本发明涉及抗辐射药物领域，具体指一种山药多糖、枇杷叶提取物抗辐射口服制剂及制备方法。
背景技术：
辐射用于肿瘤的治疗在已有几十年的历史，目前临床上所用的辐射是由60co产生的γ-射线，这种射线是一种高能射线。中医认为经这种高能射线照射后，患者的机体会产生阴虚症状。现代医学研究认为辐射后患者的白细胞数量会减少、人体的造血系统会受到损伤、细胞的dna会受到破坏。临床上的pet-ct检查、x光检查、肿瘤的辐射治疗等都会对人体造成不同程度的伤害。
目前市场上具有抗辐射作用的产品中一类是茶叶、黑芝麻、螺旋藻、大蒜等具有一定抗辐射保健效果的原植物或其组合物，这些产品虽然有一定的抗辐射作用，但是对肿瘤类疾病的大剂量放射治疗没有明显效果。另一类则是从人参、灵芝、松茸等名贵材料中提取制成的，虽然具有较好的抗辐射作用，但价格极其昂贵，目前市场上缺乏效果可靠且价格合理的同类产品。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种具有可靠抗辐射效果且成本较低的制剂，即一种山药多糖、枇杷叶提取物抗辐射口服制剂。
本发明所述山药多糖、枇杷叶提取物抗辐射口服制剂含有以下质量比例的组分：原料枇杷叶提取物1份，原料山药多糖0.5～8份，载体磷脂1～5份，辅料乳糖1～30份，辅料木糖醇1～30份。
作为本发明的一个优选配比范围方案，所述山药多糖、枇杷叶提取物抗辐射口服制剂含有以下质量比例的组分：原料枇杷叶提取物1份，原料山药多糖3～6份，载体磷脂3～5份，辅料乳糖3～20份，辅料木糖醇3～20份。
作为本发明的一个优选配比方案，所述山药多糖、枇杷叶提取物抗辐射口服制剂含有一下质量比例的组分：原料枇杷叶提取物1份，原料山药多糖5份，载 体磷脂4份，辅料乳糖15份，辅料木糖醇15份。
本发明还包括一种山药、枇杷叶提取物抗辐射口服制剂的制备方法，包括下列步骤：
a.枇杷叶提取物的制备：将枇杷叶粉碎过筛后加水煎煮2～4次，过滤后保留滤渣，滤渣经干燥后用无水乙醇在70℃下回流提取，回收提取液中的乙醇后得到原料枇杷叶提取物；
c.抗辐射口服制剂的制备：取1份步骤a中制备的原料枇杷叶提取物，1～5份载体磷脂，加入无水乙醇中溶解后再加入0.5～8份原料山药多糖，1～30份辅料乳糖，1～30份辅料木糖醇，充分混合，再经烘干、粉碎及分装后得到成品抗辐射口服制剂。
所述步骤a中过筛的目数为40目。
所述步骤a中回流提取的液固相比为10ml/g。
所述步骤a中的回流提取时间为8h。
所述步骤b中的混合方式为100w功率下超声震荡10～20min。
山药是药食同源型植物，其主要活性成分山药多糖具有健脾、润肺、补肾的功效。动物试验表明山药多糖具有提高机体免疫功能及抗衰老等作用。出于成本控制方面的考虑，本发明所述抗辐射口服制剂中用到的山药多糖可以是市售的山药多糖成品，也可以是自行从原植物中提取得到的山药多糖产品。
通过本发明所述方法得到的枇杷叶提取物经检测含有熊果酸、齐墩果酸等三萜类有效成分，具有增强机体免疫力，抑制肿瘤形成等多种生理功能。这些成分在水中的溶解度较低，直接口服溶出较慢，本发明将其制成以磷脂修饰的脂质体后，可显著提高其生物利用度，另外口服类制剂也较易于施用。
本发明所述抗辐射口服制剂中的有效成分取自山药和枇杷叶，药理作用清楚可靠，具有较好的抗辐射效果，成本较低且毒副作用小；枇杷叶提取物中的有效成分以脂质体形式存在，生物利用度高。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明所述山药多糖、枇杷叶提取物抗辐射口服制剂及制备方法作进一步说明。下述各实施例中如无特别说明，所用到的原料山药多 糖均为市售山药多糖成品(生产厂家为武汉凌创食品有限公司，批号为20151001)。
实施例一
a.枇杷叶提取物的制备：将枇杷叶粉碎并过40目筛后加水煎煮2次，过滤后保留滤渣，滤渣经干燥后按照10ml/g的液固相比加入无水乙醇，70℃下回流提取8h，回收提取液中的乙醇后得到原料枇杷叶提取物；
b.抗辐射口服制剂的制备：取5g步骤a中制备的原料枇杷叶提取物，20g载体磷脂，加入无水乙醇中溶解后再加入25g原料山药多糖，75g辅料乳糖，75g辅料木糖醇，在100w功率下超声震荡15min，再经烘干、粉碎及分装后得到成品抗辐射口服制剂。
实施例二
a.枇杷叶提取物的制备：与实施例一中的原料枇杷叶提取物制备方法相同；
b.抗辐射口服制剂的制备：取5g步骤a中制备的原料枇杷叶提取物，5g载体磷脂，加入无水乙醇中溶解后再加入15g原料山药多糖，15g辅料乳糖，15g辅料木糖醇，在100w功率下超声震荡15min，再经烘干、粉碎并分装后得到成品抗辐射口服制剂。
实施例三
a.枇杷叶提取物的制备：与实施例一中的原料枇杷叶提取物制备方法基本相同，区别仅在于加水煎煮的次数为3次；
b.抗辐射口服制剂的制备：取5g步骤a中制备的原料枇杷叶提取物，15g载体磷脂，加入无水乙醇中溶解后再加入2.5g原料山药多糖，100g辅料乳糖，125g辅料木糖醇，在100w功率下超声震荡10min，再经烘干、粉碎并分装后得到成品抗辐射口服制剂。
实施例四
a.枇杷叶提取物的制备：与实施例三中的原料枇杷叶提取物制备方法相同；
b.抗辐射口服制剂的制备：取5g步骤a中制备的原料枇杷叶提取物，25g载体磷脂，加入无水乙醇中溶解后再加入30g原料山药多糖，150g辅料乳糖，100g辅料木糖醇，在100w功率下超声震荡20min，再经烘干、粉碎并分装后得到成品抗辐射口服制剂。
本实施例中使用的原料山药多糖是从原植物中自行提取的，具体提取方法如下：
将山药切碎后按照1：10的料液比加水混合后在100℃下回流提取2次，每次4h，合并水提液，过滤后将滤液减压浓缩至原体积的1/3，浓缩液中加入乙醇至溶液中醇浓度达到80％，醇沉12h，沉淀部分经干燥后得到原料山药多糖。
实施例五
a.枇杷叶提取物的制备：与实施例一中的原料枇杷叶提取物制备方法基本相同，区别仅在于加水煎煮的次数为4次；
b.抗辐射口服制剂的制备：取5g步骤a中制备的原料枇杷叶提取物，25g载体磷脂，加入无水乙醇中溶解后再加入40g原料山药多糖，125g辅料乳糖，150g辅料木糖醇，在100w功率下超声震荡18min，再经烘干、粉碎并分装后得到成品抗辐射口服制剂。
本实施例中使用的原料山药多糖是从原植物中自行提取的，提取方法同实施例四。
实施例六
a.枇杷叶提取物的制备：与实施例五中的原料枇杷叶提取物制备方法相同；
b.抗辐射口服制剂的制备：取5g步骤b中制备的原料枇杷叶提取物，10g载体磷脂，加入无水乙醇中溶解后再加入5g原料山药多糖，5g辅料乳糖，5g辅料木糖醇，在100w功率下超声震荡20min，再经烘干、粉碎并分装后得到成品抗辐射口服制剂。
本实施例中使用的原料山药多糖是从原植物中自行提取的，提取方法同实施例四。
产品质量实验
1、含量测定
本发明制得的产品中的有效成分以熊果酸计，选用高效液相色谱法测定成品中有效成分的含量。
色谱条件：选用甲醇：水(90:10，v/v)作为流动相，用三乙胺(每10ml水中加入0.06ml三乙胺)和冰醋酸作为缓冲液调节ph至6.5。选用c18柱(4.6×250mm，5μm)作为含量测定的色谱柱，选用210nm作为检测波长。
测定方法：精密称取熊果酸对照品，用流动相溶解，并配制成约30μg/ml的溶液，作为外标溶液。取若干袋本发明制备的产品(约含熊果酸150mg)，倒出内容物，混匀，取约相当于30mg熊果酸的产品作为样品，精密称定，用50％甲醇溶解至100ml，过滤，精密吸取滤液1ml至10ml容量瓶，用流动相定容，作为样品溶液。分别取外标溶液和样品溶液20μl注入hplc中，记录色谱图，按外标法计算本品中熊果酸的含量。
通过上述实验测得前述各实施例所制备的产品含量的范围在90～105％。
2、包封率的测定
取若干袋本发明制备的产品(约含熊果酸150mg)，倒出内容物，混匀，取约相当于30mg熊果酸的产品作为样品，加水至约100ml。取5ml至离心管中，70000rpm离心2小时，取上清液1ml至10ml容量瓶，流动相定容。另取未离心的原液1ml至10ml容量瓶，并以流动相定容。照前述含量测定项下色谱条件，取20μl注入hplc中，记录色谱图，按以下公式计算包封率：
包封率＝(总药量-游离药量)/总药量×100％＝(原液主峰面积-上清液主峰面积)/原液主峰面积×100％。
通过上述实验测得前述各实施例制备的产品包封率的范围在90～98％。
3、粒子大小的测定
取本发明制备的产品1g，加水约200ml溶解，采用电子显微镜或激光粒度仪测定本品的粒径大小和粒度分布。
通过上述实验测得前述各实施例制备的产品平均粒径的范围在220～300nm。
生物利用度比较实验
材料与仪器：高效液相色谱仪；电子分析天平、ph计、超声清洗器、离心机、涡旋混合器、氮气吹干器、本发明制备的产品、枇杷叶提取物、齐墩果酸标准品、乙酸乙酯、甲醇、乙腈。
实验动物与给药方法：sd大鼠12只，雌雄不拘，体重200±20g，实验前禁食12h后，随机分成2组，采用灌胃方式分别施予本发明制得的产品(相当于齐墩果酸30mg/kg)和相应剂量的枇杷叶提取物水混悬液。灌胃后分别在0、0.25、0.5、1、2、3、4、6、12、24h时间点从大鼠眼眶取血0.3ml与肝素抗凝的试管中，10000r/min离心10min，小心吸取血浆，-20℃低温保存，3天内完成齐墩果 酸血药浓度的测定。
血浆样品分析方法：a、样品处理方法：精取待测血浆100μl，加入内标溶液30μl及乙酸乙酯2ml漩涡混合3min后在3000rpm转速下离心10min，精取乙酸乙酯层1.5ml于另一离心管，并在50℃加热条件下氮气吹干，残渣用100μl甲醇溶解并在10000rpm转速下离心5min，取上清液40μl进样。b、色谱条件：选用4.6×250mm的c18柱，流动相为乙腈：磷酸盐缓冲液(ph3.5)＝80:20(每500ml流动相中含9mmol的γ环糊精)；检测波长210nm，流速1ml/min，采用内标法计算血浆中齐墩果酸的含量。
统计学处理：达峰时间tmax(h)及缝制浓度cmax(μl/ml)取实际值，用药-时曲线尾部几个时间点的血药浓度(c)取对数后对时间(t)进行回归，采用梯形法计算曲线下面积auc，实验结果如表1所示。
表1：受试大鼠单剂量灌胃后的药动学参数对比(
从表1可以看出，枇杷叶提取物中的有效成分在水中的溶解度较低，口服后溶出较慢，影响其在体内的吸收。本发明将枇杷叶提取物中的有效成分制成脂质体后，可显著改善有效成分的口服生物利用度。由结果可见，本发明制得的产品与枇杷叶提取物相比，单次灌胃给药后，齐墩果酸在大鼠体内的相对生物度为771％。
抗辐射效果实验
本发明所制备产品的成人推荐量为每日150mg。按成人60kg体重计，即2.5mg/kg·bw，按人体推荐摄入量的10倍、20倍(分别为25、50mg/kg·bw)施予受试物，并设置辐射对照组及枇杷叶提取物组。产品组以蒸馏水将本发明制备的产品配制成所需浓度灌胃，枇杷叶提取物组所含的有效成分和使用量与产品组相同。
材料与仪器：电子天平，显微镜，722分光光度计，微量冷冻离心机等，盐酸、giemsa染液，甲醇，小牛血清，sod试剂盒(南京建成生物工程研究所)， 乙醇，三氯甲烷等。
统计方法：计量资料采用方差分析和q检验法，计数资料采用卡方检验(sas8.1)。
实验动物：选取体重18～22g的昆明种雄性小鼠(合格证号为医动字19-006号)作为实验动物进行下述各项实验。
1、白细胞计数实验：取50只实验动物编号后采血计数白细胞，再按白细胞水平，并参考体重随机分为4个剂量组和1个辐射对照组，每组10只。剂量组分别按人体推荐摄入量(2.5mg/kg.bw)的10倍、20倍(即25、50mg/kg.bw)给予受试物，辐射对照组给予蒸馏水。各组小鼠灌胃容量均为0.20ml/kg.bw，连续灌胃30天后，接受60co-γ射线5.0gy的照射。辐照后各组动物继续给予受试物或对照物，并分别于照射后3天和14天再次采血计数白细胞，以观察白细胞的变化。小鼠白细胞计数实验结果见表2。
表2：本发明制备的产品对辐照后小鼠白细胞计数的影响
注：*标示与辐射对照组相比，有显著性差异(p＜0.05)
从表2可以看出，辐照前各组小鼠白细胞计数没有明显差异，辐照后小鼠白细胞数显著下降，但随着时间的延长逐渐回升。辐照后3天各剂量组白细胞数高于同期对照组，但没有统计学差异。辐照后14天产品10倍、20倍剂量组显著高于同期对照。枇杷叶提取物的10倍剂量组与对照组相比没有明显差异，20倍剂量组与对照组相比有明显差异。该结果表明本发明制备的产品所含有效成分的脂质体有明显促进辐照后小鼠白细胞回升的作用，其效果优于枇杷叶提取物组。
2、骨髓细胞微核率试验：取50只实验动物按体重随机分为4个剂量组和1个辐射对照组，每组10只。剂量组和对照组的剂量设置及灌胃容量同白细胞计数实验。各组小鼠连续灌胃30天后，接受60co-γ射线5.0gy的照射。辐照后各组动物继续给予受试物或对照物，并于照射后3天颈椎脱臼处死，取胸骨骨髓涂片，甲醇固定，giemsa染液染色，显微镜下计数每片1000个嗜多染红细胞中的微核细胞数，并计算微核率和抑制率。小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率实验结果见表3。
表3：本发明制备的产品对辐照小鼠微核率的影响
注：**标示与辐射对照组相比，有极显著性差异(p＜0.01)差异
从表3可以看出，施予本发明制备的产品后，辐照小鼠的微核率有明显下降，其中的两个产品剂量组小鼠微核率与辐射对照组相比均有极显著性差异。枇杷叶提取物的两个剂量组中，只有高剂量组与辐射对照组相比有极显著性差异，低剂量组没有显著性差异，表明本发明制备的产品所含有效成分的脂质体具有降低辐照小鼠胸骨骨髓嗜多染红细胞微核率的作用，其效果优于枇杷叶提取物组。
3、红细胞sod活性试验：取50只实验动物按体重随机分为4个剂量组和1个辐射对照组，每组10只。剂量组和对照组的剂量设置及灌胃容量同白细胞计数实验。各组小鼠连续灌胃30天后，接受60co-γ射线7.0gy的照射。辐照后各组动物继续给予受试物或对照物，并于辐照后7天采血，测定血红蛋白含量和红细胞sod活性。小鼠红细胞sod活性的实验结果见表4。
表4：本发明制备的产品对辐照小鼠红细胞sod活性的影响
注：*分别表示与辐射对照组相比，有显著性(p＜0.05)差异
从表4可以看出，施予本发明制备的产品后，产品剂量组的小鼠红细胞sod活性高于辐射对照组，产品10倍、20倍两个剂量组与辐射对照组相比有显著性差异，表明本发明制备的产品具有升高辐照小鼠红细胞sod活性的作用，而枇杷叶提取物在两种剂量下对辐照小鼠红细胞sod的活性均没有作用。
4、血清溶血素水平试验：取50只动物按体重随机分为4个剂量组和1个辐射对照组，每组10只。剂量组和对照组的剂量设置及灌胃容量同白细胞计数实验。各组小鼠连续灌胃30天后，接受60co-γ射线2.0gy的照射。辐照后各组动物继续给予受试物或对照物，并于辐照后7天采血，测定血清的半数溶血值(hc50)。小鼠血清溶血素水平实验结果见表5。
表5：本发明制备的产品对辐照小鼠血清溶血素水平(hc50)的影响
注：**分别表示与辐射对照组相比，有极显著性(p＜0.01)差异
从表5可以看出，给予本发明制备的产品后，10倍、20倍两个剂量组小鼠血清溶血素水平极显著高于辐射对照组，表明本发明制备的产品具有升高辐照小 鼠血清溶血素水平的作用。枇杷叶提取物的两个剂量组与辐射对照组相比没有显著性差异。
从上述四个抗辐射效果实验可以看出本发明制备的产品对60co-γ射线一次性高剂量照射后的小鼠，有显著升高小鼠白细胞数、降低骨髓细胞嗜多染红细胞微核率、提高红细胞sod活性和血清溶血素水平的作用，并且其作用明显优于枇杷叶提取物。