用于预防或减少异常血管功能以及用于治疗或预防与异常血管功能相关的医学病况的新的或改善的方法和药剂。

技术实现要素：

本发明人已令人吃惊地鉴别出fxyd1是内皮型一氧化氮合酶(enos)对抗氧化还原诱导的解偶联的内源性保护剂，其导致一氧化氮(no)生物利用度的快速改善、氧化还原应激的降低以及内膜肥厚和血管周纤维化的慢性no依赖性表型的改善。例如通过重组蛋白质施用(天然fxyd1或工程化衍生物)或基因转移来补充fxyd1是一种新的疗法，其将保护动脉免于在特征为氧化应激的宽范围的血管疾病状态中发生氧化还原诱导的功能障碍(汇总在图1中)。

因此，在一个方面，本发明提供了用于治疗或预防脉管系统的氧化还原诱导的功能障碍的方法，所述方法包括向具有脉管系统的氧化还原诱导的功能障碍或有脉管系统的氧化还原诱导的功能障碍的风险的患者施用治疗有效量的fxyd1或其能够与内皮型一氧化氮合酶相互作用的衍生物或变体。

在一个实施方案中，施用fxyd1或其能够与内皮型一氧化氮合酶相互作用的衍生物包括向所述患者的所选脉管系统递送编码fxyd1或其能够与内皮型一氧化氮合酶相互作用的衍生物的核酸序列。在一个实施方案中，施用fxyd1或其能够与内皮型一氧化氮合酶相互作用的衍生物包括向所述患者的所选脉管系统递送病毒载体，所述病毒载体编码fxyd1或其能够与内皮型一氧化氮合酶相互作用的衍生物。

在一个实施方案中，所述方法包括在对所述患者的外科手术或介入手术期间向血管施用所述fxyd1或其能够与内皮型一氧化氮合酶相互作用的衍生物。在一个实施方案中，向所述患者的施用包括在手术期间的吻合之前，在包含fxyd1或其能够与内皮型一氧化氮合酶相互作用的衍生物或变体的组合物中孵育冠状动脉旁路移植物。在一个实施方案中，向所述患者的施用包括在所述患者中植入涂覆的血管或涂覆的支架，所述涂层包含fxyd1或其能够与内皮型一氧化氮合酶(enos)相互作用的衍生物。

在一个方面，本发明提供了用于植入接受脉管系统治疗的患者中的医疗装置，所述装置包含治疗量的fxyd1或其能够与内皮型一氧化氮合酶相互作用的衍生物。在一个方面，本发明提供了用于植入接受脉管系统治疗的患者中的医疗装置，所述装置包含编码fxyd1或其能够与内皮型一氧化氮合酶相互作用的衍生物的核酸序列。

在一个实施方案中，所述装置是支架。在一个实施方案中，所述装置是涂覆的支架，所述涂层包含fxyd1或其能够与内皮型一氧化氮合酶相互作用的衍生物。在一个实施方案中，所述装置是涂覆的血管支架，如冠状动脉支架。医疗装置可包含天然存在的组分(如血管组织或血管)、合成组分(如制造的支架)或其组合。在一个实施方案中，所述装置是血管移植物，其可包含天然存在的材料、合成材料或其组合。在一个实施方案中，所述装置可包含药物洗脱支架或移植物。

在一个实施方案中，患者患有与内皮功能障碍相关的病况(condition)。在一个实施方案中，患者患有选自以下病况组成的组的病况：心肌梗塞、糖尿病(如糖尿病性外周血管疾病)、冠状动脉疾病、在冠状动脉、外周或脑循环中的功能障碍、慢性肾衰竭(如有动脉-静脉瘘)、急性脑血管意外(中风)、缺血-再灌注损伤、慢性血管疾病、肺动脉高压、神经肌肉疾病。

在又一方面，本发明提供了fxyd1或其能够与内皮型一氧化氮合酶相互作用的衍生物，其用于治疗或预防脉管系统的氧化还原介导的功能障碍。

在又一方面，本发明提供了fxyd1或其能够与内皮型一氧化氮合酶相互作用的衍生物，其用于制备用于治疗或预防脉管系统的氧化还原介导的功能障碍的药物。

上述本发明内容并非限制性的并且从优选实施方案的以下的具体实施方式以及从权利要求将显而易见本发明的其它特征和优点。

附图简单说明

现在将参照附图仅通过示例来描述本发明的优选实施方案，其中：

图1.fxyd1对内皮细胞中enos解偶联的保护作用的示意性图示。angii在内皮细胞中通过谷胱甘肽化诱导nadph氧化酶依赖性enos解偶联(galougahi等，2014)。在angii1型受体(at1r)偶联的活化下，nadph氧化酶(nox)来源的o2^.-通过还原酶结构域(显示为g)中关键cys残基(c689和c908)的谷胱甘肽化起始enos解偶联，从而导致no的降低和o2^.-产生的放大(上图)。这支持nox来源的o2^.-充当“引发物(kindling)”和解偶联的enos充当“篝火(bonfire)”以及enos谷胱甘肽化作为关键分子开关的范式。fxyd1在内皮中保护enos免于发生谷胱甘肽化(下图)以及所导致的解偶联，从而显著改善no生物利用度，并降低内皮细胞中的细胞氧化应激。

图2.fxyd1在人脐静脉内皮细胞(huvec-见于总溶解产物-tl中)中表达，并与enos共免疫沉淀。ip＝免疫沉淀剂。阴性igg为ip的情况被显示为对照。

图3.当fxyd1的内源性表达被沉默时，enos谷胱甘肽化增加。

图4.fxyd1表达对enos活化至关重要。当fxyd1被沉默或“敲低”(kd)时，通过no-敏感荧光剂daf-2da所评估的huvec的no产生显著降低。

图5.直方图,其显示用sirna使fxyd1表达沉默对暴露于angii(500nm)的细胞中超氧化物敏感性二氢乙锭(dhe)荧光的影响。

图6.fxyd1敲除(小鼠模型)导致体内血管紧张素ii诱导的enos-谷胱甘肽化的增强(1mg/kg/天的angii输注1周)。使用gsh表位ip和enos免疫印迹(ib)确定enos谷胱甘肽化。这在心脏(a)和主动脉(b)两者中都被观察到。图6a左侧所示的大小标志表示10kda、15kda、20kda、25kda、37kda、50kda、75kda、100kda、150kda和250kda。

图7.fxyd1的敲除(fxydko)导致增加的中膜厚度，这在施用血管紧张素ii的情况下被加剧。

图8.fxyd1敲除导致增加的血管周纤维化，以及血管紧张素ii诱导的血管周纤维化的显著增强。

图9.fxyd1敲除(小鼠模型)在心脏中导致增加的基底间质纤维化并增强血管紧张素ii诱导的间质纤维化。使用米利根三色染色(milliganstrichromestaining)在固定的心肌组织上显现纤维化。**反映了p<0.01的显著性。

图10.fxyd1敲除(小鼠模型)导致通过超声心动图显像(肺加速时间)所测量的肺动脉压升高。**反映了p<0.01的显著性。

定义

如本文所用的术语“包括”意指主要但不一定只包括。此外，词语“包括(comprising)”的变化形式(如“包括(comprise)”和“包括(comprises)”)具有相应变化的含义。

术语“受试者”和“患者”在本文中可互换使用，且包括人和具有社会、经济或研究重要性的任何物种的个体，包括但不限于以下属的成员：羊、牛、马、猪、猫、犬、灵长类动物、啮齿动物。

如本文所用的术语“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”包括施用疗法以预防、治愈、缓解、改善或预防与病症、疾病、损伤或病况相关的症状。

在本说明书的上下文中，术语“多肽”意指由通过肽键连接在一起的氨基酸组成的聚合物。多肽可具有任何长度。除非上下文另有指示，否则应当理解术语多肽还包括肽和蛋白质。

当在一组可选要素的背景下使用时，术语“至少一个”包括单独选择的组中的任何一个、两个或更多个、多至所有成员，并且包括该组成员的任何组合。类似地，当在一组可选要素的背景中使用时，术语“至少两个”包括任何组合中的组中的两个或更多个成员的任何选择。

在本说明书的上下文中，术语“氧化还原诱导的功能障碍”和“氧化还原介导的功能障碍”应被理解为具有相同的含义。

在允许的范围内，本文中所引用的所有参考文献均以引用方式整体并入。

详细说明和实施例

本发明人已令人吃惊地鉴别出fxyd1与内皮中的内皮型一氧化氮合酶(enos)的新的相互作用，该酶是血管内环境稳定中的关键酶，对宽范围的急性和慢性血管疾病状态具有显著的治疗意义。

fxyd蛋白质是小i型膜蛋白质家族，其以细胞外结构域中不变的fxyd标识序列被命名。以组织特异性方式表达的哺乳动物fxyd(“fixit”)蛋白质(sweadner和rael，2000)是根据它们被克隆的日期按时间顺序编号的。fxyd1(也被称为磷肌纤维蛋白(phospholemman))是在内皮和血管平滑肌中表达的小膜蛋白质。已知其与心脏中的na+-k+泵功能相关，其中先前已证实其具有对抗氧化应激诱导的对na+-k+泵的抑制的保护作用(bibert等，2011)。fxyd1也已被证实在血管平滑肌细胞中表达，并且在na+-k+泵以及响应氧化应激的收缩张力的急性调控中起作用(liu等，2013)。

人fxyd1的示例性氨基酸序列(palmer等，1991)以uniprotkb/swiss-prot保藏号o00168(seqidno：1))被提供。编码人fxyd1的示例性核酸序列是embl-ebi保藏号u72245(seqidno.2)。

enos在内皮生理学中是关键性的，调控血管张力以及减弱血小板聚集和嗜中性粒细胞-内皮相互作用(brunner等，2003)。然而，在氧化应激条件下，enos变得“解偶联”，优先产生o2^.-和onoo^-，这扩大了氧化应激并加剧了损伤(burgoyne等，2005)。在病理生理损害(例如糖尿病、高血压)期间保护enos免于解偶联可终止放大过程并保护对于动脉健康至关重要的关键膜蛋白质。enos还原酶结构域的这种解偶联由谷胱甘肽化介导的发现(chen等，2010)导致我们对enos调控的理解的范式转变，并为限制心血管疾病中的氧化应激的新的治疗策略铺平了道路。

如本文所述的，本发明人现已令人吃惊地鉴别出，fxyd1和enos存在功能相互作用。这得到由本发明人获得并在本文中描述的以下实验结果支持。

方法

细胞培养和sirna敲低：在内皮生长培养基中培养人冠状动脉内皮细胞(huvec)。使用针对fxyd1的sirna或乱序对照(qiagen)；和fxyd1表达质粒来检查fxyd1对内皮细胞功能和enos活性以及其谷胱甘肽化的作用。使用荧光素标记的dsrna低聚物来显现转染效率。

谷胱甘肽化蛋白质的免疫检测和蛋白质共免疫沉淀。为了在共免疫沉淀实验中检测enos的谷胱甘肽化，使用市售的针对谷胱甘肽化蛋白质的抗体(抗gsh抗体-virogen)来检测谷胱甘肽化。将主动脉在含有150mmol/lnacl、50mmol/ltris-hcl(ph8.0)、1％tritonx-100、2mmedta和蛋白酶抑制剂(完全无egta的，rochediagnostics)的冰冷溶解缓冲液中均质化，随后以16,000g离心20min。将上清液(0.5-1mg蛋白质)与适当抗体以1mg蛋白质和2.5μg抗enos抗体(sigma-aldrich):1mg蛋白质的比例在4℃孵育1小时，然后与蛋白质a/g-plus琼脂糖珠粒孵育。将与收集的珠粒相结合的蛋白质在laemmli缓冲液中洗脱，进行sds-page并用抗gsh抗体探测。通过las-4000图像读取器读取蛋白质印迹化学发光，并使用multigauge3.1软件(fujifilmlifescience，tokyo，japan)通过密度测定法加以定量。调节暴露时间以确保信号强度的变化在线性动态范围内。使用标准蛋白质印迹技术来评估fxyd1和enos表达。

通过共聚焦荧光显微镜术检测no。在固定前不与乙酰胆碱预孵育的情况下，通过使用4-氨基-5-甲基氨基-2',7'-二氟荧光素二乙酸酯(daf-fm二乙酸酯)(10μm,30分钟37℃)检测huvec中的细胞内no。用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi,1μm)将核染色。分别使用495nm和515nm的激发波长和发射波长来检测no荧光，并通过imagej软件进行分析。

通过共聚焦荧光显微镜术检测超氧化物。在固定之前，在加载有o2^.--敏感性染料二氢乙锭(dhe)的huvec中检查细胞内o2^.-的变化30分钟。用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi,1μm)将核染色，并用vectashield封固剂将细胞封固在载玻片上，并且用共聚焦显微镜(leicatcssp5)观察。

fxyd1ko和wt小鼠的超声心动图显像：使用30-mhz换能器(vevo770；visualsonics,toronto,ontario,canada)在自发呼吸的轻度镇静小鼠(异氟烷1％)中获得经胸超声心动图显像。我们测量了肺动脉加速时间(pat)，以非侵害性地估计在小鼠暴露于缺氧环境3周和6周之前(基线)和之后的肺动脉压。

如在人内皮细胞(huvec；图2)中的共免疫沉淀测定所证实的，fxyd1被表达并与enos物理相互作用。

人内皮细胞中内源性fxyd1表达的沉默导致enos的谷胱甘肽化增加(图3)。由于这是enos的氧化还原解偶联的分子机制，因此预测这会降低no生物利用度，并增加超氧化物产生。

人内皮细胞中内源性fxyd1表达的沉默导致no生物利用度在以下情况的显著降低：基线处；当被乙酰胆碱刺激时(图4和图5)；以及在由暴露于神经激素血管紧张素ii驱动的更高氧化应激的条件下。

fxyd1的敲除(体内敲除小鼠)导致在基线条件下enos的谷胱甘肽化增加，并且增强enos对心脏(图6a)和主动脉(图6b)中血管紧张素ii诱导的谷胱甘肽化的敏感性。这进一步支持fxyd1针对心血管系统中对关键膜蛋白质的氧化还原损害的保护作用。

fxyd1的敲除(体内敲除小鼠)导致中膜肥厚和血管周纤维化的慢性血管变化，这与enos解偶联和过量的ros产生一致。血管紧张素ii的施用加剧这些表型(图7和图8)。

fxyd1的敲除(体内敲除小鼠)导致心肌间质纤维化和血管紧张素ii诱导的心肌纤维化的加剧(图9)。本发明人认为其机制可能涉及继于改善的enos偶联之后的改变的心肌ros产生。

fxyd1针对enos解偶联的内源性保护作用指向其在调控肺动脉血管舒缩张力以及肺血管系统中的血管重塑中的潜在作用。敲除小鼠中的体内研究证实如通过肺加速时间(pat，如图10中所示，n＝7/小鼠)的超声心动图测量所反映的升高的肺动脉压。

因此，这些新数据表明fxyd1在血管细胞中的作用不限于维持na⁺泵功能，而且还包括保护enos对抗氧化应激诱导的谷胱甘肽化和解偶联。这对血管健康有重要的急性和慢性意义。这种功能相互作用的鉴别对宽范围的血管疾病状态具有治疗意义。fxyd1沉默还导致增加的心肌纤维化的发现指向靶向疗法在特征在于ros依赖性心肌纤维化的心肌疾病状态中的可能有益作用。

基于本文所公开的发现，预测向内皮递送fxyd1提供针对氧化还原诱导的解偶联的保护，从而终止或改善活性氧类诱导的活性氧类产生的“篝火”正反馈(如图1中所示)。这是血管疾病病理生理学中关键的起整合作用的步骤。

对如下不同临床情况具有可变的适合性的三种递送方法是显而易见的。

重组fxyd1或工程化衍生物的递送。如下公开的发现支持实现重组亲脂蛋白质的自发膜插入的可行性：(1)rfxyd蛋白质在人工膜中以正确的取向自发插入(通过核磁共振评估；teriete等，2007)；fxyd蛋白质与na⁺泵亚单位缔合(crambert等，2004)；(2)外源的纯化fxyd1分隔进入到膜片段中，并在5min内与na⁺泵缔合，如通过其与α亚单位的共免疫沉淀和半胱氨酸交联所示(mahmmoud等，2000；cornelius等，2005)；和(3)在含有rfxyd3蛋白质(用于免疫检测的目的，因为不是心脏内源的)的溶液中孵育心肌细胞导致rfxyd3蛋白质与na⁺泵的功能缔合(bibert等，2011)。

重组fxyd1蛋白质的施用最适合于其中内皮氧化应激的急性逆转是有益的情况，以及理想地，在可直接递送至血管的情况，诸如在外科手术或介入手术中。

示例包括在手术期间的吻合之前孵育冠状动脉旁路移植物；涂覆血管支架，包括冠状动脉支架；递送到外周血管旁路移植物，特别是在缺血性糖尿病足的情况下；在初始手术时或在闭塞瘘的手术矫正期间递送到慢性肾衰竭患者中的动脉-静脉瘘；和动脉内递送以在急性心肌梗塞或中风的情况下保护冠状动脉循环或脑循环免于缺血-再灌注损伤。

基因转移。fxyd1的病毒载体的递送对于上述应用是可行的。

转录调控。鉴别出参与fxyd1表达的因子将允许开发更适于糖尿病或高血压患者或吸烟患者的慢性血管疾病诸如全身动脉疾病的疗法。

在fxyd1或其衍生物的每种治疗应用中，通常将向受试者施用治疗有效量的fxyd1或其衍生物。如本文所用的术语“治疗有效量”在其含义内包括足以提供期望的治疗效果的化合物或组合物的量。所需的确切的量将根据受试者不同而不同，这取决于诸如治疗的物种、受试者的年龄和总体状况、并发症、被治疗的病况的严重性、施用的具体试剂和施用方式等因素。因此，对于任何给定的情况，本领域普通技术人员仅使用常规方法即可确定适当的“治疗有效量”。类似地，当疗法包括施用活性剂的前体，如施用意在表达治疗剂(例如fxyd1或其衍生物)的遗传构建体时，应当理解，如此递送的遗传构建体将能够提供治疗有效量的活性物质。

用根据本发明的fxyd1或其能够与enos相互作用的衍生物治疗受试者可以是给予所述受试者的唯一治疗，或者可以是用于所述受试者的组合方案治疗的一个组成部分，在所述组合方案治疗中将基于fxyd1的治疗与用于所述病况的其它治疗组合。如本文中关于治疗方案所用的术语“与……组合”和类似术语如“联合”意指药物和其它治疗剂中的每一种均被用于治疗受试者，并且意指“组合”治疗方案中的药物和其它治疗剂中的每一种均可与所述治疗方案中的一种或多种其它药剂同时被施与所述受试者，或者可在不同于所述治疗方案中的一种或多种其它药剂的时间被施与所述受试者。

应当理解，如本文中关于治疗方案所用的术语“与……组合”和类似术语如“联合”在它们的含义内涵盖通过不同的模式施用所述药物和其它治疗剂中的每一种(例如一种可口服施用，并且另一种可通过注射施用)。当关于治疗方案使用时，术语“与……组合”和类似术语如“结合”可意指药物或其它试剂中的任何一种或多种可在被施与受试者之前物理组合，并且应当理解，该术语还包括将一种或多种药物和其它治疗剂作为不在先前物理组合中的单独药剂施用。

基于本文中对于fxyd1在氧化应激条件下保护内皮免于enos解偶联的公开，本发明向患有动脉疾病的患者提供新的治疗策略，例如通过向此类患者递送fxyd1或其工程化的或天然存在的衍生物或变体。

当与本发明的fxyd1蛋白质相关联使用时，术语“衍生物”包括任何功能等同的fxyd1蛋白质，包括整体产生(例如通过重组手段)或在合成后添加(例如通过化学方法)的任何融合分子。此类融合物可包括与多肽(例如嘌呤霉素或其它多肽)、小分子(例如补骨脂素)或抗体缀合的本发明的fxyd1蛋白质。如本文所述的，发明人已证实fxyd1与enos相互作用，并且通过这样在保护enos免于氧化应激诱导的谷胱甘肽化和解偶联中起作用。

在本上下文中，应当理解，融合蛋白质或多肽可包含本发明的多种fxyd蛋白质，诸如其中两种或更多种fxyd蛋白质存在于单一多肽上的多肽。

包含本发明的一种或多种fxyd1蛋白质的融合蛋白或多肽可另外包含一个或多个不相关的序列。在融合蛋白质或多肽的背景下，此类序列在本文中通常将被称为“融合配偶体”。通常，融合配偶体是氨基酸序列，并且可以是多肽。例如，可选择融合配偶体以辅助肽或多肽的产生。此类融合配偶体的示例包括能够增强肽或包含所述肽的多肽的重组表达的那些；能够促进或辅助肽或包含所述肽的多肽如亲和标签的纯化的那些。或者或另外，可选择融合配偶体以增加肽或包含所述肽的多肽的溶解度，以增加所述肽的免疫原性，使肽或包含所述肽的多肽能够靶向特定的或期望的细胞内区室。

用于制备融合蛋白质的方法是本领域已知的。通常，融合蛋白质可通过标准技术如化学缀合、肽合成或重组手段制备。融合蛋白质可在蛋白质的组成部分之间，如在一种或多种组成肽之间，和/或在一种或多种融合配偶体和/或组成肽之间，包含一个或多个接头，如肽接头。可选择此类肽接头以允许融合蛋白质的组成部分维持或获得适当的二级和三级结构。

本发明的fxyd蛋白质可通过任何适合的手段制备，如通过从天然存在的形式分离，通过化学合成或通过重组手段。本领域技术人员将知晓用于此类制备的标准方法，如通过酶切割从天然存在的较长氨基酸序列分离，如通过化学合成，如通过重组dna技术。

本发明的fxyd蛋白质、或包含本发明的fxyd蛋白质作为其组成部分的融合蛋白质或多肽可以是可溶性的肽、融合蛋白质或多肽。

本发明还涵盖fxyd1的“变体”的使用。当与本发明的fxyd1蛋白质相关联使用时，术语“变体”包括任何功能等同的fxyd1蛋白质。术语“变体”还涵盖fxyd1蛋白质或多肽或寡肽的功能片段，并且还涵盖功能同系物。例如，尽管本文参照特定的fxyd1氨基酸序列或多核苷酸序列(诸如seqidno:1和seqidno：2中所示)对本发明进行了描述，但是应当理解，可以存在或合成fxyd1多肽或多核苷酸，该多核苷酸具有或编码以类似于fxyd1的方式与enos相互作用的能力，以实现使得enos对抗氧化应激诱导的谷胱甘肽化和解偶联的一定程度的保护。

变体或同系物可在氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸取代、缺失、添加和/或插入。本发明的fxyd1蛋白质的变体或同系物优选展现出与天然fxyd1蛋白质具有至少约70％、至少约80％、至少约85％或至少约90％的同一性，更优选在所述变体或同系物的长度内与天然fxyd1蛋白质具有至少约92％或至少约94％的同一性、或至少约95％的同一性、或至少约96％的同一性、或至少约97％的同一性、或至少约98％的同一性、或至少约99％的同一性。

fxyd1蛋白质或变体可通过例如氨基酸的缺失或添加来修饰。氨基酸取代包括但不必限于本领域被称为“保守”的氨基酸取代。“保守”取代是其中一个氨基酸取代具有相似性质的另一氨基酸的取代，使得肽化学领域技术人员将预期多肽的二级结构和亲水性质基本上不变。氨基酸取代通常可基于残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性进行。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；亲水性值相似的具有不带电荷的极性头部基团的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；以及丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。可代表保守变化的其它氨基酸组包括：(1)ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr；(2)cys、ser、tyr、thr；(3)val、ile、leu、met、ala、phe；(4)lys、arg、his；和(5)phe、tyr、trp、his。变体还可以或者可选择地含有非保守改变。

通常，变体fxyd1蛋白质与天然fxyd1蛋白质的不同之处在于五个氨基酸或更少个(诸如四个、三个、或两个或一个)氨基酸的取代、缺失或添加。

通常，本发明的fxyd1蛋白质是分离的蛋白质。应当理解，在本上下文中，术语“分离的”意指所述蛋白质已从与其在天然系统中一起被发现的一些或所有其它成分中去除或不与这些成分缔合。例如，“分离的”肽可从fxyd1多肽序列内的其它氨基酸序列中被去除，或者可从天然组分如不相关的蛋白质中被去除。为了清楚起见，“分离的”fxyd1蛋白质包括已化学合成的fxyd1蛋白质，并且包括通过重组方法制备的多肽或寡肽。如本文所述的，本发明的分离的fxyd1蛋白质可作为较长多肽或融合蛋白质的组成部分被包含。

因此，如本文所用的fxyd1的“衍生物”或“变体”体现以下功能要求：其能够与enos相互作用，从而在保护enos免于氧化应激诱导的谷胱甘肽化和解偶联方面起作用。应当理解，在“衍生物”和“变体”的背景下，“功能等同”不要求如对于fxyd1可见到的相同的定量结果。与参考fxyd1相比，衍生物或变体在实现期望的结果方面可能具有较高活性或可能具有较低活性。

应当理解，在本说明书通篇中，对于fxyd1在治疗方法中的用途或在此类用途的背景中(例如提及用于治疗的fxyd1的药物组合物)的提及，不仅是指fxyd1，而且是指其衍生物、变体、片段等。可使用术语fxyd1的情况将仅仅是为了语言而不是意义的简洁。

本发明提供编码本发明的一种或多种fxyd1蛋白质的多核苷酸以及编码一种或多种包含本发明fxyd1蛋白质的融合蛋白质或多肽的多核苷酸，如本文所述的。在本发明的某些实施方案中，编码本发明的肽或其融合蛋白质或功能等同物的多核苷酸序列或其片段可用于重组dna分子中以指导多肽在适当的宿主细胞中的表达。由于遗传密码的固有简并性，因此可产生编码基本上相同或功能等同的氨基酸序列的其它dna序列，并且这些序列可用于克隆和表达给定的多肽。

如本领域技术人员所认识到的，多核苷酸可以是单链(编码或反义)或双链的，并且可以是dna(基因组的、cdna或合成的)或rna分子。rna分子包括hnrna分子，其含有内含子并且以一对一的方式对应于dna分子；和mrna分子，其不含有内含子。另外的编码或非编码序列可以但不必存在于本发明的多核苷酸内，并且多核苷酸可以但不必连接到其它分子和/或支撑材料。多核苷酸可包含天然序列(即，编码fxyd1蛋白质或其部分的内源序列)，或可包含该序列的变体或生物或抗原功能等同物。多核苷酸变体可含有一个或多个如下文进一步描述的取代、添加、缺失和/或插入，优选使得所编码的多肽的免疫原性相对于天然fxyd1蛋白质不降低。通常可如本文所述来评估对所编码的多肽的免疫原性的影响。术语“变体”还涵盖异种来源的同源基因。

为了表达期望的多肽，可将编码所述肽、融合蛋白质或多肽或功能等同物的核苷酸序列插入适当的表达载体，即含有用于所插入的编码序列的转录和翻译的必需元件的载体。本领域技术人员熟知的方法可用于构建含有编码目标多肽的序列以及适当的转录和翻译控制元件的表达载体。这些方法包括体外重组dna技术、合成技术和体内基因重组。此类技术描述于sambrook，j.(1989)molecularcloning，alaboratorymanual，coldspringharborpress，plainview，n.y.和ausubel，f.m.等(1989)currentprotocolsinmolecularbiology，johnwiley&sons，newyork.n.y.及其更新版本中。

因此，本发明提供了包含本发明的多核苷酸序列的载体。在一个实施方案中，载体可以是表达载体。本发明还提供了包含本发明的多核苷酸或载体的宿主细胞。本发明还提供了用于制备本发明的肽的方法，所述方法包括在有助于所编码的肽的表达的条件下培养包含本发明的多核苷酸或表达载体的宿主细胞。在一个实施方案中，所述方法进一步包括纯化所表达的肽。

在进行本发明的方法时，通常使fxyd1与enos接触或导致其与enos接触以实现使得enos对抗氧化应激诱导的谷胱甘肽化和解偶联的一定程度的保护。或者或另外，可通过施用能够增加或降低内源fxyd1的表达的一种或多种试剂来改变细胞或组织内源的fxyd1，使得例如导致另外的fxyd1与enos接触。如本文所用的“接触(contact)”或“接触(contacting)”是指将组织、器官或细胞暴露于本发明的fxyd1蛋白质或前药，使得其可与enos相互作用。接触可以是体外的，例如通过将fxyd1蛋白质或前药添加到培养的组织或细胞或血管组织或移植物中，用于诊断或研究目的或测试所述组织或细胞或血管组织或移植物对fxyd1蛋白质或前药的敏感性。接触可以是体内的，例如向受试者施用fxyd1蛋白质或前药，诸如用于治疗或预防不期望的病况。接触可以是离体的，诸如通过将血管移植物暴露于包含fxyd1的组合物。

如本文所述的，向受试者施用fxyd1可以是任何适当的形式或方式，诸如通过施用包含fxyd1的药物组合物，施用诸如通过将血管移植物浸泡在包含fxyd1的组合物中而已暴露于fxyd1的所述移植物，施用fxyd1蛋白质的前体诸如前药或能够表达fxyd1的载体中的编码fxyd1的核酸序列，施用能够递送fxyd1的医疗装置诸如支架。

用于将治疗物质递送到脉管系统的装置如支架是本领域已知的。因此，可通过任何适当的方法制备能够递送fxyd1的医疗装置如支架。适合的方法可参见例如标题为“drug-elutingstent”的美国专利第5,697,967号；t.cooperwoods和andrewr.marks,drug-elutingstents,annualreviewofmedicine，第55卷:169-178；标题为“drugelutingstent”的美国专利第7,135,038号；这些文献中的每一个的内容均以引用方式并入本文。

fxyd蛋白质是脂溶性的且因此是膜溶性的。因此，在急性缺血性损伤的情况下施用fxyd1蛋白质可用于例如fxyd1治疗如梗塞和缺血再灌注损伤。所述蛋白质可被静脉内施用或直接输注到梗塞相关的动脉中，例如在利用血管成形术进行急性干预的情况下。在其它实施方案中，fxyd1蛋白质的输注可以数分钟到数小时的时间尺度被施用。

在一些实施方案中，本发明的fxyd1蛋白质可用蛋白质、多肽、寡肽、抗体或其片段、放射性粒子、纳米粒子或微粒产生或与其缀合。

如本文所述的，本发明的方法包括使用一种或多种试剂，所述试剂能够增加细胞中功能性fxyd1的水平，从而影响可能导致与enos相互作用的功能性fxyd1的量。本发明的方法还涵盖使用小分子来改善fxyd1和enos的功能相互作用。本领域已知使用例如影响靶基因表达的小分子的方法，使得所述靶基因的表达根据期望的情况增加或降低。通常，在本发明的方法中，靶基因编码fxyd1或fxyd1表达的内源调控物。通常，本发明包括增加靶细胞或靶组织中fxyd1的表达。靶基因产物的量的调控还可在转录后加工或翻译的水平上受到影响。本发明的方法还涵盖使用可能影响fxyd1表达的调控的微小rna(microrna)。已知mirna还与心脏和心血管疾病有关，因此本发明的方法还设想使用microrna、sirna、反义rna、核酶或shrna构建体。

本发明的方法可以是体内方法、离体方法或体外方法。体外方法的一个示例是用于研究或开发目的的方法。体内方法的一个示例是治疗或预防需要所述治疗或预防的患者的疾病的方法。

在一个实施方案中，所述方法包括治疗糖尿病性外周血管疾病(其中可通过浸泡外科处理的血管或移植物，以及通过动脉内注射到相关区域来直接施用治疗)。在一个实施方案中，所述方法包括治疗接受冠状动脉旁路手术的患者(其中可直接孵育移植物)。在一个实施方案中，所述方法包括治疗接受例如用于冠状动脉循环、外周循环或脑循环的动脉支架的患者，其中支架可用fxyd1递送剂涂覆。

在一个实施方案中，所述方法包括治疗具有透析所需的动脉静脉(也被称为动静脉)瘘的慢性肾衰竭患者，其中瘘的失效是主要的临床问题。如果在造瘘时或在对闭塞进行外科干预时递送，则预测fxyd1递送是有益的。

在一个实施方案中，所述方法包括治疗罹患急性心肌梗塞的患者，从而降低部分由内皮功能障碍驱动的心肌缺血-再灌注损伤。

在一个实施方案中，所述方法包括治疗罹患急性脑血管意外(中风)的患者，其中缺血-再灌注损伤由内皮功能障碍驱动。

在一个实施方案中，所述方法包括治疗患有慢性血管疾病的患者，其中预测增加fxyd1在脉管系统中的表达的治疗将减少血管事件。

在一个实施方案中，所述方法包括治疗患有特征在于enos解偶联、血管周纤维化和中膜肥厚的肺动脉高压(如特发型、或继发于硬皮病或相关结缔组织疾病状态)的患者。在这种情况下，吸入式基因疗法是所选的递送方法，该方法在其它肺疾病状态中是成功的。

用于任何具体患者的最适当的治疗方案可由治疗医生确定并且将取决于多种因素，包括：正在治疗的病症和所述病症的严重程度；所采用的化合物或试剂的活性；所采用的组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；施用时间；施用途径；试剂或化合物的螯合(sequestration)速率；治疗的持续时间；与治疗组合或同时使用的药物，以及医学中熟知的其它相关因素。

在本发明的一个方面，fxyd1的施用可作为“附加物”，其中可用常规药物治疗患者。例如，fxyd1可在用例如更常规的用于血管疾病的治疗药物或方案治疗之前、期间或之后被施用。因此，应当了解，在本上下文中，术语“附加物”是指另外的治疗整体(therapeuticinteger)(fxyd1)；这并不意味着fxyd1必须作为最后的药物添加。组合疗法中特定药物和药物类别的顺序和组成可由本领域技术人员确定，并且可包括例如在治疗方案涉及施用多种药物类别的情况下，可在所述方案期间的任何阶段施用fxyd1。

作为本发明方法的治疗方案的又一示例，可在施用fxyd1之前使罹患心肌梗塞的患者的病况至少部分地稳定。此外，可在开始本发明的方法之前使患者的病况至少部分地稳定。此类治疗方案中的任一种均可被称为首先使患者稳定。

作为治疗方案的又一示例，fxyd1可以是在没有任何预先药物治疗或稳定化的情况下在血管疾病的治疗中施用的第一种药物。针对本发明提出的fxyd1蛋白质可作为组合物被治疗性地或预防性地施用。在治疗性应用中，以足以有效治疗患者的量向该患者施用组合物，该患者已患有特征在于脉管系统的氧化还原诱导的功能障碍的病况。

用于任何具体患者的治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包括：正在治疗的病症和所述病症的严重程度；所采用的化合物或试剂的活性；所采用的组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；施用时间；施用途径；试剂或化合物的螯合速率；治疗的持续时间；与治疗组合或同时使用的药物，以及医学中熟知的其它相关因素。本领域技术人员将能够通过常规实验来确定fyxd1蛋白质的有效量，以及治疗该病况所需的其它适当药剂。

此外，对于本领域普通技术人员将显而易见的是，单个剂量的最佳量和间隔，以及在使用组合疗法的情况下，施用所述组合疗法的各种试剂的最佳量和间隔，将由正在治疗的疾病状况或状态的性质和程度、施用的形式、途径和部位以及正在治疗的具体个体的性质来确定。此外，此类最佳条件可通过常规技术确定。

通常，包含fxyd1的适合的组合物可根据本领域普通技术人员已知的方法制备，且因此可包含药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂和/或佐剂。

这些组合物可通过标准途径被施用。通常，所述组合物可通过胃肠外(例如静脉内、脊柱内、皮下或肌内)途径被施用。所述组合物可通过动脉内注射到相关区域来施用。所述组合物可通过例如将脉管系统暴露于包含fxyd1的组合物来施用，诸如通过将血管移植物浸泡在包含fxyd1的组合物中。fxyd1可通过使用医疗装置诸如包含fxyd1的支架来施用，所述支架可以是涂覆的支架，其中所述涂层包含fxyd1，在这种情况下，所述组合物可用于制备所述医疗装置。因此，包含fxyd1的组合物可以是适于例如涂覆到支架之上或之中的形式，或适于诸如通过在植入之前浸泡或输注到血管移植物中而接触脉管系统的形式。

就与组合物的其它成分相容来说，载体、稀释剂、赋形剂和佐剂必须是“可接受的”，并且对其接受者无害。药学上可接受的载体或稀释剂的示例是脱矿质水或蒸馏水；盐水溶液；基于植物的油，如花生油(peanutoil)、红花油、橄榄油、棉籽油、玉米油、芝麻油、花生油(arachisoil)或椰子油；硅酮油，包括聚硅氧烷，如甲基聚硅氧烷、苯基聚硅氧烷和甲苯基聚硅氧烷(methylphenylpolysolpoxane)；挥发性硅酮；矿物油，如液体石蜡、软石蜡或角鲨烷；纤维素衍生物，如甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠或羟丙基甲基纤维素；dmso、n,n-二甲基乙酰胺(dma)、低级烷醇例如乙醇或异丙醇；低级芳烷醇；低级聚亚烷基二醇或低级亚烷基二醇，例如聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇、丙二醇、1,3-丁二醇或甘油；脂肪酸酯，诸如棕榈酸异丙酯、肉豆蔻酸异丙酯或油酸乙酯；聚乙烯基吡咯烷酮(polyvinylpyrridone)；琼脂；角叉菜胶；黄芪胶或阿拉伯胶，和矿油凝胶。通常，所述一种或多种载体将构成所述组合物重量的10％到99.9％。

所述组合物可包含增加一种或多种活性化合物的生物利用度或治疗持续时间的试剂。

本发明的组合物可以是适于肠胃外(诸如经皮下、肌内或静脉内注射或输注)施用的形式。

对于作为可注射溶液或悬浮液施用来说，无毒的肠胃外可接受的稀释剂或载体可包括林格氏溶液(ringer'ssolution)、等渗盐水、磷酸盐缓冲盐水、乙醇和1,2丙二醇。

佐剂通常包括润肤剂、乳化剂、增稠剂、防腐剂、杀菌剂和缓冲剂。

由于fxyd1蛋白质是脂溶性的，因此所述组合物还可以脂质体的形式被施用。脂质体通常衍生自磷脂或其它脂质物质，并且通过分散在水性介质中的单层或多层水合液体晶体形成。可使用能够形成脂质体的任何无毒的、生理上可接受的且可代谢的脂质。脂质体形式的组合物可含有稳定剂、防腐剂、赋形剂等。优选的脂质是天然的和合成的磷脂和磷脂酰胆碱(卵磷脂)。形成脂质体的方法是本领域已知的，并且关于这一点具体参考：prescott编辑，methodsincellbiology，第xiv卷，academicpress，newyork，n.y.(1976)第33页及后面页，其内容以引用方式并入本文。

本文已参考实验结果描述了本发明。实验意在用于说明本发明，并且不应被解释为限制本说明书通篇的说明的公开内容的一般性。

在允许的范围内，本文中所引用的所有参考文献均以引用方式整体并入。

参考文献

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序列表

<110>北悉尼地方健康区

<120>用于治疗和预防血管疾病的方法

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<140>pct申请

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