本发明属于生物技术领域，具体涉及lsectin在作为治疗和/或预防埃博拉病毒的靶点中的应用。
背景技术：
埃博拉病毒导致人出血热于1976年被首次报道，致死率高达90％。埃博拉病毒感染人体会有4-10天的潜伏期。这个期间患者表现为流感样的症状，包括发热、头疼和肌肉痛等。潜伏期后，伴随腹部疼痛、恶心和呕吐。接下来是肠道、呼吸和神经系统的并发症，这主要是因为病毒的大量复制和肝脏、脾脏和肾脏的细胞坏死导致的。疾病的末期将会导致凝血功能异常，例如弥散性血管内凝血、体液分布问题、低压和出血。在致死性病例中，7-16天将会出现死亡病例，主要表现为多器官衰竭和休克。在埃博拉病毒感染的动物模型中，巨噬细胞和树突状细胞分泌的大量促炎性细胞因子是导致多器官损伤和严重凝血障碍的主要原因。更重要的是，临床研究也显示致死性埃博拉病毒感染的典型特征同样为大量的炎性细胞因子分泌，通常称为“细胞因子风暴”。
gp(glycoprotein)是埃博拉病毒的唯一外膜糖蛋白。最近有研究证明埃博拉病毒的外膜糖蛋白(glycoprotein，gp)参与此病理过程。在病毒感染过程中，病人血液中含有大量的可溶性gp蛋白。这些gp蛋白能够诱导巨噬细胞和树突状细胞分泌大量的促炎性细胞因子。此外，由病毒蛋白40和gp蛋白组成的埃博拉病毒样颗粒(virus-likeparticles，vlp)同样能够诱导巨噬细胞和树突状细胞分泌大量的促炎性细胞因子，并依赖于gp蛋白的存在。这些证据均说明gp蛋白能够诱导炎性反应，并参与埃博拉病毒出血热的致病过程。
技术实现要素：
本发明的一个目的是提供抑制lsectin表达和/或活性的物质的新用途。
本发明提供了抑制lsectin表达和/或活性的物质在制备具有如下(1)-(3)中至少一种功能的产品中的应用：
(1)治疗和/或预防由埃博拉病毒引起的疾病；
(2)抑制树突状细胞分泌炎性细胞因子；
(3)抑制树突状细胞中syk激酶的磷酸化；
所述树突状细胞为由埃博拉病毒颗粒或gp1糖蛋白诱导或刺激后的树突状细胞。
上述应用中，所述抑制lsectin表达和/或活性的物质为干扰lsectin表达的sirna。
上述应用中，所述干扰lsectin表达的sirna为序列1所示的rna分子；
所述炎性细胞因子为人肿瘤坏死因子α、白介素6、白介素8、白介素10和/或巨噬细胞炎性蛋白1α。
本发明的另一个目的是提供一种产品。
本发明提供的产品的活性成分为抑制lsectin表达和/或活性的物质，所述产品的用途为如下(1)-(3)中的至少一种：
(1)治疗和/或预防由埃博拉病毒引起的疾病；
(2)抑制树突状细胞分泌炎性细胞因子；
(3)抑制树突状细胞中syk激酶的磷酸化；
所述树突状细胞为由埃博拉病毒颗粒或gp1糖蛋白诱导或刺激后的树突状细胞。
上述产品中，所述抑制lsectin表达和/或活性的物质为干扰lsectin表达的sirna。
上述产品中，
所述干扰lsectin表达的sirna为序列1所示的rna分子；
所述炎性细胞因子为人肿瘤坏死因子α、白介素6、白介素8、白介素10和/或巨噬细胞炎性蛋白1α。
本发明还有一个目的是提供syk激酶抑制剂的新用途。
本发明提供了syk激酶抑制剂在如下(1)或(2)中的应用：
(1)治疗和/或预防由埃博拉病毒引起的疾病；
(2)抑制树突状细胞分泌炎性细胞因子；
所述树突状细胞为由埃博拉病毒颗粒或gp1糖蛋白诱导或刺激后的树突状细胞。
上述应用中，所述syk激酶抑制剂为piceatannol(白皮杉醇)或r406。
上述应用中，所述炎性细胞因子为人肿瘤坏死因子α和/或白介素6。
上述应用或上述产品中，所述产品为药物。
本发明首先发现了树突状细胞上特异表达lsectin，并敲低了人树突状细胞上表达的lsectin，得到lsectin敲低的树突状细胞。通过实验证明：lsectin敲低的树突状细胞被埃博拉病毒样颗粒刺激诱导后人肿瘤坏死因子α、白介素6、白介素8、白介素10和巨噬细胞炎性蛋白1α的分泌量明显降低，syk激酶抑制剂处理后的树突状细胞被埃博拉病毒样颗粒刺激诱导后人肿瘤坏死因子α和白介素6的分泌量也明显降低。lsectin是一种新的埃博拉病毒治疗的靶点，为埃博拉病毒导致人出血热的治疗提供了新思路。
附图说明
图1为外周血细胞上lsectin的表达情况。
图2为树突状细胞上lsectin的表达情况。
图3lsectin抗体检测lsectinsirna的敲低情况。
图4为lsectin促进昆虫细胞来源的埃博拉病毒样颗粒导致的细胞因子分泌。
图5为lsectin促进293t细胞来源的埃博拉病毒样颗粒导致的细胞因子分泌。
图6为lsectin促进gp1蛋白导致的细胞因子分泌。
图7为昆虫细胞来源的埃博拉病毒样颗粒诱导syk的磷酸化依赖于lsectin。
图8为syk激酶抑制剂抑制昆虫细胞来源的埃博拉病毒样颗粒导致的细胞因子分泌。
图9为syk激酶抑制剂抑制293t细胞来源的埃博拉病毒样颗粒导致的细胞因子分泌。
图10为syk激酶抑制剂抑制gp1蛋白导致的细胞因子分泌。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的杆状病毒表达载体rbvvp40和杆状病毒表达载体rbv-gp-vp40均在文献“ebolavirus-likeparticlesproducedininsectcellsexhibitdendriticcellstimulatingactivityandinduceneutralizingantibodies”中公开过，公众可从中国人民解放军军事医学科学院处获得。
下述实施例中的抗人lsectin单克隆抗体在文献“liversinusoidalendothelialcelllectin,lsectin,negativelyregulateshepatict-cellimmuneresponse”中公开过，公众可从中国人民解放军军事医学科学院处获得。
下述实施例中的pires2-egfp-fc载体在文献“thedc-signfamilymemberlsectinisanovelligandofcd44onactivatedtcells”中公开过，公众可从中国人民解放军军事医学科学院处获得。
下述实施例中的人肿瘤坏死因子α、白介素6、白介素8、白介素10和巨噬细胞炎性蛋白1α的elisa检测试剂盒均购自ebioscience，货号分别是88-7346-22、88-7066-22、88-8086-22、88-7106-22和88-7035-22。
实施例1、lsectin特异表达在树突状细胞(dcs)
1、人外周血单核细胞上lsectin的表达情况
将人外周血进行密度梯度离心，获得人外周血单个核细胞；将获得的人外周血单个核细胞1500rpm离心5分钟，弃上清，用pbs重悬再洗涤2遍；再用封闭性抗体(ebioscience，14-9161-73)冰上封闭20分钟；然后加入抗人lsectin单克隆抗体冰上孵育40分钟。用pbs洗涤2遍；加入pe标记的抗小鼠igg二抗(biolegend，405307)冰上孵育30分钟，得到标记后的人外周血单个核细胞；用流式分析仪(bdcalibur)对标记后的人外周血单个核细胞进行流式检测。
结果如图1所示，在流式细胞仪上人外周血单核细胞分为三个亚群，分别是粒细胞、单核细胞和淋巴细胞，且粒细胞、单核细胞和淋巴细胞这三个细胞亚群均不表达lsectin。
2、树突状细胞上lsectin的表达情况
用含有10％胎牛血清的rpmi-1640培养基(胎牛血清购买自gibco，货号是16000-044；rpmi-1640培养基购自hyclone，货号是sh30022.01)重悬步骤1中获得的外周血单个核细胞，并将其接种至细胞培养皿，接种1h后，去除悬浮细胞，获得贴壁细胞(此细胞为单核细胞)；将贴壁细胞置于含有gm-csf(800u/ml)和il-4(400u/ml)的细胞因子的培养基(培养基为含有10％胎牛血清的培养基)培养，培养3天后，进行细胞半量换液，培养至第5天，获得的细胞即为人树突状细胞；用抗人lsectin单克隆抗体标记人树突状细胞，得到标记后的人树突状细胞；用流式细胞仪对标记后的人树突状细胞进行流式检测。
结果如图2所示，人树突状细胞表达lsectin。
实施例2、抑制lsectin表达的物质在埃博拉病毒样颗粒或gp糖蛋白诱导树突状细胞分泌炎性细胞因子中的应用
一、应用sirna技术敲低人树突状细胞上表达的lsectin
应用sirna技术敲低人树突状细胞上的lsectin(lsectin的编码基因的核苷酸序列为序列5；lsectin的氨基酸序列为序列6)。具体步骤如下：
1、sirna序列和阴性对照sirna序列的合成
通过上海吉码公司合成lsectin的sirna序列和阴性对照sirna序列。序列如下：sirna序列：5′-gcgcgagaactgtgtcatgat-3′(序列1)；阴性对照sirna序列：5′-ttctccgaacgtgtcacgttt-3′。用depc处理的水稀释上述sirna序列和阴性对照sirna序列。
2、转染
将200μl的rpmi-1640培养基(hyclone，货号是sh30022.01)、sirna序列和12μl的sirna转染试剂(sirna转染试剂购自polyplustransfection公司)混匀，得到转染液a，sirna序列在转染液a中的终浓度是20nm；涡旋振荡10秒，室温静置15分钟，得到sirna溶液。将sirna溶液添加到含有5×105个人树突状细胞的6孔板中，48h后，将细胞裂解，得到转染lsectinsirna的人树突状细胞(lsectin敲低的树突状细胞，lsectinsirna)；
将200μl的rpmi-1640培养基(hyclone，货号是sh30022.01)、阴性对照sirna序列和12μl的sirna转染试剂(sirna转染试剂购自polyplustransfection公司)混匀，得到转染液b，阴性对照sirna序列在转染液b中的终浓度是20nm；涡旋振荡10秒，室温静置15分钟，得到阴性对照溶液。将阴性对照溶液添加到含有5×105个人树突状细胞的6孔板中，48h后，将细胞裂解，得到转染阴性对照sirna的人树突状细胞(lsectin未敲低的树突状细胞，对照lsectin或controlsirna)。
3、westernblot方法检测细胞中lsectin的表达量
用westernblot方法分别检测转染lsectinsirna的人树突状细胞和转染阴性对照sirna的人树突状细胞中的lsectin的表达量。westernblot方法检测细胞中lsectin的表达量的具体步骤如下：
(1)电泳
转染lsectinsirna的人树突状细胞和转染阴性对照sirna的人树突状细胞裂解液15微升上样，用90伏电压跑胶，样品跑至浓缩胶与分离胶交界处后，换成180伏电压跑胶。
(2)转膜
转膜45min，至0.45微米的pvdf膜上。
(3)封闭
将膜用含5％脱脂奶粉的封闭液封闭1小时。
(4)孵育一抗
用洗涤液tbst-吐温20洗涤3次，然后孵育抗人lsectin抗体(abcam，ab181196)，在4℃过夜。
(5)孵育二抗
用洗涤液tbst-吐温20洗涤4-5次，然后孵育抗兔igg-hrp抗体(bethyl，a120-101p)，室温孵育50分钟。
(6)显影
用洗涤液tbst-吐温20洗涤5次后，用显色底物孵育5分钟，然后显影。
结果如图3所示，与转染阴性对照sirna的人树突状细胞相比，转染lsectinsirna的人树突状细胞中lsectin表达量明显降低。说明本发明成功敲除了人树突状细胞中的lsectin。
二、应用昆虫细胞来源的埃博拉病毒样颗粒刺激lsectin敲低的树突状细胞
1、昆虫细胞来源的vp40蛋白和vlp蛋白的获得
将杆状病毒表达载体rbvvp40感染sf9昆虫细胞(百恩维，c0008)，感染48h后，离心，收集上清液。将收集的上清液3.5×104转离心1h，收集沉淀。将沉淀用pbs充分溶解，并缓慢加到梯度为10-30-50％蔗糖上层液面上，3.5×104转离心1.5h，收集30-50％蔗糖液面间白带，并溶解在pbs中。3.5×104转继续离心2h，去除蔗糖，用适量pbs溶解沉淀，获得纯化的vp40蛋白(昆虫细胞来源的病毒蛋白40)。
将杆状病毒表达载体rbv-gp-vp40感染sf9昆虫细胞(百恩维，c0008)，感染48h后，离心，收集上清液。将收集的上清液3.5×104转离心1h，收集沉淀。将沉淀用pbs充分溶解，并缓慢加到梯度为10-30-50％蔗糖上层液面上，3.5×104转离心1.5h，收集30-50％蔗糖液面间白带，并溶解在pbs中。3.5×104转继续离心2h，去除蔗糖，用适量pbs溶解沉淀，获得纯化的vlp蛋白(昆虫细胞来源的病毒样颗粒)。
2、lsectin敲低的树突状细胞被埃博拉病毒样颗粒刺激后的炎性细胞因子分泌情况及syk激酶磷酸化情况
(1)埃博拉病毒样颗粒刺激lsectin敲低的树突状细胞
将步骤1获得的纯化后的vp40蛋白(昆虫细胞来源的病毒蛋白40)与lsectin敲低的树突状细胞(lsectinsirna)混匀(vp40蛋白的终浓度是10μg/ml)，用vp40蛋白刺激lsectin敲低的树突状细胞，刺激24h后，收获上清，得到vp40蛋白刺激后的lsectinsirna；
将步骤1获得的纯化后的vp40蛋白(昆虫细胞来源的病毒蛋白40)与lsectin未敲低的树突状细胞(对照sirna)混匀(vp40蛋白的终浓度是10μg/ml)，用vp40蛋白刺激lsectin未敲低的树突状细胞，刺激24h后，收获上清，得到vp40蛋白刺激后的对照sirna；
将步骤1获得的纯化后的vlp蛋白(昆虫细胞来源的病毒样颗粒)与lsectin敲低的树突状细胞(lsectinsirna)混匀(vlp蛋白的终浓度是10μg/ml)，用vlp蛋白刺激lsectin未敲低的树突状细胞，刺激24h后，收获上清，得到vlp蛋白刺激后的lsectinsirna；
将步骤1获得的纯化后的vlp蛋白(昆虫细胞来源的病毒样颗粒)与lsectin未敲低的树突状细胞混匀(vlp蛋白的终浓度是10μg/ml)，用vlp蛋白刺激lsectin未敲低(对照sirna)的树突状细胞，刺激24h后，收获上清，得到vlp蛋白刺激后的对照sirna。
(2)用人肿瘤坏死因子α、白介素6、白介素8、白介素10和巨噬细胞炎性蛋白1α的elisa检测试剂盒分别检测步骤(1)获得的vp40蛋白刺激后的lsectinsirna、vp40蛋白刺激后的对照sirna、vlp蛋白刺激后的lsectinsirna和vlp蛋白刺激后的对照sirna的人肿瘤坏死因子α、白介素6、白介素8、白介素10和巨噬细胞炎性蛋白1α的分泌情况。并在刺激不同时间点利用westernblot方法检测vlp蛋白刺激后的lsectinsirna和vlp蛋白刺激后的对照sirna的syk激酶的磷酸化情况。westernblot方法检测syk和磷酸化syk的具体步骤参照步骤一的三中的方法。
细胞因子的分泌结果如图4所示，lsectin敲低的树突状细胞和lsectin未敲低的树突状细胞被vp40蛋白刺激后人肿瘤坏死因子α、白介素6、白介素8、白介素10和巨噬细胞炎性蛋白1α的分泌量无显著性差异，但和lsectin未敲低的树突状细胞相比，lsectin敲低的树突状细胞被昆虫细胞来源vlp蛋白刺激诱导后人肿瘤坏死因子α、白介素6、白介素8、白介素10和巨噬细胞炎性蛋白1α的分泌量明显降低。
syk的磷酸化的检测结果如图7所示：从图7可以看出，埃博拉病毒样颗粒能够明显诱导syk的磷酸化，但lsectin敲低后，syk的磷酸化明显降低，说明埃博拉病毒样颗粒通过lsectin诱导syk激酶的磷酸化。
三、应用293t细胞来源的埃博拉病毒样颗粒刺激lsectin敲低的树突状细胞
1、gp蛋白和vp40的获得
(1)制备pires2-egfp-gp和pires2-egfp-vp40质粒表达载体
将gp蛋白的编码基因(序列2)插入载体pires2-egfp(addgene，6029-1)的nhei和bglii酶切位点得到的重组载体pires2-egfp-gp；
将vp40蛋白的编码基因(序列3)插入载体pires2-egfp的nhei和bglii酶切位点得到的重组载体pires2-egfp-vp40。
(2)293t细胞来源的vp40蛋白和vlp蛋白的获得
根据转染试剂的说明书，将上述步骤(1)获得的重组载体pires2-egfp-vp40单独转染至293t细胞(协和细胞资源中心)，转染48h后，离心去除细胞碎片收获上清，2.6×104转离心2h，收集沉淀，并用nte溶液充分溶解，获得纯化后的vp40蛋白(293t细胞来源的病毒蛋白40)。
根据转染试剂的说明书，将上述重组载体pires2-egfp-gp和重组载体pires2-egfp-vp40共转染至293t细胞，转染48h后，离心去除细胞碎片收获上清，2.6×104转离心2h，收集沉淀，并用nte溶液充分溶解，获得纯化后的vlp蛋白(293t细胞来源的病毒样颗粒)。
2、lsectin敲低的树突状细胞被埃博拉病毒样颗粒刺激后的炎性细胞因子分泌情况
(1)埃博拉病毒样颗粒刺激lsectin敲低的树突状细胞
将步骤1获得的纯化后的vp40蛋白(293t细胞来源的病毒蛋白40)与lsectin敲低的树突状细胞(lsectinsirna)混匀(vp40蛋白的终浓度是10μg/ml)，用vp40蛋白刺激lsectin敲低的树突状细胞，刺激24h后，收获上清，得到vp40蛋白刺激后的lsectinsirna；
将步骤1获得的纯化后的vp40蛋白(293t细胞来源的病毒蛋白40)与lsectin未敲低的树突状细胞(对照sirna)混匀(vp40蛋白的终浓度是10μg/ml)，用vp40蛋白刺激lsectin未敲低的树突状细胞，刺激24h后，收获上清，得到vp40蛋白刺激后的对照sirna；
将步骤1获得的纯化后的vlp蛋白(293t细胞来源的病毒样颗粒)与lsectin敲低的树突状细胞(lsectinsirna)混匀(vlp蛋白的终浓度是10μg/ml)，用vlp蛋白刺激lsectin未敲低的树突状细胞，刺激24h后，收获上清，得到vlp蛋白刺激后的lsectinsirna；
将步骤1获得的纯化后的vlp蛋白(293t细胞来源的病毒样颗粒)与lsectin未敲低的树突状细胞混匀(vlp蛋白的终浓度是10μg/ml)，用vlp蛋白刺激lsectin未敲低(对照sirna)的树突状细胞，刺激24h后，收获上清，得到vlp蛋白刺激后的对照sirna。
(2)用人肿瘤坏死因子α、白介素6、白介素8、白介素10和巨噬细胞炎性蛋白1α的elisa检测试剂盒分别检测步骤(1)获得的vp40蛋白刺激后的lsectinsirna、vp40蛋白刺激后的对照sirna、vlp蛋白刺激后的lsectinsirna和vlp蛋白刺激后的对照sirna的人肿瘤坏死因子α、白介素6、白介素8、白介素10和巨噬细胞炎性蛋白1α的分泌情况。
细胞因子的分泌结果如图5所示，lsectin敲低的树突状细胞和lsectin未敲低的树突状细胞被vp40蛋白刺激后人肿瘤坏死因子α、白介素6、白介素8、白介素10和巨噬细胞炎性蛋白1α的分泌量无显著性差异，但和lsectin未敲低的树突状细胞相比，lsectin敲低的树突状细胞被293t细胞来源的vlp蛋白刺激诱导后人肿瘤坏死因子α、白介素6、白介素8、白介素10和巨噬细胞炎性蛋白1α的分泌量明显降低。
四、应用包板的埃博拉病毒gp1-fc蛋白刺激lsectin敲低的树突状细胞
1、gp1-fc蛋白的获得
(1)重组载体pires2-egfp-fc-gp1
将gp1蛋白的编码基因(序列4)插入到pires2-egfp-fc载体的nhei和和bglii酶切位点间，得到重组载体pires2-egfp-fc-gp1。
(2)根据转染试剂的说明书，将上述重组载体pires2-egfp-fc-gp1共转至293t细胞，24h后，更换无血清培养基，过夜后，收集无血清培养基，4℃保存，添加新鲜无血清培养基，继续培养24h，收集上清，在4℃条件下，将收获的上清3800rpm离心10min，0.45μm滤膜过滤，应用proteing凝胶柱纯化得到gp1-fc蛋白，并将纯化的gp1-fc蛋白包被在96孔板中。
2、lsectin敲低的树突状细胞被埃博拉病毒样颗粒刺激后的炎性细胞因子分泌情况
(1)埃博拉病毒gp1-fc蛋白刺激lsectin敲低的树突状细胞
将步骤1纯化后的gp1-fc蛋白与磷酸盐缓冲液混合(gp1-fc蛋白的终浓度是10μg/ml)，得到混合液1；取100μl混合液1添加到96孔板中，37℃，2h后弃掉混合液；将5×104个lsectin敲低的树突状细胞(lsectinsirna)接种到此96孔板中，用包被的gp1-fc蛋白刺激lsectin敲低的树突状细胞，刺激24h后，收获上清，得到gp1-fc蛋白刺激后的lsectinsirna；
将步骤1纯化后的gp1-fc蛋白与磷酸盐缓冲液混合(gp1-fc蛋白的终浓度是10μg/ml)，得到混合液2；取100μl混合液2添加到96孔板中，37℃，2h后弃掉混合液；将5×104个lsectin未敲低的树突状细胞(对照sirna)接种到此96孔板中，用包被的gp1-fc蛋白刺激lsectin未敲低的树突状细胞，刺激24h后，收获上清，得到gp1-fc蛋白刺激后的对照sirna；
将人igg(购自中科锐进，对照fc)与磷酸盐缓冲液混合(人igg蛋白的终浓度是10μg/ml)，得到混合液3；取100μl混合液3添加到96孔板中，37℃，2h后弃掉混合液；将5×104个lsectin敲低的树突状细胞(lsectinsirna)接种到此96孔板中，用包被的人igg刺激lsectin敲低的树突状细胞，刺激24h后，收获上清，得到人igg刺激后的lsectinsirna；
将人igg(购自中科锐进，对照fc)与磷酸盐缓冲液混合(人igg蛋白的终浓度是10μg/ml)，得到混合液4；取100μl混合液4添加到96孔板中，37℃，2h后弃掉混合液；将5×104个lsectin未敲低(对照sirna)的树突状细胞接种到此96孔板中，用包被的人igg刺激lsectin敲低的树突状细胞，刺激24h后，收获上清，得到人igg刺激后的对照sirna。
(2)用人肿瘤坏死因子α、白介素6、白介素8、白介素10和巨噬细胞炎性蛋白1α的elisa检测试剂盒分别检测步骤(1)获得的gp1-fc蛋白刺激后的lsectinsirna、gp1-fc蛋白刺激后的对照sirna、人igg刺激后的lsectinsirna和人igg刺激后的对照sirna的人肿瘤坏死因子α、白介素6、白介素8、白介素10和巨噬细胞炎性蛋白1α的分泌情况。
检测结果如图6所示，lsectin敲低的树突状细胞和lsectin未敲低的树突状细胞被对照fc刺激后人肿瘤坏死因子α、白介素6、白介素8、白介素10和巨噬细胞炎性蛋白1α的分泌量无显著性差异，但和lsectin未敲低的树突状细胞相比，lsectin敲低的树突状细胞被gp1-fc蛋白刺激诱导后人肿瘤坏死因子α、白介素6、白介素8、白介素10和巨噬细胞炎性蛋白1α的分泌量明显降低。
实施例3、syk激酶抑制剂在抑制埃博拉病毒样颗粒或gp糖蛋白诱导树突状细胞分泌炎性细胞因子中的应用
一、syk激酶抑制剂抑制昆虫细胞来源的埃博拉病毒样颗粒诱导的炎性细胞因子分泌
本步骤中的人树突状细胞为实施例1的步骤2制备的人树突状细胞，syk激酶的特异性抑制剂piceatannol和syk激酶的特异性抑制剂r406处理的人树突状细胞为不同批次。
1、syk激酶抑制剂处理人树突状细胞
(1)syk激酶的特异性抑制剂piceatannol处理人树突状细胞
将syk激酶的特异性抑制剂piceatannol(白皮杉醇，购自calbiochem)在37℃水浴锅中预处理人树突状细胞(piceatannol的终浓度是5μm；人树突状细胞数量均为5×104个)，处理30min后，得到piceatannol预处理后的树突状细胞；
将syk激酶的特异性抑制剂piceatannol(白皮杉醇，购自calbiochem)在37℃水浴锅中预处理人树突状细胞(piceatannol的终浓度是10μm；人树突状细胞数量均为5×104个)，处理30min后，得到piceatannol预处理后的树突状细胞；
将syk激酶的特异性抑制剂piceatannol(白皮杉醇，购自calbiochem)在37℃水浴锅中预处理人树突状细胞(piceatannol的浓度是20μm；人树突状细胞数量均为5×104个)，处理30min后，得到piceatannol预处理后的树突状细胞。
(2)syk激酶的特异性抑制剂r406处理人树突状细胞
将syk激酶的特异性抑制剂r406(购自selleckchem)在37℃水浴锅中预处理人树突状细胞(r406的浓度是1μm；人树突状细胞数量均是5×104个)，处理30min后，得到r406预处理后的树突状细胞；
将syk激酶的特异性抑制剂r406(购自selleckchem)在37℃水浴锅中预处理人树突状细胞(r406的浓度是2μm；人树突状细胞数量均是5×104个)，处理30min后，得到r406预处理后的树突状细胞；
将syk激酶的特异性抑制剂r406(购自selleckchem)在37℃水浴锅中预处理人树突状细胞(r406的浓度是5μm；人树突状细胞数量均是5×104个)，处理30min后，得到r406预处理后的树突状细胞。
(3)dmso(对照)处理人树突状细胞
将dmso(购自amersco)在37℃水浴锅中预处理人树突状细胞(dmso的体积是0.1μl；人树突状细胞数量均是5×104个)，处理30min后，得到dmso预处理后的树突状细胞；
将dmso(购自amersco)在37℃水浴锅中预处理人树突状细胞(dmso的体积是0.2μl；人树突状细胞数量均是5×104个)，处理30min后，得到dmso预处理后的树突状细胞；
将dmso(购自amersco)在37℃水浴锅中预处理人树突状细胞(dmso的体积是0.4μl；人树突状细胞数量均是5×104个)，处理30min后，得到dmso预处理后的树突状细胞。
2、树突状细胞被埃博拉病毒样颗粒刺激后的炎性细胞因子分泌情况
用昆虫细胞来源的埃博拉病毒样颗粒(实施例2中的步骤二获得)分别与步骤1获得的不同浓度的piceatannol、r406和dsmo预处理后的树突状细胞混匀(昆虫细胞来源的埃博拉病毒样颗粒的终浓度是10μg/ml)，用昆虫细胞来源的埃博拉病毒样颗粒刺激不同浓度的piceatannol、r406和dsmo预处理后的树突状细胞。其中，dsmo为对照，刺激24h后，elisa检测人肿瘤坏死因子α和白介素6细胞因子分泌情况。
检测结果如图8(横坐标代表的是不同浓度的dmso，piceatannol和r406，图中的黑三角从左向右依次代表浓度由低到高)所示，和dmso预处理后的树突状细胞相比，piceatannol预处理后的树突状细胞、r406预处理后的树突状细胞的人肿瘤坏死因子α和白介素6细胞因子的分泌量显著降低，说明syk激酶抑制剂piceatannol和r406具有抑制昆虫细胞来源的埃博拉病毒样颗粒诱导的炎性细胞因子分泌的功能。
二、syk激酶抑制剂抑制293t细胞来源的埃博拉病毒样颗粒诱导的炎性细胞因子分泌
本步骤中的人树突状细胞为实施例1的步骤2制备的人树突状细胞，syk激酶的特异性抑制剂piceatannol和syk激酶的特异性抑制剂r406处理的人树突状细胞为同一批次。
1、syk激酶抑制剂处理人树突状细胞
(1)syk激酶的特异性抑制剂piceatannol处理人树突状细胞
将syk激酶的特异性抑制剂piceatannol(白皮杉醇，购自calbiochem)在37℃水浴锅中预处理人树突状细胞(piceatannol的浓度是5μm；人树突状细胞数量均为5×104个)，处理30min后，得到piceatannol预处理后的树突状细胞；
将syk激酶的特异性抑制剂piceatannol(白皮杉醇，购自calbiochem)在37℃水浴锅中预处理人树突状细胞(piceatannol的浓度是10μm；人树突状细胞数量均为5×104个)，处理30min后，得到piceatannol预处理后的树突状细胞；
将syk激酶的特异性抑制剂piceatannol(白皮杉醇，购自calbiochem)在37℃水浴锅中预处理人树突状细胞(piceatannol的浓度是20μm；人树突状细胞数量均为5×104个)，处理30min后，得到piceatannol预处理后的树突状细胞；
(2)syk激酶的特异性抑制剂r406处理人树突状细胞
将syk激酶的特异性抑制剂r406(购自selleckchem)在37℃水浴锅中预处理人树突状细胞(r406的浓度是1μm；人树突状细胞数量均是5×104个)，处理30min后，得到r406预处理后的树突状细胞；
将syk激酶的特异性抑制剂r406(购自selleckchem)在37℃水浴锅中预处理人树突状细胞(r406的浓度是2μm；人树突状细胞数量均是5×104个)，处理30min后，得到r406预处理后的树突状细胞；
将syk激酶的特异性抑制剂r406(购自selleckchem)在37℃水浴锅中预处理人树突状细胞(r406的浓度是5μm；人树突状细胞数量均是5×104个)，处理30min后，得到r406预处理后的树突状细胞。
(3)dmso(对照)处理人树突状细胞
将dmso(购自amersco)在37℃水浴锅中预处理人树突状细胞(dmso的体积是0.1μl；人树突状细胞数量均是5×104个)，处理30min后，得到dmso预处理后的树突状细胞；
将dmso(购自amersco)在37℃水浴锅中预处理人树突状细胞(dmso的体积是0.2μl；人树突状细胞数量均是5×104个)，处理30min后，得到dmso预处理后的树突状细胞；
将dmso(购自amersco)在37℃水浴锅中预处理人树突状细胞(dmso的体积是0.4μl；人树突状细胞数量均是5×104个)，处理30min后，得到dmso预处理后的树突状细胞。
2、树突状细胞被埃博拉病毒样颗粒刺激后的炎性细胞因子分泌情况
用293t细胞来源的埃博拉病毒样颗粒(实施例2中的步骤三获得)分别与步骤1获得的不同浓度的piceatannol、r406和dsmo预处理后的树突状细胞混匀(293t细胞来源的埃博拉病毒样颗粒的终浓度是10μg/ml)，用293t细胞来源的埃博拉病毒样颗粒刺激不同浓度的piceatannol、r406和dsmo预处理后的树突状细胞。其中，dsmo为对照，刺激24h后，elisa检测人肿瘤坏死因子α和白介素6细胞因子分泌情况。
检测结果如图9(横坐标代表的是不同浓度的dmso，piceatannol和r406，图中黑三角从左向右依次代表浓度由低到高)所示，和dmso预处理后的树突状细胞相比，piceatannol预处理后的树突状细胞、r406预处理后的树突状细胞的人肿瘤坏死因子α和白介素6细胞因子的分泌量显著降低显著降低，说明syk激酶抑制剂piceatannol和r406具有抑制293t细胞来源的埃博拉病毒样颗粒诱导的炎性细胞因子分泌的功能。
三、syk激酶抑制剂抑制gp1-fc诱导的炎性细胞因子分泌
本步骤中的人树突状细胞为实施例1的步骤2制备的人树突状细胞，syk激酶的特异性抑制剂piceatannol和syk激酶的特异性抑制剂r406处理的人树突状细胞为不同批次。
1、syk激酶抑制剂处理人树突状细胞
(1)syk激酶的特异性抑制剂piceatannol处理人树突状细胞
将syk激酶的特异性抑制剂piceatannol(白皮杉醇，购自calbiochem)在37℃水浴锅中预处理人树突状细胞(piceatannol的浓度是5μm；人树突状细胞数量均为5×104个)，处理30min后，得到piceatannol预处理后的树突状细胞；
将syk激酶的特异性抑制剂piceatannol(白皮杉醇，购自calbiochem)在37℃水浴锅中预处理人树突状细胞(piceatannol的浓度是10μm；人树突状细胞数量均为5×104个)，处理30min后，得到piceatannol预处理后的树突状细胞；
将syk激酶的特异性抑制剂piceatannol(白皮杉醇，购自calbiochem)在37℃水浴锅中预处理人树突状细胞(piceatannol的浓度是20μm；人树突状细胞数量均为5×104个)，处理30min后，得到piceatannol预处理后的树突状细胞。
(2)syk激酶的特异性抑制剂r406处理人树突状细胞
将syk激酶的特异性抑制剂r406(购自selleckchem)在37℃水浴锅中预处理人树突状细胞(r406的浓度是1μm；人树突状细胞数量均是5×104个)，处理30min后，得到r406预处理后的树突状细胞；
将syk激酶的特异性抑制剂r406(购自selleckchem)在37℃水浴锅中预处理人树突状细胞(r406的浓度是2μm；人树突状细胞数量均是5×104个)，处理30min后，得到r406预处理后的树突状细胞；
将syk激酶的特异性抑制剂r406(购自selleckchem)在37℃水浴锅中预处理人树突状细胞(r406的浓度是5μm；人树突状细胞数量均是5×104个)，处理30min后，得到r406预处理后的树突状细胞。
(3)dmso(对照)处理人树突状细胞
将dmso(购自amersco)在37℃水浴锅中预处理人树突状细胞(dmso的体积是0.1μl；人树突状细胞数量均是5×104个)，处理30min后，得到dmso预处理后的树突状细胞；
将dmso(购自amersco)在37℃水浴锅中预处理人树突状细胞(dmso的体积是0.2μl；人树突状细胞数量均是5×104个)，处理30min后，得到dmso预处理后的树突状细胞；
将dmso(购自amersco)在37℃水浴锅中预处理人树突状细胞(dmso的体积是0.4μl；人树突状细胞数量均是5×104个)，处理30min后，得到dmso预处理后的树突状细胞。
2、树突状细胞被埃博拉病毒样颗粒刺激后的炎性细胞因子分泌情况
用gp1-fc蛋白(实施例2中的步骤四获得)分别与步骤1获得的不同浓度的piceatannol、r406和dsmo预处理后的树突状细胞混匀(gp1-fc蛋白的终浓度是10μg/ml)，用gp1-fc蛋白刺激不同浓度的piceatannol、r406和dsmo预处理后的树突状细胞。其中，dsmo为对照，24h后，elisa检测人肿瘤坏死因子α和白介素6细胞因子分泌情况。
检测结果如图10(横坐标代表的是不同浓度的dmso，piceatannol和r406，图中黑三角从左向右依次代表浓度由低到高)所示，和dmso预处理后的树突状细胞相比，piceatannol预处理后的树突状细胞、r406预处理后的树突状细胞的人肿瘤坏死因子α和白介素6细胞因子的分泌量显著降低显著降低，说明syk激酶抑制剂piceatannol和r406具有埃博拉病毒样颗粒的gp1蛋白诱导的炎性细胞因子分泌的功能。