本发明属于药物技术领域，具体地说，涉及2-(3,4-二氟苯亚甲基)氨基硫脲化合物(i)其药理活性和药学用途。该化合物可以用于预防和/或治疗各种因素引起的肿瘤或癌症等疾病。
背景技术：
肿瘤严重影响人们的身体健康是导致人类死亡的第二大病因。据世卫组织统计，全世界每年新确诊的肿瘤患者均在1000万以上，每年全球肿瘤死亡总数达700万人。2012年，中国新增307万癌症患者并造成约220万人死亡，分别占全球总量的21.9％和26.8％，癌症已经成为我国城乡居民死亡的首要原因。肿瘤不仅严重威胁着人民群众的身体健康，给病人和病人家庭带来经济损失，而且还会给国家和社会造成沉重的负担。寻找高效、低毒、可选择性杀伤或抑制肿瘤细胞的新作用机制的新型抗肿瘤药物已成为抗肿瘤药物研发的重要方向。
缩氨基硫脲类化合物具有广泛的生物活性，目前有多个化合物做为临床抗肿瘤药物使用或正在进行临床前研究，如2-formylpyridine、5-hp和3-ap等，在抗肿瘤医药领域有很好的应用前景。将氟原子或含氟基团引入到小分子药物中，是药物化学结构改造的重要研究策略。引入氟原子不仅可以改变小分子的药代动力学性质，提高药物的生物利用度，还可通过影响化合物的构象，增强配体与靶标蛋白的相互结合能力以及选择性，另外还可通过阻断易代谢位点进而提高药物代谢稳定性等。因此，氟代药物在药物中占有很大比重，起重要作用。
本发明涉及氟代氨基硫脲化合物(i)在药物领域中的应用，现有技术中没有本发明提供的氟代氨基硫脲化合物(i)及其作为有效成分的药物的报道，也没有该化合物物或其药物组合物应用在制备或治疗各种因素引起的肿瘤等疾病药物中的报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供2-(3,4-二氟苯亚甲基)氨基硫脲(i)药用用途，具体涉及在制备抗肿瘤药物中的应用；
本发明所采用的2-(3,4-二氟苯亚甲基)氨基硫脲(i)是本实验室化学合成所得，其化学机构式如下：
本发明将上述2-(3,4-二氟苯亚甲基)氨基硫脲(i)进行了抗肿瘤细胞增殖活性实验、诱导肿瘤细胞凋亡实验和影响肿瘤细胞周期实验，实验结果表明，所述的2-(3,4-二氟苯亚甲基)氨基硫脲(i)可显著抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡并能影响肿瘤细胞周期，具有显著抗肿瘤活性；
所述的2-(3,4-二氟苯亚甲基)氨基硫脲(i)可以作为药物有效成分，加以药学上可接受的载体，制备抗肿瘤药物组合物。尤其用于制备抗肿瘤有关疾病的药物。所述氟代氨基硫脲化合物、氟代氨基硫脲化合物的药物学上可接受的盐及氟代氨基硫脲化合物的化学等价物中的一种或二种以上可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。该药物组合物含有0.1–99％，优选为0.5–90％的所述氟代基硫脲化合物、氟代氨基硫脲化合物的药物学上可接受的盐及氟代氨基硫脲化合物的化学等价物中的一种或二种以上，其余为药物学上可接受的药用载体和/或赋形剂。
本发明具有如下优点：
本发明经抗肿瘤活性实验证明化合物可显著抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡并能影响肿瘤细胞周期，具有显著抗肿瘤活性。
附图说明
图1为化合物2-(3,4-二氟苯亚甲基)氨基硫脲(i)对a549抑制作用图。
图2为化合物2-(3,4-二氟苯亚甲基)氨基硫脲(i)对a549凋亡作用图。
图3化合物2-(3,4-二氟苯亚甲基)氨基硫脲(i)对a549凋亡作用形态学检测图。
图4为化合物2-(3,4-二氟苯亚甲基)氨基硫脲(i)对a549细胞周期的影响图。
具体实施方式
实施例12-(3,4-二氟苯亚甲基)氨基硫脲(i)对细胞增殖活性的研究
1.实验药品
称取1mmol3,4-二氟苯甲醛(3.07g)和1.1mmol氨基硫脲(2.16g)置于200ml反应瓶中，再加入20ml乙醇(95％)搅拌均匀后，滴加1ml冰醋酸，然后65-70℃回流搅拌约10小时，减压蒸除大部分乙醇后加入20毫升冰水，过滤得沉淀，冰水洗沉淀(20ml分三次)乙醇重结晶得2-(3,4-二氟苯亚甲基)氨基硫脲，白色固体。2-(3,4-二氟苯亚甲基)氨基硫脲采用dmso助溶，配置成50mg/ml储存液长期保存，实验用最大浓度为12.5，25，50μg/ml。
2.细胞株
人非小细胞肺癌细胞(a549)购自中国科学院上海细胞库。用含质量浓度10％肽牛血清的dmem培养基在37℃、体积分数为5％co2、完全饱和湿度条件下空气中常规培养，48h更换培养基，细胞生长达饱和状态时，用0.25％胰蛋白酶消化传代，2-3天传代1次，实验选用对数生长期细胞。
3.细胞活性检测
采用四甲基偶氮唑盐(mtt)法检测化合物2-(3,4-二氟苯亚甲基)氨基硫脲(i)对肺癌细胞a549细胞增值活性的影响。取对数期的肺癌细胞a549，胰酶消化重悬，调整细胞浓度为5×104/ml，以100μl/孔接种96孔板，贴壁生长24h后，吸弃培养基，加入不同浓度的2-(3,4-二氟苯亚甲基)氨基硫脲(i)(5,10,20μg/ml)。每个浓度设置三个复孔，并设定相应浓度的pbs溶媒对照及无细胞调零组。细胞在37℃、5％co2条件下培养48h，然后加入20μl，5mg/ml的mtt，于37℃、5％co2条件下孵育4h，吸弃上清，每孔加入150μldmso，震荡10分钟，酶标仪490nm波长下检测od值。并计算细胞抑制率和半数抑制浓度(ic50)。
结果显示：2-(3,4-二氟苯亚甲基)氨基硫脲(i)对a549细胞具有较强的增殖抑制作用，其ic50为22.74μg/ml。细胞增殖抑制活性见下图1。
实施例22-(3,4-二氟苯亚甲基)氨基硫脲(i)对a549凋亡的研究
1.实验细胞：
同实施例1
2.实验药物：
同实施例1
3.实验方法：
细胞凋亡检测采用annexinv/pi染色法。取对数期a549细胞，调整细胞浓度为5×105/ml，接种于六孔板，于37℃，5％co2培养箱中培养24h，加入不同浓度浓度的化合物2-(3,4-二氟苯亚甲基)氨基硫脲(i)(5,10,20μg/ml)，作用48h，同时设定空白组(pbs)。细胞用不含edta的胰酶消化，pbs洗涤三次，收集1～5×105细胞，加入500μl的bindingbuffer悬浮细胞成细胞悬液后加入5μlannexinv-fitc和5μlpropidiumiodide，混匀后室温避光反应15min，于流式细胞仪进行检测。
结果显示，化合物2-(3,4-二氟苯亚甲基)氨基硫脲(i)可诱导a549细胞发生凋亡，高浓度组凋亡比例可达51.8％，其促凋亡作用呈剂量依赖性，其抑制活性见下图2。
实施例32-(3,4-二氟苯亚甲基)氨基硫脲(i)对a549凋亡形态学研究
1.实验细胞：
同实施例1
2.实验药物：
同实施例1
3.实验方法：
对细胞凋亡的形态学检测采用hoechst染色法。取对数期a549细胞，调整细胞浓度为5×105/ml，接种于六孔板，于37℃，5％co2培养箱中培养24h后，加入不同浓度浓度的2-(3,4-二氟苯亚甲基)氨基硫脲(i)(5,10,20μg/ml)，作用48h，同时设定空白组(pbs)。细胞用pbs洗涤三次，4％多聚甲醛室温固定15min，pbs洗涤三次后加入hoechst33258染料避光染色15min后与荧光显微镜下进行观察。
结果显示，2-(3,4-二氟苯亚甲基)氨基硫脲(i)作用于a549细胞后，细胞出现明显的凋亡特征，如出现明显的固缩及小片段，其形态学观察见下图3。
实施例42-(3,4-二氟苯亚甲基)氨基硫脲(i)对a549细胞周期的研究
1.实验细胞：
同实施例1
2.实验药物：
同实施例1
3.实验方法：
对细胞周期的分析采用pi单染的方法。取对数期a549细胞，调整细胞浓度为5×105/ml，接种于六孔板，于37℃，5％co2培养箱中培养24h后，加入不同浓度浓度的2-(3,4-二氟苯亚甲基)氨基硫脲(i)(5,10,20μg/ml)，作用48h，同时设定空白组(pbs)。离心收集细胞，pbs洗涤两次，细胞用75％的冷乙醇重悬并置于-20℃过夜。细胞离心并用pbs洗涤两次，用pbs重悬细胞加入20μg/ml的rnasea于37℃孵育30min，然后细胞加入50μg/ml的pi室温避光孵育30min后于流式细胞仪进行检测。
结果显示，化合物2-(3,4-二氟苯亚甲基)氨基硫脲(i)可诱导a549细胞发生g1期周期阻滞，其对a549周期阻滞见下图4。
对比实施例2-(3,5-二氟苯亚甲基)氨基硫脲对肿瘤细胞a549增殖活性的研究
1.实验细胞：
同实施例1
2.实验药物：
合成方法同实施例1
3.实验方法：
同实施例1
实验结果显示化合物2-(3,5-二氟苯亚甲基)氨基硫脲对肿瘤细胞a549增殖抑制ic50值大于50μg/ml。