本发明涉及干细胞与组织工程技术领域，尤其涉及一种治疗糖尿病足的干细胞制剂。
背景技术：
根据推测，全球将有15％以上的糖尿病(diabetes mellitus，DM)患者会在患病的某段时期出现足溃疡。
DM足溃疡导致截肢者是非DM患者的15倍，截肢的患者中约50％是DM患者，这其中超过85％的DM截肢者的病因是足溃疡恶化合并深部感染或坏疽。糖尿病足(diabetic foot，DF)作为DM的一种严重慢性并发症，其发病机制比较复杂，常常是由于周围神经病变(Diabetic Peripheral Neuropathy，DPN)、周围血管病变(Peripheral Vascular Disease，PVD)、足部畸形及外伤感染等多种因素共同作用所致。DF病变复杂，不仅治疗困难，治疗时间长，而且需要高额的医疗费，同时由于其预后不佳，溃疡、截肢、死亡往往是其最后的结果，这些原因使得DF患者的生活质量大大降低，生存时间明显缩短。近年来，国内外对DF引起的一系列临床及社会问题越来越关注与重视，并加强了这方面的研究。
技术实现要素：
本发明的主要目的在于提供一种治疗糖尿病足的干细胞制剂，旨在通过干细胞移植而治疗糖尿病足。
为实现上述目的，本发明提供一种治疗糖尿病足的干细胞制剂，所述干细胞制剂包括间充质干细胞、低分子肝素钠、多糖、维生素B12、甲钴胺、头孢菌素、血管内皮生长因子以及溶剂，其中，所述间充质干细胞的浓度为(1～100)×107个/ml；所述低分子肝素钠的浓度为15～20ng/ml；所述多糖的体积百分比为1～10％；所述维生素B12的浓度为5～20mg/L；所述甲钴胺的浓度为5～20mg/L；所述头孢菌素的浓度为10～40μl/ml，其中，1μl的所述头孢菌素有200单位；所述血管内皮生长因子的浓度为10～20mg/L。
优选地，所述间充质干细胞的浓度为5×108个/ml。
优选地，所述低分子肝素钠的浓度为18ng/ml。
优选地，所述多糖的体积百分比为2％。
优选地，所述维生素B12的浓度为10mg/L。
优选地，所述甲钴胺的浓度为10mg/L。
优选地，所述头孢菌素的浓度为20μl/ml。
优选地，所述血管内皮生长因子的浓度为15mg/L。
优选地，所述间充质干细胞为人脐血间充质干细胞。
优选地，所述头孢菌素为二/三代头孢菌素。
本发明技术方案，通过将间充质干细胞、低分子肝素钠、多糖、维生素B12、甲钴胺、头孢菌素、血管内皮生长因子与溶剂共混，而制得治疗糖尿病足的干细胞制剂，该干细胞制剂能有效促进糖尿病足的修复，并改进温、痛觉，极大地减小了糖尿病足的创伤面积，对糖尿病足具有良好的疗效。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种治疗糖尿病足的干细胞制剂，该干细胞制剂包括组分如下：
间充质干细胞、低分子肝素钠、多糖、维生素B12、甲钴胺、头孢菌素、血管内皮生长因子以及溶剂。在该干细胞制剂中，该间充质干细胞的浓度为(1～100)×107个/ml；该低分子肝素钠的浓度为15～20ng/ml；该多糖的体积百分比为1～10％；该维生素B12的浓度为5～20mg/L；该甲钴胺的浓度为5～20mg/L；该头孢菌素的浓度为10～40μl/ml，其中，1μl的头孢菌素有200单位；该血管内皮生长因子的浓度为10～20mg/L。换而言之，在1ml的干细胞制剂中，间充质干细胞有(1～100)×107个，低分子肝素钠为15～20ng，多糖的体积为0.01～0.1ml，维生素B12为0.005～0.02mg，甲钴胺为0.005～0.02mg，头孢菌素的体积为10～40μl(每μl有200单位)，血管内皮生长因子为0.01～0.02mg。
本发明治疗糖尿病足的干细胞制剂能有效促进糖尿病足的修复，并改进温、痛觉，极大地减小了糖尿病足的创伤面积，对糖尿病足具有良好的疗效。其中，间充质干细胞表达高水平的脑源性神经营养因子、血管内皮生长因子及神经生长因子，这些分子对损伤细胞的修复有促进作用，进而不仅对缺血性病变有效，还可以对周围神经损伤所致的临床症状有明显的改善作用；低分子肝素钠具有抗凝血、抗血栓作用，提高糖尿病足的局部血液流动，加速糖尿病足的修复和治疗；多糖为细胞提供养分，保证细胞的活性；维生素B12和甲钴胺均为受损神经组织提供神经营养因子，有利于修复受损神经组织；头孢菌素起杀菌作用，防止糖尿病足感染加剧，控制病情，止温减痛；血管内皮生长因子促进血管内皮生长，诱导体内血管新生，促进损伤组织的修复。
需要说明的是，该间充质干细胞是来源于发育早期中胚层的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的多能干细胞，广泛存在于脐带、骨髓等多种组织中，可在体外培养扩增，并能在特定条件下分化成肝细胞、神经细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、脂肪细胞等；具体地，本发明间充质干细胞可以来源于脐带、骨髓、脐带血、全身结缔组织或器官间质。该多糖为细胞所需糖分，具体可以为肽聚糖、糖原、肝素、葡萄糖、甘露聚糖或者半乳聚糖。该溶剂只要满足提供间充干细胞的存活的介质即可，具体可以是培养基、缓冲液或水等等，至于溶剂的用量可根据实际需求进行调配，均为本领域技术人员的常规做法，在此不做赘述。
现通过实施例对本发明治疗糖尿病足的干细胞制剂做进一步解释，以详细说明其技术方案及带来的技术效果。
实施例1
一、间充质干细胞的制备
在征得同意后，脐带血采集于吉林大学中日联谊医院产科健康分娩孕妇(乙肝、丙肝、HIV均阴性)，然后，将脐带血在无菌条件下经分离处理后制成细胞悬液。
本实施例选用加拿大威尔森公司研制、宁夏中联生物有限公司生产的骨髓、脐带血细胞处理试剂盒，其专门用于从人骨髓、脐带血中分离、纯化出成体干细胞/祖细胞，采取负收集混合法，分步去除靶细胞；具体操作步骤如下：
1、将含有肝素或枸橼酸盐抗凝的脐带血转移至500ml的无菌容器中(可根据分离的脐带血体积决定使用容器的大小)，按脐带血与A液(试剂盒中的A液)2:1的比例加入A液，混匀；
2、步骤1后的液体体积与B液(试剂盒中的B液)按3:1的比例加入B液，容器封闭后充分混匀，室温静置(静置期间不得再摇动容器)，约20～30分钟；
3、静置20～30分钟后，红细胞沉降至最下层，而形成红细胞层和上层液体，用无菌移液管将上层液体(约占全容量的3/4)移至50ml无菌离心管中，吸至上层液体与红细胞层的液面交界处，尽量不吸红细胞层；
4、弃去红细胞层；
5、将步骤3中收集到的离心管中的上层液体，于离心机中，2500rpm，离心5分钟；
6、取步骤5离心后的离心管，弃其上清，收集离心管底部的细胞；
7、用A液冲洗离心管内的细胞，静冲洗后的细胞移至另一离心管内，加A液，2500rpm，离心5分钟；
8、取一新的50ml的离心管，加入25mlC液(试剂盒中的C液)；
9、弃步骤7离心的上清，加入A液20ml，将细胞混匀后沿离心管壁缓缓加入到装有25ml的C液的离心管中，注意加入速度要慢，保证两液体分界清楚；
10、将步骤9的离心管1200rpm，离心20分钟；
11、步骤10离心后吸取中间云雾状的薄层加至新的离心管中，用A液洗涤两次，收集人脐血间充质干细胞备用。
二、干细胞制剂的制备
将步骤一制备的人脐血间充质干细胞2.5×1010个、低分子肝素钠900ng、多糖1ml、维生素B12 0.5mg、甲钴胺0.5mg、二/三代头孢菌素(200单位/μl)1000μl、血管内皮生长因子0.75mg与适量的水共混，制得50ml的干细胞制剂。
其中，人脐血间充质干细胞的浓度为5×108个/ml，低分子肝素钠的浓度为18ng/ml，多糖的体积百分比为2％，维生素B12的浓度为10mg/l，甲钴胺的浓度为10mg/l，二/三代头孢菌素的浓度为20μl/ml；血管内皮生长因子的浓度为15mg/l。
实施例2
一、间充质干细胞的制备
请参照实施例1，与实施例1相同。
二、干细胞制剂的制备
将步骤一制备的人脐血间充质干细胞5×108个、低分子肝素钠750ng、多糖0.5ml、维生素B12 0.25mg、甲钴胺0.25mg、二/三代头孢菌素(200单位/μl)500μl、血管内皮生长因子0.5mg与适量的水共混，制得50ml的干细胞制剂。
其中，人脐血间充质干细胞的浓度为1×107个/ml，低分子肝素钠的浓度为15ng/ml，多糖的体积百分比为1％，维生素B12的浓度为5mg/l，甲钴胺的浓度为5mg/l，二/三代头孢菌素(200单位/μl)的浓度为10μl/ml；血管内皮生长因子的浓度为10mg/l。
实施例3
一、间充质干细胞的制备
请参照实施例1，与实施例1相同。
二、干细胞制剂的制备
将步骤一制备的人脐血间充质干细胞5×1010个、低分子肝素钠1000ng、多糖5ml、维生素B12 1mg、甲钴胺1mg、二/三代头孢菌素(200单位/μl)2000μl、血管内皮生长因子1mg与适量的水共混，制得50ml的干细胞制剂。
其中，人脐血间充质干细胞的浓度为1×109个/ml，低分子肝素钠的浓度为20ng/ml，多糖的体积百分比为10％，维生素B12的浓度为20mg/l，甲钴胺的浓度为20mg/l，二/三代头孢菌素(200单位/μl)的体积为40μl/ml；血管内皮生长因子的浓度为20mg/l。
验证实验：
1、动物实验模型构建和分组：
健康清洁级雄性SD大鼠100只，体重110～140g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。
大鼠适应性喂养1周后，高脂饲料(碳水化合物20.1％，脂肪59.8％，蛋白质20.1％)喂养1个月，禁食12h后称量体重，按体重45mg/kg腹腔注射STZ(链脲佐菌素)，以3d后测空腹血糖≥13.9mmol/L的大鼠构建糖尿病模型，次日用液氮棉签法建立糖尿病足溃疡模型，液氮棉签冷冻大鼠右后肢各3次，每次持续约20s，一次冷冻后待皮肤复温后再行下次冷冻，冷冻后出现后肢局部充血水肿，冷冻后第2d后肢充血水肿范围扩大，冷冻后第3d水肿范围局限化，皮色变暗红色，冷冻后第5d形成溃疡，选取Wagner分级3级的动物。
取已建立糖尿病足溃疡模型的大鼠80只，随机分为四组，每组20只，分别为实施例1组、实施例2组、实施例3组和对照组。
2、干细胞制剂治疗
实施例1组于足溃疡边缘1mm等距4个位点皮下肉膜层注射共约0.1ml的实施例1制备的干细胞制剂悬液，小腿肌肉内(6个位点，深度1cm，间距5mm)每个点注射0.05ml的实施例1制备的干细胞制剂悬液，于干细胞移植后7d、14d、28d时，观察创面面积(cm2)；
实施例2组采用实施例2制备的干细胞制剂悬液进行干细胞移植，具体操作与实施例1组的操作相同；
实施例3组采用实施例3制备的干细胞制剂悬液进行干细胞移植，具体操作与实施例1组的操作相同；
对照组采用生理盐水进行治疗，具体操作与实施例1组的操作相同。
参见下表1，表1为实施例1组、实施例2组、实施例3组和对照组进行治疗后7d、14d、28d时创面面积的大小。
表1
综上所述，本发明实施例1～3制备的干细胞制剂移植治疗糖尿病足后，糖尿病足的创伤面积逐渐减小，能够明显缩小糖尿病足溃疡体积，使受损组织逐渐恢复，因此，本发明治疗糖尿病足的干细胞制剂具有良好的治疗效果，其中，本发明实施例1的治疗效果尤佳。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书所作的等效变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。