一种具有超长持续时间的超声造影剂及其制备方法与流程

本发明涉及医药领域，具体涉及一种具有超长持续时间的超声造影剂及其制备方法。

背景技术：

超声造影剂通常是脂质、聚合物或蛋白质包裹的直径在10微米以下的气体微泡，能够在超声成像中用来增强检测部位的回声信号。超声造影剂在人体微小血管和组织血流灌注检测与成像方面具有很大优势。另外，近些年的研究表明超声造影剂在肿瘤或炎症部位的靶向成像和药物递送等方面表现出了广阔的应用前景，因此可以预见超声造影剂在不久的将来将会成为临床上超声诊断或治疗中的不可或缺的试剂。

目前超声造影剂已经有很多产品进入临床应用，国际市场上如definity、optison、sonazoid、sonovue等，国内市场上现在有sonovue、雪瑞欣可以使用。尽管超声造影剂在超声诊断中有着诸多应用优势，但是目前国内临床诊断中超声造影剂却很少被普通民众所使用，一般只有在三甲以上的医院才会有较多的使用。这其中一个很重要的原因就是造影剂的价格非常昂贵，如每瓶sonovue的价格在700人民币左右，雪瑞欣的价格更是高达每瓶900多人民币，普通老百姓难以负担得起，极大地限制了超声造影剂的普及。另外目前已有的超声造影剂的成像时间都比较短(sonovue的有效时间为4-8分钟，雪瑞欣不足2分钟)，难以满足一个完整的超声检查的需求。尤其是随着介入超声等技术的发展，对具有长持续时间的造影剂的需求就更加迫切。

另外，随着超声分子影像和介入治疗的发展，亚微米的微泡(即含有一定比例的纳米泡的超声微泡)开始显现出巨大的应用潜力。纳米泡在高频超声下稳定性更好，具有更好的穿透血管的能力，而微米级微泡的超声造影增强效果更好，亚微米的微泡结合了两者的优势表现出更好的应用价值。例如研究发现definity由于含有一定比例的纳米泡具有更好的超声溶栓效果，而同等条件下的 白蛋白微泡由于均是微米级尺寸则没有这种效果。

技术实现要素：

基于以上需求和问题，本发明提供一种具有超长持续时间的超声造影剂的制备方法，该方法操作简单，微泡包膜材料可以在很温和的条件下分散得到均一稳定的溶液，可以进行过滤除菌，容易进行产业化生产。本发明所述超声造影剂为冻干制剂，为了制备冻干制剂，需要先制备超声微泡包膜材料的混悬液，混悬液中的成分是双亲性包膜材料、冻干保护剂和溶剂。

本发明技术方案如下：

一种具有超长持续时间的超声造影剂的制备方法，包括以下步骤：

1)制备微泡包膜材料混悬液，其中所述混悬液的溶剂为叔丁醇和水混合液；

2)冷冻干燥所述混悬液，制得微泡冻干粉；

3)将所述微泡冻干粉充入填充气体，所述填充气体为混合气体。

本发明所述包膜材料为双亲性包膜材料，其主要组分是带有负电荷的磷脂，疏水链的长度以18个碳为宜，适合的磷脂包括二硬脂酰基-磷脂酰甘油、二硬脂酰基-磷脂酰丝氨酸、二硬脂酰基-磷脂酸等中的一种。研究发现，由于这些磷脂在生理条件下净电荷为负，保证了微泡带有较强的负电荷，从而使得稳定性大大提高。且较长的疏水链能够保证能够形成稳定的膜结构以防止微泡内部气体的溢出。另外这些磷脂的亲水性头部中的磷酸、甘油、丝氨酸等结构能够通过氢键或静电相互作用形成稳定的亲水层，大大提高微泡的稳定性。

本发明所述双亲性包膜材料中除了前面提到的带有负电荷的磷脂外，也可以掺入一些其他的双亲性成膜材料，但是为了保证微泡的稳定性，前面提到的带有负电荷的磷脂(即二硬脂酰基-磷脂酰甘油、二硬脂酰基-磷脂酰丝氨酸以及二硬脂酰基-磷脂酸)的重量比例应该在70％以上，优选90％以上，更优选为100％。其他双亲性材料包括各种天然、半合成的的磷脂化合物，如卵磷脂、卵磷脂酰甘油、氢化大豆磷脂、氢化蛋黄磷脂、氢化磷脂酰丝氨酸，氢化磷脂酰甘油等。也包括各种合成磷脂如带有各种脂肪酸链的磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸等。也包括改性的磷脂，例如聚乙二醇化的磷脂。也包括各种合成的阳离子脂质，如羟乙基乙二胺基化的磷脂、乙 基磷脂酰胆碱的衍生物(如1,2-二硬脂酸-sn-甘油基-3-乙基胆碱磷酸)、带有烷基链的铵盐(如硬脂酰氯化铵、十二烷基溴化胺等)等。也包括各种表面活性剂，如司盘类、吐温类、聚乙二醇化的脂肪酸、单硬脂酸甘油酯、蔗糖单硬脂酸酯、氢化蓖麻油、棕榈酸抗坏血酸脂等。也包括类固醇类化合物(如胆固醇、羊毛固醇、谷甾醇、豆固醇、麦角固醇)及其衍生物、维生素e及其衍生物、脂肪酸(如硬脂酸、棕榈酸、花生酸、月桂酸、肉豆蔻酸、油酸等)。

研究发现，本发明所述双亲性包膜材料以单一一种磷脂为最佳，即选择二硬脂酰基-磷脂酰甘油、二硬脂酰基-磷脂酰丝氨酸以及二硬脂酰基-磷脂酸中的一种作为微泡包膜材料。一方面单一一种磷脂避免了由于多种磷脂混合不均导致的微泡均一性和可重复性差的问题。另一方面，采用单一一种磷脂有利于磷脂形成均一的微泡包膜结构，稳定性大大提高。

本发明制备微泡包膜材料混悬液的过程中还需加入冻干保护剂。

本发明优选采用的冻干保护剂是聚乙二醇，平均分子量应该在1000-10000之间为宜，优选的是平均分子量为4000左右的聚乙二醇。聚乙二醇的主要作用是在混悬液冷冻干燥时能够对支撑起成膜材料，使其保持在溶液中的稳定分散状态而不至于塌陷聚集，使得冻干粉在水化时能够很容易分散得到均一稳定的溶液。另外，聚乙二醇在水中能够与微泡膜表面的磷脂通过氢键作用大量附着，聚合物的附着可以极大地提高微泡的稳定性，也能够降低微泡在体内被识别的几率从而延长微泡的循环时间。

为了获得均一稳定的微泡包膜材料混悬液，需要一种溶剂能够将微泡包膜材料(和冻干保护剂)均匀混合分散。另外，为了获得微泡冻干粉，这种溶剂还需要具有合适的熔点和饱和蒸汽压。

水是冷冻干燥工艺中最常用的溶剂，但是双亲性材料在水中很容易自组装成胶束或脂质体等结构，直接将多种双亲性材料分散在水中很难实现分子水平上的均匀混合。

目前能够用于冷冻干燥的最优选的非水溶剂是叔丁醇，由于其具有较高的熔点(25.7℃)和饱和蒸汽压(26.8mmhg，20℃)，用普通的冷冻干燥设备实现冷冻干燥，极大的节约成本。另外，较低的毒性也使得叔丁醇较适合用于 药物制剂的冷冻干燥。尽管纯的叔丁醇可以溶解大多数双亲性材料和不同分子量的聚乙二醇，但是却无法溶解大多数的冻干保护剂。另外，微泡制备时通常需要加入一定比例的带有负电荷的磷脂如磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油或磷脂酸等，而这类磷脂在叔丁醇中的溶解度较差。

本发明中用来制备微泡包膜材料混悬液的溶剂是叔丁醇和水的混合液。优选地，所述叔丁醇和水混合液中叔丁醇的质量含量为1％～99％，进一步优选为30％～70％。

本发明中所采用的成膜材料主要是带有负电荷的磷脂，这类磷脂在水中难以分散，在氯仿、甲醇、正己烷、叔丁醇、乙醇等大多数有机溶剂中的溶解性都不好。而且除了要保证磷脂能够充分分散，还要保证混悬液能够在一般的冷冻干燥设备中被冻干。我们经过大量实验发现只有叔丁醇和水的混合液能够满足需求，带负电荷的磷脂在这种溶剂中能够被很容易地溶解，混悬液中的溶剂能够很容易地通过冷冻干燥除去，而且这种溶剂的生物毒性很低，痕量残留的溶剂毒性可以被忽略。

另外，本发明研究发现，以叔丁醇和水混合液为溶剂能够同时溶解绝大多数双亲性包膜材料和冻干保护剂，而且溶解过程不需要太高的温度，40℃左右甚至更低的温度就可以溶解，且溶解后冷却到室温后不会析出。最后获得的所述混悬液澄清、均一、稳定，并且很容易利用过滤进行除菌。另外，使用叔丁醇和水混合液为溶剂进行冷冻干燥时，叔丁醇能够在水中形成针状结晶，大大缩短冷冻干燥的周期。

本发明所述微泡包膜材料混悬液制备好后通常还需要进行过滤，比较优选的是用220nm的滤膜进行过滤。使用叔丁醇和水作为溶剂能够很容易将包膜材料溶解得到澄清透明的溶液，很容易进行过滤。过滤的目的一方面能够除去可能存在的微量杂质，另一方面能够起到对混悬液过滤除菌的目的。

本发明中微泡包膜材料混悬液制备好后(例如分装入药物制剂用的西林瓶)，通过冷冻干燥的方法除去溶剂(即叔丁醇和水混合液)得到微泡冻干粉，冻干粉能够稳定存在，常温条件下即可以保存很长时间。所述冷冻干燥可采用本领域常用方法。

本发明方法还包括将制备好的微泡冻干粉进行充入填充气体的步骤。例如冷冻干燥结束后向西林瓶中充入填充气体。填充气体是超声微泡内核的成分，为了提高超声微泡的稳定性，填充气体应该在水中具有较低的溶解度，还要对生物体安全无毒。常用的超声造影剂的填充气体是氟化碳类气体，但是我们的研究发现当使用氟化碳类气体如八氟丙烷作为填充气体时，最后制备的超声微泡的尺寸较大，较多的微泡尺寸在10微米以上，由于人体中肺部最细的血管的内径在10微米左右，这种微泡难以被安全用到生物体中。另一方面，在水中溶解度较高的气体，如空气、氮气等气体用作填充气体所制备的微泡尽管尺寸较小但是稳定性极差。

本发明中所使用的填充气体是混合气体，其含有两类气体：气体a和气体b。气体a的特点是分子量比较小(<100)，可以利用的气体包括空气、氧气、氮气、二氧化碳、氦气、氖气、氩气中的一种或几种的混合气。气体b的特点是分子量较大(>100)，并且含有氟元素，可以利用的气体包括八氟丙烷、十氟丁烷、八氟环丁烷、全氟戊烷、全氟己烷、全氟辛烷等氟化碳类气体以及六氟化硫等氟化硫类气体中的一种或几种的混合气。

本发明中填充气体(即混合气体)中气体a的体积比例为1％～99％，优选的比例为95％～99％。混合气体的使用，一方面能够保证微泡具有很好的稳定性，另一方面能够显著降低微泡的尺寸使得绝大多数的微泡尺寸都在7微米以下，并且有很多纳米泡。

本发明中气体填充过程可以是在冻干机外用特定的充气装置进行。工业化生产时更优选的方法是气体填充、密封的过程都是在冻干设备中进行。本发明中混悬液分装入西林瓶中后，在经过冻干、气体填充、密封、无菌处理后即可得到最终的超声造影剂(微泡冻干粉)成品。

本发明上述制备方法中，

步骤1)包括将所述包膜材料和冻干保护剂加入叔丁醇和水混合液中，加热溶解，制得微泡包膜材料混悬液；然后过滤除菌；

所述包膜材料和冻干保护剂的重量比例为1：200～1:5；优选为1:50～1:10。

所述包膜材料和冻干保护剂的总重量占所述溶剂(即叔丁醇和水混合液) 重量的1％～50％；优选为5％～20％；

所述叔丁醇和水混合液中叔丁醇的质量含量为1％～99％，优选为30％～70％。

所述加热溶解温度为25℃～70℃；优选为35℃～50℃。

所述过滤除菌优选采用220nm的滤膜。

具体地，本发明所述具有超长持续时间的超声造影剂的制备方法，包括以下步骤：

1)将所述包膜材料和冻干保护剂加入叔丁醇和水混合液中，加热溶解，制得微泡包膜材料混悬液；然后采用220nm的滤膜过滤除菌；

2)将步骤1)过滤除菌的微泡包膜材料混悬液冷冻干燥，得到微泡冻干粉；

3)将步骤2)制备好的微泡冻干粉充入混合填充气体；

上述制备方法中，

所述包膜材料为二硬脂酰基-磷脂酰甘油、二硬脂酰基-磷脂酰丝氨酸或二硬脂酰基-磷脂酸；

所述冻干保护剂为平均分子量4000的聚乙二醇；

所述包膜材料和冻干保护剂的重量比例为1:50～1:10；

所述包膜材料和冻干保护剂的总重量占所述溶剂重量的5％～20％；

所述加热溶解温度为35℃～50℃；

所述混合气体含有两类气体：气体a和气体b；其中气体a的分子量<100；气体b的分子量>100，并且含有氟元素；

所述气体a包括空气、氧气、氮气、二氧化碳、氦气、氖气、氩气中的一种或几种的混合气；

所述气体b包括氟化碳类气体、氟化硫类气体中的一种或几种的混合气；其中，氟化碳类气体包括八氟丙烷、十氟丁烷、八氟环丁烷、全氟戊烷、全氟己烷、全氟辛烷；氟化硫类气体包括六氟化硫。

本发明还包括上述方法制得的超声造影剂。

本发明所述超声造影剂(微泡冻干粉)在使用时需要向所述超声造影剂中注入水化液，经震荡制得超声造影剂悬浮液。

具体地，本发明所述超声造影剂(微泡冻干粉)在使用时需要向包装容器 (如西林瓶)中注入水化液，水化液的量优选占包装容器(如西林瓶)容积的10％～80％。水化液的选择应该是完全无毒、可以进行静脉注射的。纯水和大多数临床上使用的注射液都可以被用做水化液，如生理盐水，磷酸盐缓冲液，甘油注射液，葡萄糖注射液，氨基酸注射液等。也可以是加入了一定量的甘油和/或丙二醇的生理盐水或磷酸盐缓冲液，甘油的加入能够提高微泡的粘弹性和稳定性，丙二醇可以促进双亲性包膜材料的分散。

本发明所述超声造影剂(微泡冻干粉)水化后优选通过机械振荡器来激活微泡以获取可以用于超声成像造影的微泡混悬液。这里所采用机械振荡器与目前临床上牙科所用的银汞调和器的结构原理基本一致。优选地，震荡方式是往复式，震荡频率为2000～7000rpm，震荡幅度为0.5～3cm，震荡时间为30～180s。

本发明制备方法简单，微泡各组分之间能够在很温和的条件下分散得到均一稳定的溶液，达到分子水平的均匀混合，各组分在制备过程中不易发生降解，样品冻干效率高，样品均一稳定，可以进行过滤除菌，可重复性高、容易规模化生产，表现出广阔的临床应用前景。本发明解决了传统方法中因磷脂在高温条件下或水溶液中长期存在时容易发生降解产生溶血性磷脂，影响产品的稳定性和安全性的技术问题。本发明中优选的方法采用单一一种带负电的磷脂作为成膜材料，提高了产品的均一性和可重复性。产品高效安全、方法可重复性高。

本发明中造影剂体内(例如肝脏、肾脏和脾脏等脏器)造影持续时间达到了2-6小时以上，是目前已报道的微气泡类超声造影剂中超声造影持续时间最长的一类造影剂。打破了传统的对气体微泡超声造影剂稳定性差的认知。这种造影剂除了含有较多的微米级气泡之外，还含有很多纳米级的气泡。另外，这种造影剂的成分简单、价格低廉，主要原料均为fda已经批准的可注射药用辅料，制备工艺简单、可重复性高、易于进行规模化生产，预计工业化生产后每瓶生产成本仅为2人民币左右。良好的超声造影效果、低廉的价格使得这种超声造影剂具有良好的应用价值，预计将有助于超声造影剂的普及应用，具有很广阔的临床应用前景。

附图说明

图1为实施例1和对比例1制得的微泡包膜材料混悬液照片。

图2为实施例1制得的微泡悬液的微泡显微镜照片。

图3为对比例2得的微泡悬液的微泡显微镜照片。

图4为实施例1制得的微泡悬液的微泡的粒径分布图。

图5为实施例1制得的超声造影剂(微泡混悬液)对新西兰大白兔的肾脏和肝脏实质在不同时间点的造影效果图。a，微泡注射前；b，微泡注射后30秒；c微泡注射后30分钟；d，微泡注射后1小时；e，微泡注射后3小时；f，微泡注射后5小时。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。

实施例1

准确称取128mg二硬脂酰基-磷脂酰甘油，1872mgpeg4000，加入溶剂(即9g去离子水和9g叔丁醇的混合液)，加热到45℃溶解得到微泡包膜材料混悬液，为澄清的溶液(见图1)，然后冷却到室温。将溶解后的溶液用220nm的滤膜过滤后分装入2ml的西林瓶(实际容积约为3.5ml)，每瓶分装入250mg。将分装好的西林瓶放于冻干机隔板上，迅速冷却到-40℃，冷冻干燥过夜。冷冻干燥结束后，保持冻干机的真空状态，充填入氮气体积比例为98％的氮气和八氟丙烷混合气体，待真空度恢复到常压后，压下西林瓶上的橡胶塞，密封西林瓶，制得超声造影剂。

该超声造影剂(冻干粉制剂)使用之前，向西林瓶中注入1ml的生理盐水，放于医用银汞调和机的夹头上，振荡频率为4000rpm，振荡45s后得到微泡悬浮液。

实施例2

一种超声造影剂，其制备方法与实施例1的区别仅在于将二硬脂酰基-磷脂酰甘油成分更换为：128mg二硬脂酰基-磷脂酰丝氨酸。

实施例3

一种超声造影剂，其制备方法与实施例1的区别仅在于将二硬脂酰基-磷脂酰甘油成分更换为：128mg二硬脂酰基-磷脂酸。

实施例4

一种超声造影剂，其制备方法与实施例1的区别仅在于溶剂为12.6g去离子水和5.4g叔丁醇的混合液。

实施例5

一种超声造影剂，其制备方法与实施例1的区别仅在于溶剂为5.4g去离子水和12.6g叔丁醇的混合液。

实施例6

一种超声造影剂，其制备方法与实施例1的区别仅在于充填的混合气体为氮气体积含量为95％的全氟丙烷和氮气的混合气体。

实施例7

一种超声造影剂，其制备方法与实施例1的区别仅在于充填的混合气体为空气体积含量为98％的全氟丙烷和空气的混合气体。

实施例8

一种超声造影剂，其制备方法与实施例1的区别仅在于充填的混合气体为空气体积含量为98％的全氟丁烷和空气的混合气体。

实施例9

一种超声造影剂，其制备方法与实施例1的区别仅在于充填的混合气体为氮气体积含量为98％的全氟丁烷和氮气的混合气体。

实施例10

一种超声造影剂，其制备方法与实施例1的区别仅在于充填的混合气体为氧气体积含量为98％的全氟丙烷和氧气的混合气体。

对比例1

一种超声造影剂，其制备方法与实施例1的区别仅在于以水为溶剂制备微泡包膜材料混悬液。

制备过程中发现，在制备微泡包膜材料混悬液的时候，实施例1中只需在45℃加热溶解5分钟左右就可以得到澄清透明的混悬液，而对比例1中在45℃ 加热溶解30分钟后仍然可以看到很多颗粒状不溶物，而且混悬液浑浊不透明(图1)。在使用传统的220nmpvdf膜针头滤器(直径25mm)对混悬液进行过滤时，实施例1中混悬液在过滤100ml后没有遇到明显的阻力，而对比例1中的混悬液过滤时过滤的阻力非常明显，仅过滤了2ml后滤器就基本完全被堵塞无法继续进行了。

对比例2

一种超声造影剂，其制备方法与实施例2的区别仅在于充填的气体为全氟丙烷单一气体。

对比例3

一种超声造影剂，其制备方法与实施例2的区别仅在于充填的气体为空气单一气体。

对比例4

一种超声造影剂，其制备方法与实施例2的区别仅在于充填的气体为氮气单一气体。

实验例1

为获取微泡在光学显微镜下的图像；具体操作步骤如下：用等体积的生理盐水分别稀释实施例1和对比例2～4中制得的微泡悬液，用移液器吸取10μl微泡悬液滴在干净的载玻片上，小心盖上盖玻片，使用显微镜在不同物镜倍数下观察微泡的大小、形态及分散情况并拍照。图2是实施例1中得到的微泡的显微照片，可以看到微泡的尺寸大都在2μm以下，并且能够明显看到很多纳米泡。图3是对比例2中得到的微泡的显微照片，可以看到很多尺寸都位于10μm以上，较多的大尺寸微泡在体内使用的时候容易堵塞血管，安全性没有保证，无法被用于体内超声实验。而对比例3和对比例4中的微泡在显微镜可以看到微泡大多都是2μm以下，尺寸很小，但是这种微泡非常不稳定，常温放置约30分钟后就完全消失了。

实验例2

采用采用库尔特颗粒计数仪测试新型微泡的尺寸分布及浓度。操作步骤如下：取实施例1新制备的微泡悬液20μl加入到20ml生理盐水中中，轻微摇 晃混合均匀。设定分析体积为20μl，测试微泡的粒径分布及浓度。样品测试重复三次，取平均值。图4是其中一次代表性的结果，可以看到微泡的尺寸分布范围很窄，大部分都在2μm以下，与显微镜照片吻合。

实验例3

以新西兰大白兔为实验对象，于兔左耳经耳缘静脉建立外周静脉通道，在导管的末端连接三通管，其中一个通道用于注射超声造影剂，一个通道尾随生理盐水。新西兰大白兔用3％的戊巴比妥钠静脉注射麻醉(30mg/kg)，并辅以0.2％肝素钠抗凝血。待兔完全麻醉后，以背卧的姿势固定在兔床上。右腹部毛发用脱毛膏小心脱除，对兔肝脏和肾脏进行未注射造影剂的超声检查，记录基础状态下的图像。待图像满意后分别将实施例1以及对比例3和对比例4中的超声造影剂微泡混悬液按20μl/kg的剂量经兔耳缘静脉团注，即刻尾随2.0ml生理盐水冲洗管道，实时动态观察并记录兔肝脏和肾脏回声强度增强情况以及肾脏能量多普勒血流信号增强情况。

图5是实施例1中的微泡在兔肝脏和肾脏的造影结果，可以看到造影信号在肝脏和肾脏有显著的造影增强效果，并且能够持续很长时间，注射后5小时仍能看到较强的信号。在注射后7小时，尽管肾脏的信号已经基本完全消失，但在在肝脏部位仍然能够看到显著的增强信号。

而对比例3和对比例4中的造影剂在注射入动物体内后基本看不到造影增强的信号。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。