4‑羟乙基哌嗪乙磺酸在黄嘌呤氧化酶抑制肽中的应用的制作方法

本发明涉及4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)的新用途，具体涉及4-羟乙基哌嗪乙磺酸在增强黄嘌呤氧化酶抑制肽活性中的应用。

背景技术：

尿酸(uricacid)是人体内嘌呤类物质代谢的产物，正常人体血液中尿酸的含量为200～410μmol/l，一旦尿酸形成过量和/或排泄减少都会引起血尿酸水平的上升，从而引起尿酸盐在软组织中的沉积，进而诱发高尿酸血症。

近年来，随着社会的发展，人们生活和饮食方式发生改变，紧张的生活节奏和不良的饮食习惯，导致患有高尿血酸症的人群越来越多，已经成为继高血压、高血糖、高血脂后严重危害到人类健康的“第四高”。流行病学研究表明，高尿血酸症是引发痛风等慢性疾病的重要因素。

目前治疗高尿酸血症主要是通过抑制尿酸的生成和促进尿酸的排泄两个途径来实现，代表的药物分别有：别嘌呤醇和苯溴马隆。然而现有药物普遍对高尿酸血症不能根治，且长期服用有严重的毒副作用。

近二十年来随着对多肽消化吸收机制的研究，发现多肽并不完全是以氨基酸形式进入体内，有一部分多肽是以二肽甚至是更长的肽链通过细胞旁路运输、胞吞胞吐等形式进入人体，且在人体内有重要的生物活性功能。由于生物活性肽是构成机体天然的生物分子，因而几乎没有毒副作用，越来越多的生物活性肽被开发利用，尤其以抗氧化肽和ace(血管紧张素转换酶)抑制肽为主。

目前，降尿酸肽的研究，主要以筛选具有黄嘌呤氧化酶抑制活性的肽链为主。已有研究表明一些多肽，如两端含有丝氨酸的肽链具有良好的黄嘌呤氧化酶抑制活性，并能够显著的降低高尿酸血症大鼠的尿酸水平。

由于生物大分子通常具有复杂的空间结构，不同的环境中具有不同的构象，而多肽的生物活性与其空间构象密切相关。在多肽活性测定过程中常需要选用合适的缓冲试剂，目前所选用的缓冲试剂多直接借用其它类黄嘌呤氧化酶抑制剂筛选过程中的缓冲试剂。

4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)的结构式为：

4-羟乙基哌嗪乙磺酸是动物源和人源细胞培养中的缓冲液常用组分。研究已经证实，hepes在所有已知的缓冲液中具有最小的细胞毒性。fda(美国食品和药物管理局)已经批准基于哌嗪的两性离子分子可作为食品添加剂。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供4-羟乙基哌嗪乙磺酸在增强黄嘌呤氧化酶抑制肽活性中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

4-羟乙基哌嗪乙磺酸在增强黄嘌呤氧化酶抑制肽活性中的应用。

本专利研究发现，4-羟乙基哌嗪乙磺酸具有显著增强多肽类黄嘌呤氧化酶抑制剂活性的作用，与现有常用于黄嘌呤氧化酶抑制活性筛选的缓冲体系(tris-hcl和磷酸盐缓冲液(pb))相比，黄嘌呤抑制肽在含有4-羟乙基哌嗪乙磺酸的缓冲体系中的具有最佳的黄嘌呤氧化酶抑制作用。

优选地，hepes作为添加剂加入到具有黄嘌呤氧化酶抑制功能的多肽中。

所述具有黄嘌呤氧化酶抑制功能的多肽，包括以食源性蛋白经过发酵或蛋白酶酶解获得的肽类。

所述具有黄嘌呤氧化酶抑制功能的多肽优选金枪鱼肽、秋刀鱼肽或核桃粕蛋白肽；

所述的金枪鱼肽、秋刀鱼肽和核桃粕蛋白肽以现有技术的方法制得；

所述具有黄嘌呤氧化酶抑制功能的多肽，其制剂包括固体药物对应的填充剂以及液体药物对应的稀释液。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

4-羟乙基哌嗪乙磺酸具有显著增强多肽类黄嘌呤氧化酶抑制剂活性的作用，与现有常用于黄嘌呤氧化酶抑制活性筛选的缓冲体系(tris-hcl和磷酸盐缓冲液(pb))相比，黄嘌呤抑制肽(包括金枪鱼肽，秋刀鱼肽以及核桃粕蛋白肽等蛋白肽)在含有4-羟乙基哌嗪乙磺酸的缓冲体系中的构象具有提高黄嘌呤氧化酶抑制率作用。

附图说明

图1为三种缓冲体系对黄嘌呤氧化酶催化黄嘌呤生成尿酸的影响。

图2为三种缓冲体系中金枪鱼肽对黄嘌呤氧化酶抑制率的影响。

图3为三种缓冲体系中秋刀鱼肽对黄嘌呤氧化酶抑制率的影响。

图4为三种缓冲体系中核桃粕蛋白肽对黄嘌呤氧化酶抑制率的影响。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

4-羟乙基哌嗪乙磺酸对金枪鱼肽黄嘌呤氧化酶抑制剂的增强作用，具体实验步骤如下：

(1)在37℃条件下配制150mm，ph值7.4的hepes、tris-hcl、pb缓冲液，4℃保藏，待用；

(2)用上述150mm的缓冲液配制所需样品(金枪鱼肽)，样品浓度为40mg/ml；

(3)在96孔酶标板中依次加入50μl金枪鱼肽或50μl缓冲液(空白)、150μl黄嘌呤，每个样品做3个平行，37℃保温5min后加入50μl黄嘌呤氧化酶，30s读数一次吸光值，总计50次25min。读数完后以80μl的hcl终止反应，取反应液以相应缓冲液稀释10倍，过0.25μm水性膜，待测尿酸浓度；

(4)高效液相色谱法测定反应后样品中尿酸的含量，以尿酸标准品定量；

(5)计算黄嘌呤氧化酶抑制率，计算方法如下：

i＝(cb-cs)/cb×100％

式中：i表示黄嘌呤氧化酶抑制率，cb为空白组(不加多肽)反应后液相图谱尿酸峰的峰面积，cs表示样品组(加多肽)反应后液相图谱尿酸峰的峰面积。

本实施例中金枪鱼肽制备工艺流程为：将金枪鱼鱼肉搅碎按料液质量比1：1加去离子水混合，调节ph值至7.0，按金枪鱼质量的0.6～1.2％分别加入复合蛋白酶和木瓜蛋白酶，在50～60℃条件下酶解4～7小时，酶解结束后升温至95℃保温15min灭酶，冷却后离心，取上清液浓缩后喷雾干燥即得金枪鱼肽。

结果如图1和2所示，在hepes缓冲液，tris缓冲液和pb缓冲液中，黄嘌呤氧化酶催化黄嘌呤产生的尿酸含量几乎没有差异(图1)，而hepes能够显著性地提高金枪鱼多肽的黄嘌呤氧化酶抑制率(图2)，这一结果表明hepes可起到增强多肽黄嘌呤氧化酶抑制活性的作用。

实施例2

4-羟乙基哌嗪乙磺酸对秋刀鱼肽黄嘌呤氧化酶抑制剂的增强作用，具体实验步骤如下：

(1)在37℃条件下配制150mm，ph值7.4的hepes、tris-hcl、pb缓冲液，4℃保藏，待用；

(2)用上述150mm的缓冲液配制所需样品(秋刀鱼肽)，样品浓度为40mg/ml；

(3)在96孔酶标板中依次加入50μl秋刀鱼肽或50μl缓冲液(空白)，150μl黄嘌呤，每个样品做3个平行，37℃保温5min后加入50μl黄嘌呤氧化酶，30s读数一次吸光值，总计50次25min。读数完后以80μl的hcl终止反应，取反应液以相应缓冲液稀释10倍，过0.25μm水性膜，待测尿酸浓度；

(4)高效液相色谱法测定反应后样品中尿酸的含量，以尿酸标准品定量；

(5)计算黄嘌呤氧化酶抑制率，计算方法如下：

i＝(cb-cs)/cb×100％

式中：i表示黄嘌呤氧化酶抑制率，cb为空白组(不加多肽)反应后液相图谱尿酸峰的峰面积，cs表示样品组(加多肽)反应后液相图谱尿酸峰的峰面积。

本实施例中秋刀鱼肽制备工艺流程为：将秋刀鱼鱼肉搅碎按料液质量比1：2加去离子水混合，调节ph至7.0，按秋刀鱼质量的0.3～0.8％分别加入中性蛋白酶和胰蛋白酶，在50～60℃条件下酶解5～8小时，酶解结束后升温至95℃保温15min灭酶，冷却后离心，取上清液浓缩后喷雾干燥即得秋刀鱼肽。

结果如图1和3所示，hepes对黄嘌呤氧化酶催化黄嘌呤产生尿酸的过程无显著性影响(图1)，而hepes能够显著性地提高秋刀鱼肽的黄嘌呤氧化酶抑制率(图3)，这一结果表明hepes可起到增强多肽黄嘌呤氧化酶抑制活性的作用。

实施例3

4-羟乙基哌嗪乙磺酸对核桃粕蛋白肽黄嘌呤氧化酶抑制剂的增强作用，具体实验步骤如下：

(1)在37℃条件下配制150mm，ph值7.4的hepes、tris-hcl、pb缓冲液，4℃保藏，待用；

(2)用上述150mm的缓冲液配制所需样品(核桃粕蛋白肽)，样品浓度为40mg/ml；

(3)在96孔酶标板中依次加入50μl核桃粕蛋白肽或50μl缓冲液(空白)，150μl黄嘌呤，每个样品做3个平行，37℃保温5min后加入50μl黄嘌呤氧化酶，30s读数一次吸光值，总计50次25min。读数完后以80μ的lhcl终止反应，取反应液以相应缓冲液稀释10倍，过0.25μm水性膜，待测尿酸浓度；

(4)高效液相色谱法测定反应后样品中尿酸的含量，以尿酸标准品定量；

(5)计算黄嘌呤氧化酶抑制率，计算方法如下：

i＝(cb-cs)/cb×100％

式中：i表示黄嘌呤氧化酶抑制率，cb为空白组(不加多肽)反应后液相图谱尿酸峰的峰面积，cs表示样品组(加多肽)反应后液相图谱尿酸峰的峰面积。

本实施例中核桃粕蛋白肽制备工艺流程为：将提油后的核桃蛋白粕按料液质量比1：9加去离子水混合，升温至95℃保温30min，后冷却至50～60℃，按核桃粕质量的0.6～1.2％分别加入碱性蛋白酶和纤维素酶，55℃条件下酶解8～10小时，酶解结束后升温至95℃保温15min灭酶，冷却后离心，取上清液浓缩后喷雾干燥即得核桃粕蛋白肽。

结果如图1和4所示，hepes对黄嘌呤氧化酶催化黄嘌呤产生的尿酸含量几乎没有影响(图1)，而hepes能够显著性地提高核桃粕蛋白肽多肽的黄嘌呤氧化酶抑制率(图4)，这一结果表明hepes可起到增强多肽黄嘌呤氧化酶抑制活性的作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。