本发明涉及药物技术领域，特别涉及一种嘧啶衍生物在制备抑制细菌群体感应系统的药物中的应用。
背景技术：
抗生素的使用使人类许多严重的细菌感染性疾病得到有效控制，但抗生素的广泛使用也导致了耐药菌株的增加，降低了现有抗生素的抗菌效率。因此，开发新的抗生素和建立新的治疗模式是及其必要的。目前认为，最有前景的治疗策略应是不致死病原菌细胞而仅削弱病原菌的致病毒性，该策略不威胁病原菌自身的生存而不会引起耐药性问题。近来的研究发现，病原菌的致病性是由一种密度依赖的群体感应系统(qs)调控，群体感应系统通过介导致病基因的表达以实现其致病性。当致病菌密度达到一定程度时，致病菌自身合成、释放某种信号分子，能够启动相关基因的表达，调控致病菌的多种生物行为，诸如生物发光、产生毒素、形成生物膜、产生抗生素等等。
鉴于上述描述，亟待发现一种能够在不抑制致病菌生长的前提下，减弱致病菌毒性的物质被制备成药物，用于治疗细菌感染性疾病，避免耐药菌株的增加。
技术实现要素：
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种嘧啶衍生物在制备抑制细菌群体感应系统的药物中的应用。
为了实现如本发明的这些目的和其它优点，提供了一种嘧啶衍生物在制备抑制细菌群体感应系统的药物中的应用，其特征在于，所述嘧啶衍生物的化学名称为[(5r，7r)-7-(4-苯酰氧基)-5-(2-氯苯基)-4,5,6,7-四氢化-[1,2]三唑[1,5-a]嘧啶，结构式如下：
优选的是，嘧啶衍生物在制备抑制细菌群体感应信号分子的药物中的应用。
优选的是，嘧啶衍生物在制备降低细菌生物被膜形成的药物中的应用。
优选的是，嘧啶衍生物在制备降低细菌毒力因子致病性的药物中的应用。
优选的是，所述细菌毒力因子为弹性蛋白酶、溶血素或外毒素a。
优选的是，嘧啶衍生物在制备降低细菌群集运动能力的药物中的应用。
优选的是，所述细菌为铜绿假单胞菌。
优选的是，所述嘧啶衍生物的最低有效抑制浓度为47.4μm。
本发明中，嘧啶衍生物为有效成分可以直接使用，为了方便给药，可以加入药学上可接受的常规辅料，通过常规制药方法制成片剂、胶囊剂、注射剂、散剂、颗粒剂。
本发明至少包括以下有益效果：
本发明选取lasr蛋白作为靶蛋白，进行虚拟筛选得到了得分较高的嘧啶衍生物，并应用嘧啶衍生物对铜绿假单胞菌进行生物活性评价。实验证明嘧啶衍生物对lasr相关的三种基因lasr、lasb、lasi在菌种中均表现下调。说明本次筛选结果中得分较高的嘧啶衍生物与靶蛋白作用，对下游相关基因的表达产生了抑制作用。即嘧啶衍生物通过抑制群体感应信号分子，最终降低细菌的生物被膜的形成、有效抑制毒力因子的致病性和细菌的群体效应。计算机虚拟筛选作为高效、低成本的一种化合物筛选手段，将该技术应用于群体感应药物的研究具有可行性。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明所述的嘧啶衍生物对质控菌株及临床分离菌株(孔庆翔菌株)的毒力基因表达影响；
图2为本发明所述的嘧啶衍生物的加入对质控菌株及临床分离株的生物被膜影响；
图3为本发明所述的嘧啶衍生物的加入对质控菌株及临床分离株的弹性蛋白酶影响。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
嘧啶衍生物的性质如下表1所示：
实施例1
一种嘧啶衍生物在制备抑制细菌群体感应系统的药物中的应用。
嘧啶衍生物在制备抑制细菌群体感应信号分子的药物中的应用。
嘧啶衍生物在制备降低细菌群集运动能力的药物中的应用。
1.1材料
计算机，生物数据库(ncbi，pdb等软件):openbabel；mgltoolsautodockvina软件；discoverystudioviewer3.5等；lasr蛋白数据来自蛋白晶体数据库http://www.pdb.org/pdb/home/home.do(pdbid:2uvo)；供虚拟筛选的数据库为zinc数据库(https://zinc.docking.org/)
菌株：pa质控菌株(atcc27853)(开滦总医院微生物实验室保存)；pa临床分离株(使用细菌鉴定及药敏测定仪对临床分离菌株进行重新鉴定。选取开滦总医院某患者pa临床分离株分纯培养用于本研究)。
1.2培养基
lb液体培养基:蛋白胨1％，酵母粉0.5％，nacl1％，ph7.0。
swarming培养基:8.6mmnacl0.2492g，20mmnh4cl0.525g，22mmkh2po41.496g，12mmna2hpo4·7h2o2.149g，0.4％琼脂糖琼脂粉2.0g,11mm葡萄糖1.98g，0.5％酸水解干酪素2.5g，1mmmgso4·7h2o0.123g，1mmcacl20.0735g。
1.3试剂
zinc01130988(stk135354)购自vitas-mlaboratory
1.4方法
1.4.1群体感应活性物质的虚拟筛选
从蛋白晶体数据库http://www.pdb.org/pdb/home/home.do(pdbid:2uvo)中检索lasr蛋白数据，从zinc数据库(https://zinc.docking.org/)(截止到2015年5月，已收录的全部化合物超过3.5千万个)中，利用计算机分子对接技术通过autodockvina软件将每个处理好的zinc数据库中的化合物与lasr的活性中心进行对接，筛选与lasr蛋白具有高亲和力的化合物。选取购买得分较高的化合物进行活性检测。
1.4.2rt-qpcr检测嘧啶衍生物对qs调控相关基因(lasr、lasi、lasb)表达的影响
1.4.2.1pa质控菌株及临床分离菌株cdna准备
采用倍比稀释的方法确定嘧啶衍生物在400μm-6400μm浓度范围内不影响铜绿假单胞菌生长，分别配置400umμm的嘧啶衍生物的lb培养基，将400μm嘧啶衍生物放入0.5麦氏浊度的pa标准菌株及临床分离菌株的5mllb培养基中，并设置空白对照组，将复苏好的铜绿假单胞菌质控菌株和临床分离株分别调整至0.5麦氏比浊标准，经lb肉汤1:1000稀释后，吸取100ul至含有4种化合物的lb培养基中，同时吸取100ul至不含有4种化合物的lb培养基中，37度，220rpm培养至对数期。菌液收集并处理提取8种总rna并反转录成cdna。
1.4.2.2rt-pcr检测嘧啶衍生物对qs调控相关基因(lasr、lasi、lasb)表达
由生物公司设计引物(做溶解曲线，以验证引物的特异性)，参见下表1或核苷酸序列如seqidno.1-8所示，
扩增lasr、lasi、lasb目的基因(核苷酸序列如seqidno.9、seqidno.10和seqidno.11所示)，并将b-actin作为内参基因(核苷酸序列如seqidno.12所示)，将cdna进行适当稀释，进行梯度qpcr检测。操作体系：rnasefreedh209.5ul，cdna/dna1ul，上下游引物各1ul，2xgoldstartaqmastermix12.5ul。
反应程序，三步法：预变性95℃，3min；变性95℃，10s；退火55-60℃，30s；延伸72℃，30s，共40个循环；终延伸72℃，10min。
表2.引物序列
1.5rt-pcr检测嘧啶衍生物对qs调控相关基因表达的影响
嘧啶衍生物减少了pa质控菌株及临床分离株的lasr、lasi、lasb基因的表达，结果见图1a和图1b。
实施例2
嘧啶衍生物在制备降低细菌生物被膜形成的药物中的应用。
2.1铜绿假单胞菌生物被膜活性检测
分别挑取质控菌株和铜绿假单胞菌临床分离株于新鲜的lb液体培养基中，37℃，150rpm摇床过夜培养；用新鲜lb液体培养基将培养至对数期的菌液以1：100比例稀释，培养1h。将每种菌液分装5组，每组三个平行；向其中加入终浓度为0、300μm的300μm的嘧啶衍生物。分装入96孔板，每个孔150μl，于37℃静置下培养20h；使用移液器轻轻吸出菌液，注意不要是枪头碰到孔底与孔壁，使用pbs缓冲液轻轻洗涤96孔板2次，风干；每孔加入150μl的0.1％结晶紫溶液染色15min，再加入150μl的pbs缓冲液轻轻洗涤3次，风干；加入10μl33％的冰乙酸溶解，a595测定其吸收值。
2.2嘧啶衍生物对pa生物被膜的影响
嘧啶衍生物减少了pa菌株的生物被膜的产生，结果见图2a和图2b。
实施例3
嘧啶衍生物在制备降低细菌毒力因子致病性的药物中的应用；所述细菌毒力因子为弹
性蛋白酶、溶血素或外毒素a。
3嘧啶衍生物对铜绿假单胞菌毒力因子影响检测
3.1对铜绿假单胞菌弹性蛋白酶活性检测
分别挑取质控菌株和铜绿假单胞菌临床分离株于新鲜的lb液体培养基中，37℃，150rpm摇床过夜培养；用新鲜lb液体培养基将培养至对数期的菌液以1：100比例稀释后，将每种菌液分装5组，每组3个平行，向其中加入终浓度为0、400μm的嘧啶衍生物，37℃、150rpm摇床培养12h；吸取1ml菌体，4℃、12000rpm离心15min，小心吸取200μl上清液于2mleppendorf管中；加入800μl反应缓冲液以及3mg刚果红底物，30℃恒温振荡反应10h；加入11mm葡萄糖0.9911g，4℃、12000rpm离心15min，除去未反应的刚果红底物；吸取10μl上清液，酶标仪检测其在490nm处吸光度。
3.2嘧啶衍生物对pa弹性蛋白酶影响
嘧啶衍生物减少了pa菌株的弹性蛋白酶的产生，结果见图3a和图3b。
实施例4
采用与实施例1-3对应的实验方法，将嘧啶衍生物的浓度进行调整，检测在各个应用中的最低有效浓度，检测结果见下表3、4、5和6：
表3：c对lasb基因表达影响
表4：c对lasi基因表达影响
表5：c对lasr基因表达影响
表6：c对pa毒力因子表达影响
群体感应系统在多种细菌中普遍存在，系统间呈级联调控，铜绿假单胞菌的致病性和耐药性受到群体感应系统的影响。当细菌数量到一定程度，首先激发las系统的启动，3-oxo-c12-hsl与lasr结合形成复合物，进而引起诸如弹性蛋白酶、溶血素、外毒素a等多种毒力因子基因的表达，并对rhl系统pqs系统进行正向调节。鉴于lasr系统的重要性，本发明选取lasr蛋白作为靶蛋白，进行虚拟筛选得到了34种得分较高的化合物，购买嘧啶衍生物对铜绿假单胞菌进行生物活性评价。
本发明用实时荧光定量pcr这一分子研究中的重要工具，对铜绿假单胞菌质控菌株及临床分离株在分别加入两种目标化合物的前后进行lasr系统相关基因进行转录水平的活性比较，所加入的化合物浓度都在不影响细菌正常生长的浓度范围内进行。与空白相比，加入嘧啶衍生物对lasr相关的三种基因lasr、lasb、lasi在两株菌种均表现下调。说明本次筛选结果中得分较高的化合物，与靶蛋白作用，对下游相关基因的表达产生了抑制作用。计算机虚拟筛选作为高效、低成本的一种化合物筛选手段，可作为初筛为我们设计研发药物提供方便。
铜绿假单胞菌有超过10％的基因调节与其群体感应系统有关，这一系统能够调控铜绿假单胞菌毒力因子的产生而目前尚未发现对人体有任何影响。因此，通过对信号分子的化学修饰、天然产物中分离筛选、高通量筛选等多种途径研发群体感应活性药物可作为抗菌新策略应用于人体。计算机虚拟筛选具有低成本、高效的优点，将该技术应用于群体感应药物的研究具有可行性。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
<110>华北理工大学基础医学院
<120>c化合物在制备抑制细菌群体感应系统的抑制剂中的应用
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