甘草次酸在抗埃博拉病毒药物中的应用的制作方法

本发明涉及药物化学领域，更具体地，涉及甘草次酸在抗埃博拉病毒药物中的应用。

背景技术：

埃博拉(ebolavirus)又译作伊波拉病毒。是一种十分罕见的病毒，1976年在苏丹南部和刚果(金)(旧称扎伊尔)的埃博拉河地区发现它的存在后，引起医学界的广泛关注和重视，"埃博拉"由此而得名。它是一种能引起人类和灵长类动物产生埃博拉出血热的烈性传染病病毒，可导致埃博拉出血热，致死率最高可达90％，2014年爆发的埃博拉疫情席卷了西非各地，感染及死亡人数都达到历史最高，引起了全世界的恐慌。埃博拉病毒被世界卫生组织定义为最高生物安全威胁的病毒，全球科学家迄今没有找到特别有效的应对措施。

埃博拉病毒(ebolavirus)属于丝状病毒科(filoviridae)丝状病毒属(filovirus)，为单股负链非节段rna病毒。埃博拉病毒基因组大小约19kb，其基因组能够编码7个结构蛋白，分别为核蛋白np、磷蛋白vp35、基质蛋白vp40、糖蛋白gp、复制-转录蛋白vp30、基质蛋白vp24和rna聚合酶l。其中核蛋白是所有负链非节段rna病毒中最大的核蛋白。病毒内部的核糖核蛋白病毒粒子是由被核蛋白(np)包裹的和vp35、vp30以及具有转录复制功能的核糖核苷酸聚合酶相连的rna基因组构成，对病毒基因的转录和复制具有重要作用。最近一些文章清楚的表明，病毒的np可以直接用作抗病毒的靶点，在传统的抗病毒药物中寻找新的药物机制以得到新的抗病毒药物。

埃博拉素有死亡病毒之称，截至目前，医学界尚未研制出针对该病毒的疫苗，而且没有针对埃博拉的固定疗法。我国研制出的"jk-05"是一种小分子化学药物，该药能够选择性地抑制埃博拉病毒的rna聚合酶，从而达到抑制病毒复制的目的。研究表明，该药在细胞和动物水平感染试验中具有抗埃博拉病毒活性。虽然该药物虽已完成临床前研究，但对于埃博拉出血热治疗，目前仍仅限于紧急情况下使用。埃博拉np作为一个全新的研究埃博拉病毒抑制剂的靶点，目前针对该靶点的抑制剂较少，且无成品上市药物。

天然产物又称次级代谢产物，具有结构的多样性和生物活性的多样性。天然产物及其衍生物在以往的疾病治疗中发挥了无可限量的作用，也是当今药物研发过程中最具潜力的资源之一。每年都会有大量结构新颖的天然产物作为药物先导化合物被发现，这些新颖化合物往往是化学合成方法所无法实现的，天然产物在新药和先导化合物的发现中起着重要作用。因为中药在我国已有数千年应用的历史，是一个宝贵的天然产物化合物库，因此，中药来源的天然产物中进行重要病毒或重要疾病相关靶蛋白抑制剂的筛选是很有必要的。

甘草次酸是一种从中药中提取的天然产物，具有多种药理活性，它具有盐糖皮质激素类作用，对多种急性炎症均有抑制作用，其抗炎作用不依赖于垂体一肾上腺皮质系统，而和抑制炎症组织中pge2生成、拮抗炎症介质组胺、5羟色胺等的作用有关，甘草次酸钠对机体非特异性细胞免疫功能也有增强作用，此外，还具有抗溃疡，镇咳去痰，抗肿瘤，抗利尿以及对氧自由基的清除作用。

2006年丁虹等在专利cn1846705a中公开甘草次酸可通过抑制炎症反应及抗氧化作用达到抗炎症性肠病的作用，用甘草酸制备的抗炎症性肠病的药物对炎症性肠病具有疗效好，安全范围大等优点，可以作为抗人炎症性肠病的药物。2014年张樟进等在专利cn103845338a中公开甘草次酸能够有效降低垂体瘤细胞内泌乳素的分泌和合成，并且能够有效降低高泌乳素血症动物血液中泌乳素的含量，充分证实了所述甘草次酸具有抗高泌乳素血症的作用。2014年张纬建等在专利cn103908458a中公开甘草次酸具有预防或者治疗放射性软组织损伤的作用，指出其可用于制备预防或治疗放射性软组织损伤的药物。2010年张鲁榕等在专利cn101919879a中公开甘草次酸可以通过抑制急性和慢性炎症反应，减少肺组织的胶原沉积，减少或延缓肺纤维化的发生，改善肺脏顺应性，进而改善肺功能。2006年王超云等在专利cn1762967a中公开一种甘草次酸衍生物对急慢性肝炎、细菌性肝炎、病毒性肝炎、脑缺血/再灌注损伤、脑外伤、心肌缺血/再灌注损伤均具有很好的治疗作用。2014年仇文卫等在专利cn103772477a中公开通过化学修饰得到的甘草次酸衍生物可作为潜在的抗肿瘤药物，具有良好的应用前景。

虽然多项研究已表明甘草次酸具有抗炎、抗高泌乳素血症、改善肺功能、抗感染、抗肿瘤等多种药理活性，但是尚未发现其在抗埃博拉病毒方面的应用。

技术实现要素：

本发明提供了甘草次酸在制备用于预防或者治疗埃博拉病毒的药物中的应用，其中甘草次酸的结构式如下：

其分子式为：c30h46o4，分子量为470.76，可以通过本领域已知的各种方法从植物中分离提取制备得到，也可以直接从商业购买获得。甘草次酸可直接作用于埃博拉核蛋白的rna结合位点，抑制该核蛋白与病毒rna作用从而阻遏病毒基因组复制与转录。本发明选取埃博拉病毒核蛋白np为靶标蛋白，采用荧光偏振技术作为活性评价方法，发现甘草次酸能够明显抑制埃博拉病毒核蛋白np的活性，测定其ic50值约为160um，可以用作制备预防或者治疗埃博拉病毒的药物分子前体。

本发明提供了甘草次酸在制备用于预防或者治疗埃博拉病毒的药物中的应用，其中甘草次酸的结构式如下：

在上述应用中，其中，甘草次酸直接作用于埃博拉核蛋白的rna结合位点，抑制核蛋白np与埃博拉病毒rna的作用，从而阻遏病毒基因组复制与转录。

本发明还提供了甘草次酸在制备埃博拉病毒的核蛋白np的抑制剂中的应用。

本发明还提供了一种用于预防或者治疗埃博拉病毒的药物组合物，包括作为活性成分的甘草次酸。

本发明选取埃博拉病毒核蛋白np作为靶点蛋白，采用竞争性实验的方法，以荧光偏振技术为检测手段，从天然产物中筛选得到埃博拉病毒核蛋白np的抑制剂甘草次酸，甘草次酸可直接作用于埃博拉核蛋白的rna结合位点，抑制该核蛋白与病毒rna结合从而阻遏病毒基因组复制与转录，从而提供了甘草次酸在制备用于预防或者治疗埃博拉病毒的药物中的应用。

附图说明

图1示出了荧光偏振技术检测合成的rna荧光探针对埃博拉病毒np的活性曲线。

图2示出了本发明的实施例的甘草次酸抑制埃博拉病毒np的ic50值的曲线图。

具体实施方式

下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

甘草次酸的结构式如下：

其分子式为：c30h46o4，分子量为470.76，可以通过本领域已知的各种方法从植物中分离提取制备得到，也可以直接从商业购买获得。

本发明利用荧光偏振技术来测定甘草次酸对埃博拉np的抑制活性。荧光偏振检测原理为当荧光素分子被平面偏振光激发时它就在固定的平面发射出与其分子量成正比的偏振荧光(polarizedfluorescence)，这种现象称为荧光偏振(fluorescencepolarization，fp)。如果荧光素与小分子结合时，相对分子质量较小，在溶液中自由旋转的速度较快，会向各个方向发出发射光，荧光偏振值较小。而当荧光素与蛋白结合时相对分子质量变大，旋转速度就会减慢，于是在特定时间内向同一方向发出发射光，荧光偏振值较大。偏振值用p表示。p值由以下公式得出：p＝(i平行－i垂直)/(i平行+i垂直)。其中，i平行为平行的激发光强度值，i垂直为垂直的激发光强度值。一般计算结果时用差向异性值a表示，a＝(i平行－i垂直)/(i平行+2i垂直)＝2p/(3-p)。

甘草次酸ic50值的测定方法：埃博拉np具有rna结合位点，对rna有很强的亲和能力，据此，合成一段具有18个碱基的rna(5’-cggacacacaaaaagaaa-3’)，它的5’端用羧基荧光素进行标记，标记后的rna成为rna荧光探针，并以此为基础建立荧光偏振检测rna-埃博拉np结合模型。前期推测甘草次酸同样结合于rna结合位点，它能够与rna竞争性抑制埃博拉np的活性，所以本实施例采用竞争性实验的方法，首先固定蛋白浓度，将不同浓度的待测药物甘草次酸与蛋白进行孵育，反应完全后，将rna荧光探针加入到不同浓度的孵育样品中，探针分子可与甘草次酸竞争rna活性位点，随着甘草次酸浓度的增加，rna探针分子与蛋白结合越少，检测到的荧光偏振响应值越低。此荧光偏振值可以反映出甘草次酸与rna探针竞争性结合蛋白的强弱，用graphpadprism5.0软件分析，作出荧光偏振值与待测物浓度取log后的曲线，计算出ic50值。

rna-埃博拉np结合模型建立

纯化的寡聚状态的埃博拉np(36-450)是与rna结合的，为了得到未结合rna的寡聚埃博拉np(36-450)，采用高低盐转换的方法，即：在高盐状态下(1.5mnacl，20mmtris-hcl，5mmddt，ph8.5)纯化蛋白，此时纯化出的蛋白是不结合rna的单体状态，然后将高盐条件下单体状态蛋白转换到低盐(200mmnacl，20mmtris-hcl，5mmddt，ph8.5)条件下，此时可以得到未结合rna的寡聚埃博拉np。对于纯化出的蛋白是否含有rna用a260/a280的比值来判定，当a260/a280小于0.65时，表明该蛋白不含rna。用fp缓冲液(10mmmgcl2，20mmtrisclph8.5，200mmnacl和5mmddt)依次稀释蛋白浓度为50nm，100nm，250nm，500nm，1um，2um，5um，8um，10um，20um，40um，50um共12个浓度点，rna荧光探针用1mmtrishclph8.5缓冲液配制成4um的储液，用荧光偏振进行检测时，96孔黑色荧光板每个孔加入90ul蛋白溶液，5ulfp缓冲液和5ul探针储液，测量并记录结果。以蛋白浓度为横坐标，归一化后的荧光偏振值为纵坐标，用graphpadprism5.0作图，得附图1。从附图1所得到的曲线可以看出，所合成的rna荧光探针与寡聚埃博拉np能够发生特异性结合，且结合较强，rna-埃博拉np结合模型的成功建立为下一步采用竞争性实验的方法来测定甘草次酸ic50值，确定蛋白和探针浓度提供了依据。

甘草次酸的ic50值的测定

该步骤需要选择一个适宜的蛋白浓度，选择的依据是建立的rna-埃博拉np结合模型，因为探针与埃博拉np结合比待测物甘草次酸强，故选择的蛋白浓度尽量接近图1的曲线的平台区的浓度，用fp缓冲液稀释蛋白浓度为10um，探针储液浓度为4um，待测物浓度依次按蛋白：甘草次酸的摩尔浓度比＝1:1；1:2；1:5；1:8；1:10；1:20；1:50；1:60；1:100确定，分别在同样浓度的蛋白中加入不同浓度的甘草次酸，混合均匀后，在16度下孵育12h。用荧光偏振进行检测时，96孔黑色荧光板每个孔加入90ul样品溶液，5ulfp缓冲液和5ul探针储液，测量并记录结果。以待测物甘草次酸浓度取log值为横坐标，归一化后的荧光偏振值为纵坐标，用graphpadprism5.0软件进行非线性分析，通过拟合出的曲线可以计算出甘草次酸的ic50值约为160um。

本发明选取埃博拉病毒核蛋白np作为靶点蛋白，采用竞争性实验的方法，以荧光偏振技术为检测手段，从天然产物中筛选得到埃博拉病毒核蛋白np的抑制剂甘草次酸，甘草次酸可直接作用于埃博拉核蛋白的rna结合位点，抑制该核蛋白与病毒rna结合从而阻遏病毒基因组复制与转录，从而提供了甘草次酸在制备用于预防或者治疗埃博拉病毒的药物中的应用。

本领域技术人员应理解，以上实施例仅是示例性实施例，在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以进行多种变化、替换以及改变。