4-[9-(6-氨基嘌呤基)]-2(S)-羟基丁酸甲酯在制备治疗银屑病及白癜风药物中的应用的制作方法

本发明涉及4-[9-(6-氨基嘌呤基)]-2(s)-羟基丁酸甲酯的新用途，本发明具体为4-[9-(6-氨基嘌呤基)]-2(s)-羟基丁酸甲酯在制备治疗银屑病及白癜风药物中的用途。

背景技术：

银屑病是一种常见的慢性复发性炎症性皮肤病，典型临床表现为边界清楚的红斑、皮疹、斑块、鳞屑，该病发病机制复杂，病因未明。目前银屑病治疗多以局部治疗为主，类固醇类激素如丁酸氢化可的松、糠酸莫米松等在治疗银屑病中应用广泛，但长期使用副作用大，影响其广泛应用；他克莫司、卡波三醇等由于其昂贵的价格也限制了其在临床上得应用。

白癜风是一种常见多发的色素性皮肤病，发病率为0.1％～2％。该病以局部或泛发性色素脱失形成白斑为特征，是一种获得性局限性或泛发性皮肤色素脱失症。其病因复杂，可能与遗传、自身免疫、神经等因素有关，白癜风的发病与细胞免疫、体液免疫及相关细胞因子有关。有大量实验证明，白癜风患者常伴随着免疫抗体和补体水平的异常，提示机体免疫功能的失衡在白癜风的发病中有着十分重要的作用。

s-腺苷同型半胱氨酸水解酶(s-adenosyl-l-homocysteinehydrolase,sahh)是一种细胞内广泛存在的酶，它催化水解s-腺苷同型半胱氨酸(s-adenosyl-l-homocysteine，adohcy)生成腺苷和同型半胱氨酸(hcy)。抑制sahh将导致细胞内adohcy的蓄积，从而对转甲基化反应产生反馈性抑制作用。根据对酶的抑制机制不同，sahh抑制剂分为三型。ⅰ型、ⅱ型sahh抑制剂对酶活性抑制是不可逆的，由于sahh在体内广泛存在，不可逆的抑制此酶会产生毒副作用。这些不可逆型sahh抑制剂的毒性作用限制了他们作为免疫抑制药物的进一步研发。ⅲ型sahh酶抑制剂对酶的抑制作用是可逆的，随着药物的活性作用减退，酶的活性可以恢复，因此其毒性作用较小。4-[9-(6-氨基嘌呤 基)]-2(s)-羟基丁酸甲酯就是一个ⅲ型sahh抑制剂，其细胞毒性低，4-[9-(6-氨基嘌呤基)]-2(s)-羟基丁酸甲酯在治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimentalautoimmuneencephalomyelitis，eae)、系统性红斑狼疮(systemiclupuserythematosus，sle)等疾病动物模型上表现出良好的治疗作用。4-[9-(6-氨基嘌呤基)]-2(s)-羟基丁酸甲酯具有如下的结构式：

目前尚未有4-[9-(6-氨基嘌呤基)]-2(s)-羟基丁酸甲酯治疗银屑病及白癜风等皮肤疾病的应用和报道，本方法首次发现4-[9-(6-氨基嘌呤基)]-2(s)-羟基丁酸甲酯对银屑病及白癜风的治疗作用。

技术实现要素：

为解决上述问题，本发明提供了4-[9-(6-氨基嘌呤基)]-2(s)-羟基丁酸甲酯在制备治疗银屑病和/或白癜风的药物中的用途。另外，本发明发现通过局部给药的方式，可以提高4-[9-(6-氨基嘌呤基)]-2(s)-羟基丁酸甲酯治疗银屑病及白癜风的疗效和便捷性，降低不良反应。

所述的制备治疗银屑病和/或白癜风的药物可以为含有4-[9-(6-氨基嘌呤基)]-2(s)-羟基丁酸甲酯的软膏剂、明胶剂或口服制剂等。

本发明所述的4-[9-(6-氨基嘌呤基)]-2(s)-羟基丁酸甲酯对小鼠类银屑病模型及白癜风发生、发展的抑制作用在本发明首次公开。

附图说明

图1.4-[9-(6-氨基嘌呤基)]-2(s)-羟基丁酸甲酯治疗缓解银屑病小鼠皮损伤。采用4-[9-(6-氨基嘌呤基)]-2(s)-羟基丁酸甲酯外用治疗咪喹莫特诱导balb/c小鼠银屑病，每天涂药并根据银屑病皮损面积和严重程度指数(pasi)进行评分。图中组别分别为正常对照组，模型对照组，卡泊三醇乳膏对照组，软膏治疗组，每组10只小鼠。***p<0.001，n＝10。图1a、1b、1c和1d依次为红 斑评分、鳞屑评分、皮肤增厚评分和总评分的柱状图。

图2.4-[9-(6-氨基嘌呤基)]-2(s)-羟基丁酸甲酯抑制咪喹莫特诱导小鼠脾脏肿大及脾脏中t淋巴细胞活化。在咪喹莫特诱导银屑病造模开始第7天对实验小鼠进行称重(图2a)及安乐死，对小鼠脾脏进行称重，计算脾脏指数(图2b)；检测初始t(t，cd3⁺cd4⁺cd44^-cd62l⁺)细胞比例(图2c，图2d)；及活化t(activet，cd3⁺cd4⁺cd44⁺cd62l^-)细胞比例(图2c，图2e)。*p<0.05,***p<0.001，n≥5。图中组别分别为正常对照组，模型对照组，软膏治疗组。图2c为cd3⁺cd4⁺t细胞，图2d和图2e中细胞比例为所占全脾脏淋巴细胞细胞中cd3⁺cd4⁺t细胞的比例。

图3.4-[9-(6-氨基嘌呤基)]-2(s)-羟基丁酸甲酯抑制咪喹莫特诱导小鼠皮损组织中il-17的水平。咪喹莫特诱导银屑病造模开始第7天，取病变部位皮肤，elisa法检测其il-17含量。*p<0.05,n≥5。图中组别分别为正常对照组，模型对照组为，软膏治疗组。

图4.4-[9-(6-氨基嘌呤基)]-2(s)-羟基丁酸甲酯软膏制剂治疗缓解银屑病小鼠皮损伤。4-[9-(6-氨基嘌呤基)]-2(s)-羟基丁酸甲酯软膏制剂治疗咪喹莫特诱导银屑病小鼠第7天，正常对照组，模型对照组，卡泊三醇软膏治疗组，软膏治疗组小鼠皮肤损伤典型代表图。

图5.4-[9-(6-氨基嘌呤基)]-2(s)-羟基丁酸甲酯口服制剂治疗缓解银屑病小鼠皮损伤的照片。4-[9-(6-氨基嘌呤基)]-2(s)-羟基丁酸甲酯口服制剂治疗咪喹莫特诱导银屑病小鼠第7天，正常对照组，模型对照组，口服治疗组小鼠皮肤损伤典型代表图。

图6.4-[9-(6-氨基嘌呤基)]-2(s)-羟基丁酸甲酯明胶治疗缓解银屑病小鼠皮损伤的照片。4-[9-(6-氨基嘌呤基)]-2(s)-羟基丁酸甲酯明胶制剂治疗咪喹莫特诱导银屑病小鼠第6天，模型对照组，明胶治疗组小鼠皮肤损伤典型代表图。

图7.4-[9-(6-氨基嘌呤基)]-2(s)-羟基丁酸甲酯软膏制剂治疗缓解白癜风病例皮损伤的照片。

具体实施方式

下面通过具体实施方案进一步说明本发明。所述实施例仅用于说明或解释本发明的实施方案，而不能限制被发明的保护范围。

实施例1.4-[9-(6-氨基嘌呤基)]-2(s)-羟基丁酸甲酯软膏基质的制备

1)液体石蜡15份，凡士林50份，单硬脂酸甘油酯50份，单硬脂酸100份，混合加热至70℃，得到油相a；

2)甘油100份，三乙醇胺2份，十二烷基硫酸钠2份，尼泊金乙酯1份溶于450份纯化水中，加热至70℃，得水相b；

3)将油相a缓缓加入水相b中，不断搅拌，制成软膏基质，静置，冷却。

实施例2.4-[9-(6-氨基嘌呤基)]-2(s)-羟基丁酸甲酯软膏的制备

1)液体石蜡15份，凡士林50份，单硬脂酸甘油酯50份，单硬脂酸100份，混合加热至70℃，得到油相a；

2)甘油100份，三乙醇胺2份，十二烷基硫酸钠2份，尼泊金乙酯1份溶于450份纯化水中，加热至70℃，加入15份4-[9-(6-氨基嘌呤基)]-2(s)-羟基丁酸甲酯，得水相b；迅速搅拌溶解；将油相a缓缓加入水相b中，不断搅拌，制成4-[9-(6-氨基嘌呤基)]-2(s)-羟基丁酸甲酯软膏，静置，冷却。

所述软膏的规格可以根据实际需要进行选择，通常采用的是单位制剂，20g，30g，40g等规格。4-[9-(6-氨基嘌呤基)]-2(s)-羟基丁酸甲酯软膏制剂浓度为0.125％-8％(wt)。

实施例3.4-[9-(6-氨基嘌呤基)]-2(s)-羟基丁酸甲酯软膏对银屑病样动物模型的治疗作用

试验材料：实施例1制得的软膏基质；实施例2制得的4-[9-(6-氨基嘌呤基)]-2(s)-羟基丁酸甲酯软膏，所用的4-[9-(6-氨基嘌呤基)]-2(s)-羟基丁酸甲酯软膏为每10g软膏制剂中含4-[9-(6-氨基嘌呤基)]-2(s)-羟基丁酸甲酯0.2g。

造模药物：咪喹莫特软膏，由四川明欣利迪药业有限责任公司生产，国药准字h20030128，产品批号15060139。

阳性对照药：卡泊三醇软膏，由重庆华邦制药有限公司生产，国药准字： h20113541，产品批号2015002。

实验动物：balb/c小鼠，雌性，体重18-22g，由上海斯莱克实验动物有限公司提供。

实验方法：

银屑病样模型造模：正常对照组，模型对照组，卡泊三醇软膏对照组，软膏治疗组，每组10只动物。小鼠剔除背部毛发后，模型对照组，阳性药对照组和软膏治疗组小鼠背部皮肤每日分别涂抹62.5mg咪喹莫特软膏。涂抹时间约每日7:30，连续进行7天或15天。

治疗方法：正常对照组、模型对照组小鼠背部皮肤每日涂抹实施例1制得的软膏基质62.5mg，卡泊三醇对照组小鼠背部皮肤每日涂抹卡泊三醇软膏62.5mg，软膏治疗组小鼠背部皮肤每日涂抹实施例2制得的4-[9-(6-氨基嘌呤基)]-2(s)-羟基丁酸甲酯软膏62.5mg。涂抹时间约为每日18:30。连续进行7天或15天，15天内观察各组小鼠每天的皮损变化情况，依据pasi评分标准对小鼠背部皮肤相应红斑(图1a)、鳞屑(图1b)及浸润增厚程度(图1c)进行0-4分的评分，将三者评分相加得到总的皮损严重程度总评分(图1d)。结果表明，4-[9-(6-氨基嘌呤基)]-2(s)-羟基丁酸甲酯能够有效的缓解咪喹莫特诱导的小鼠银屑病样皮损。

治疗7天后，银屑病样皮损处于较为严重的水平，称量小鼠体重；处死小鼠，手术分别切取各组小鼠脾脏并称重。实验结果见图2a和图2b。结果显示，4-[9-(6-氨基嘌呤基)]-2(s)-羟基丁酸甲酯干预治疗能够显著改善咪喹莫特诱导的鳞屑病样小鼠脾脏肿大情况。流式细胞术检测脾脏淋巴细胞中初始t(t，cd3⁺cd4⁺cd44^-cd62l⁺)细胞比例(图2c，图2d)；及活化t(activet，cd3⁺cd4⁺cd44⁺cd62l^-)细胞比例(图2c，图2e)。结果表明，4-[9-(6-氨基嘌呤基)]-2(s)-羟基丁酸甲酯能够抑制咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠t淋巴细胞活化。称取各组小鼠受损皮肤，按照1:20(w/v)(g:ml)将组织样品与t-per抽提试剂(t-pertissueproteinextractionreagent)混合，匀浆组织样品，然后离心去除沉淀组织，elisa方法检测抽提液中炎症性因子白细胞介素-17(il-17)的水平(图3)，结果表明，4-[9-(6-氨基嘌呤基)]-2(s)-羟基丁酸甲酯能够显著抑制受损皮肤中炎症性细胞因子il-17的水平。

于治疗第7天对各组小鼠进行拍照，观察[9-(6-氨基嘌呤基)]-2(s)-羟基丁酸甲酯软膏制剂对银屑病样动物模型的治疗作用。

结果表明：4-[9-(6-氨基嘌呤基)]-2(s)-羟基丁酸甲酯软膏制剂能够有效的缓解咪喹莫特诱导的小鼠银屑病样皮损(图4)。

实施例4.4-[9-(6-氨基嘌呤基)]-2(s)-羟基丁酸甲酯口服制剂对银屑病样动物模型的治疗作用

试验材料：按每5mg的[9-(6-氨基嘌呤基)]-2(s)-羟基丁酸甲酯溶解于1ml的纯化水的比例配得[9-(6-氨基嘌呤基)]-2(s)-羟基丁酸甲酯5mg/ml(w/v)口服制剂。

造模药物：咪喹莫特软膏，由四川明欣利迪药业有限责任公司生产，国药准字h20030128，产品批号15060139。

实验动物：balb/c小鼠，雌性，体重18-22g，由上海斯莱克实验动物有限公司提供。

实验方法：

银屑病样模型造模：正常对照组，模型对照组，口服治疗组，每组10只动物。小鼠剔除背部毛发后，模型对照组，阳性药对照组和卡泊三醇软膏治疗组小鼠背部皮肤每日分别涂抹62.5mg咪喹莫特软膏。涂抹时间约每日7:30，连续进行7天。

治疗方法：空白对照组、模型对照组小鼠分别每日给予口服纯水0.2ml，口服治疗组小鼠每日给予[9-(6-氨基嘌呤基)]-2(s)-羟基丁酸甲酯5mg/ml(w/v)0.2ml。连续进行7天。于治疗第7天对各组小鼠进行拍照，观察[9-(6-氨基嘌呤基)]-2(s)-羟基丁酸甲酯口服制剂对银屑病样动物模型的治疗作用。

结果表明：4-[9-(6-氨基嘌呤基)]-2(s)-羟基丁酸甲酯口服制剂能够有效的缓解咪喹莫特诱导的小鼠银屑病样皮损(图5)。

实施例5.4-[9-(6-氨基嘌呤基)]-2(s)-羟基丁酸甲酯明胶对银屑病样动物模型的治疗作用

试验材料：

4-[9-(6-氨基嘌呤基)]-2(s)-羟基丁酸甲酯明胶2％明胶制备：将2份4-[9-(6-氨基嘌呤基)]-2(s)-羟基丁酸甲酯溶解于96份纯化水中，得溶液a；将三份羧甲基纤维素钠、一份甘油加入到溶液a中，搅拌制得4-[9-(6-氨基嘌呤基)]-2(s)-羟基丁酸甲酯2％明胶。

明胶基质制备：将三份羧甲基纤维素钠、一份甘油加入到96份纯化水中中，搅拌制得明胶基质。

造模药物：咪喹莫特软膏，由四川明欣利迪药业有限责任公司生产，国药准字h20030128，产品批号15060139。

实验动物：balb/c小鼠，雌性，体重18-22g，由上海斯莱克实验动物有限公司提供。

实验方法：

银屑病样模型造模：模型对照组，明胶治疗组，每组10只动物。小鼠剔除背部毛发后，模型对照组，明胶治疗组小鼠背部皮肤每日分别涂抹62.5mg咪喹莫特软膏。涂抹时间约每日7:30，连续进行6天。

治疗方法：模型对照组小鼠背部皮肤每日涂抹明胶基质62.5mg，明胶治疗组小鼠背部皮肤每日涂抹4-[9-(6-氨基嘌呤基)]-2(s)-羟基丁酸甲酯明胶62.5mg。涂抹时间约为每日18:30。连续进行6天。

于治疗第6天对各组小鼠进行拍照，观察[9-(6-氨基嘌呤基)]-2(s)-羟基丁酸甲酯明胶对银屑病样动物模型的治疗作用。

结果表明：4-[9-(6-氨基嘌呤基)]-2(s)-羟基丁酸甲酯明胶制剂能够有效的缓解咪喹莫特诱导的小鼠银屑病样皮损(图6)。

实施例6.4-[9-(6-氨基嘌呤基)]-2(s)-羟基丁酸甲酯软膏对白癜风患者的治疗作用

陈某，女，54岁，患者发病4年时间，分部在面部，综合面积约4cm²，诊断为白癜风。涂膜实施例2制得的4-[9-(6-氨基嘌呤基)]-2(s)-羟基丁酸甲酯软膏，每天早晚各涂抹一次，涂膜面积覆盖患处，治疗11天后，患部皮肤开始变成粉红色，病情得到控制，病损逐渐转变成色素沉着点，如图7所示。