本发明涉及药物制剂领域，特别是涉及一种细胞因子类创伤修复药物喷雾剂及其制备方法。
背景技术：
：：创伤修复一直是医学领域的研究热点，皮肤作为人体最大最外部的器官极易遭受创伤，近年来随着工业科技的不断发展，各种急性创伤伤员数量不断增加，同时因糖尿病、截瘫和局部射线照射等所致的慢性难愈性创面也相应增多。据统计，美国每年大约有110万人遭受急性创伤，大约有30万住院治疗。但目前创伤修复的水平与质量经常无法满足患者的要求，因此，进一步了解创伤修复的机制，完善现有治疗方法以及发现新的治疗方法需要国内外学者们进行大量的研究工作。创伤后组织修复一般经历炎症反应、细胞增殖修复和组织的成熟与重建这三个紧密联系的阶段。创伤修复的过程，不仅是各种细胞增殖、分化、迁移、凋亡和消失的过程，同时也是一系列不同类型细胞、结构蛋白、细胞因子和蛋白激酶等形成网络式交互作用的结果。细胞因子是一类对细胞生长、分化有明显调控作用的小分子生物活性多肽，因具有多效性、高效性和网络性等特点，通过调节创伤修复过程中的多种细胞反应，影响细胞增殖、迁移、细胞外基质合成和释放，在创伤愈合过程中扮演了重要的角色。涉及创伤修复的细胞因子主要有：表皮细胞生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、转化生长因子(TGF-β)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、肝细胞生长因子(HGF)等，它们在促进细胞的趋化、合成和增殖分化方面发挥着各自的作用。成纤维细胞是创伤修复的主要细胞，在创伤修复中，研究较多的是碱性FGF(bFGF)，它是体内广泛存在的一类活性多肽，具有促血管生成作用，调节血管壁细胞的生长及其功能，趋化炎性细胞和组织修复细胞向创面聚集。EGF通过刺激表皮细胞和组织成纤维细胞分裂，加强其它生长因子的合成和作用，从而显著促进表皮再生。VEGF通过其受体特异性作用于血管内皮细胞，促进血管内皮细胞的迁移、增殖和分化。PDGF通过增加血管内皮细胞上的PDGFR数量而促进VEGF转录和分泌，从而促进创伤修复。HGF促进创伤修复的作用也与VEGF有关。TGF-β在维持组织动态平衡中也具有重要作用，创伤愈合过程中几乎所有细胞都可分泌TGF-β，包括角质细胞、成纤维细胞和黑色素细胞等，它可以促进细胞外基质沉积和纤维化形成，这是伤后疤痕出现的重要原因。研究表明，细胞生长因子作为药物可以加速组织的修复和逆转不良修复状态。近年来，已有富含生长因子的药物应用于临床，以加速创伤愈合，含生长因子创伤敷料也已成为医用敷料领域发展的新亮点。目前上市的用于创伤修复的细胞因子类制剂多为凝胶剂和液体制剂，如重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶(商品名：贝复新)、重组牛碱性成纤维细胞生长因子外用溶液(商品名：贝复济)、重组牛碱性成纤维细胞生长因子滴眼液(商品名：贝复舒)、重组人表皮生长因子凝胶(商品名：易孚)、重组人表皮生长因子喷剂(商品名：金因肽)、重组人表皮生长因子滴眼液(商品名：易贝)，但市售的凝胶剂在涂抹时易造成伤口疼痛和间接的细菌感染，患者顺应性不佳，而液体制剂易挥发，不易在创面处形成药膜，造成药物疗效短暂。而且细胞生长因子对温度敏感，在水溶液中不稳定，易发生降解反应而失去活性，因此其水溶液必须在低温条件下保存。因此在临床上必须运用一种高效安全的新型制剂，弥补目前传统制剂在创伤修复治疗中的不足，提高创伤愈合的疗效及患者顺应性。溶致液晶主要是由一种或多种两亲性化合物组成的化学体系，即两亲性化合物和溶剂形成的有序的体系。当两亲性分子与水(或有机溶剂)混合时，水分子或溶剂分子根据自身的极性分配在两亲性分子的极性端或非极性端，破坏了两亲性分子本身晶体的有序取向，而使分子在一维或多维空间上有序地排列形成液晶态，因而被称为溶致液晶。随着结构中溶剂的含量改变，溶致液晶结构也会发生相态的转变。溶致液晶独特的结构具备既可以容纳极性分子也可容纳非极性分子的优点，因而溶致液晶作为药物载体引起了许多研究者的兴趣。溶致液晶作为药物载体主要有三种形式：前体，凝胶及粒子分散体系。前体以固态或液态形式存在，在外因如接触液体的诱导下形成层状液晶、立方液晶或六角液晶；凝胶是一种光学各向同性的立方液晶或光学各向异性的六角液晶，粘稠透明，可与水平衡共存，常用于透皮给药系统；液晶粒子分散体系为液晶材料与水形成了立方液晶后以纳米尺寸分散在过量的水溶液中。目前还没有将溶致液晶运用于创伤修复的相关报道。技术实现要素：基于此，本发明的目的是针对现有的细胞因子类创伤修复药物市售制剂的不足，提供一种细胞因子类创伤修复药物的新制剂。实现上述发明目的的具体技术方案如下：一种溶致液晶前体喷雾剂，主要由以下质量百分比的原料制备而成：所述细胞因子类创伤修复药物选自重组人表皮生长因子、重组牛碱性成纤维细胞生长因子、重组人转化生长因子、重组人血管内皮细胞生长因子、重组人血小板源性生长因子中的至少一种；所述分散介质选自乙醇、N-N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、丙二醇、2-吡咯烷酮、5-甲基吡咯烷酮、1,5-二甲基吡咯酮、N-乙基吡咯酮、5-羧基吡咯酮、苯甲醇、油酸乙酯、大豆油、苯甲酸苄酯中的至少一种；所述释放调节剂选自聚乙二醇、吐温20、吐温40、吐温60、吐温80、正丁醇和乙二醇中至少一种。在其中一些实施例中，所述聚乙二醇选自聚乙二醇400、聚乙二醇200、聚乙二醇300、聚乙二醇600。在其中一些实施例中，所述聚乙二醇为聚乙二醇400。在其中一些实施例中，所述分散介质为乙醇和/或N-N-二甲基乙酰胺。在其中一些实施例中，所述溶致液晶前体喷雾剂主要由以下质量百分比的原料制备而成：在其中一些实施例中，所述溶致液晶前体喷雾剂主要由以下质量百分比的原料制备而成：在其中一些实施例中，所述细胞因子类创伤修复药物为重组人表皮生长因子。在其中一些实施例中，所述溶致液晶前体喷雾剂主要由以下质量百分比的原料制备而成：在其中一些实施例中，所述溶致液晶前体喷雾剂，主要由以下质量百分比的原料制备而成：在其中一些实施例中，所述溶致液晶前体喷雾剂，主要由以下质量百分比的原料制备而成：本发明还提供了上述溶致液晶前体喷雾剂的制备方法。具体技术方案如下：一种上述的溶致液晶前体喷雾剂的制备方法，包括以下步骤：将分散介质与释放调节剂混合均匀后，加入甘油单油酸酯，涡旋混匀后，再加入细胞因子类创伤修复药物的水溶液，不断涡旋使其形成均一稳定的溶致液晶前体溶液，即得。本发明的细胞因子类创伤修复药物溶致液晶前体喷雾剂具有以下优点和有益效果：(1)发明人通过长期的经验积累和大量的实验研究，筛选不同的液晶材料和其它辅料，再通过调节药物与各组分的配比得到了本发明的细胞因子类创伤修复药物溶致液晶前体喷雾剂。该喷雾剂粘度适中，具有很好的流动性和喷雾效果，遇少量水即能迅速形成溶致液晶凝胶，喷于创面处后，遇生理盐水即可立即形成溶致液晶凝胶，胶凝时间短，可在创面处形成一层保护膜，可有效抵抗外界刺激，避免细菌感染，使伤口部位湿润，加速愈合进程，给药方便安全，且具有良好的生物相容性、黏膜粘附性和润滑性。该喷雾剂既克服了传统喷雾剂易挥发、成膜难以及迅速流失的缺点，又避免了半固体制剂涂抹时带来的疼痛和间接感染。(2)本发明的喷雾剂在体外情况下为液态，易于工业化生产，使用方便，剂量易准确控制，喷于创面后，均匀铺展，粘附于创面形成溶致液晶凝胶，由于溶致液晶独特的结构，且喷雾剂中溶剂用量较小，能够增加细胞因子类创伤修复药物在制剂中的物理稳定性和化学稳定性，有效地保护了药物的活性，增强了药物疗效。(3)本发明的喷雾剂中通过进一步加入释放调节剂(优选PEG400、PEG200、PEG300、PEG600，更优选PEG400)，可以进一步调节喷雾剂的粘度，减少溶剂的用量，减少有机溶剂对药物活性的影响，进一步保护的药物活性。(4)本发明的喷雾剂喷于创面后，与生理盐水立即形成的溶致液晶凝胶，通过释放调节剂(优选PEG400、PEG200、PEG300、PEG600，更优选PEG400)与各组分的复配调节作用，在不引起溶致液晶前体组合物原位性能改变的条件下，降低了药物在溶致液晶中的分配系数，改善药物的释放特征，促使药物在换药周期内释放完全，即：相比现有制剂具有很好的缓慢释药的效果，没有药物突释现象，同时不会使释放率过低，具有良好的48小时的缓释效果，提高药物的治疗效果。(5)本发明的喷雾剂喷于创面后，与生理盐水立即形成溶致液晶凝胶，其晶相不随人体体温变化而变化，结构稳定，可稳定地发挥疗效。附图说明图1为实施例9中溶致液晶前体的BSA体外释放结果图；图2为实施例6和实施例7的溶致液晶前体的rhEGF体外释放结果图；图3为实施例6～7的溶致液晶前体的差示扫描量热图谱。具体实施方式以下结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明。以下实施例中所用的试剂均为市售普通试剂，其中：重组人表皮生长因子(rhEGF)：纯度≥97％，批号HLM7615081，R&DSystems；甘油单油酸酯(GMO)：批号116703，MO/DKOSHER；植烷三醇(PYT)：批号UQ90818031，DSM；乙醇(EtOH)：批号20120216，天津市永大化学试剂有限公司；N-N-二甲基乙酰胺(DMAC)：纯度≥99.5％，批号20130616，天津市富宇精细化工公司；N-甲基吡咯烷酮(NMP)：纯度≥99.0％，批号20120216，天津市光复精细化工研究所；聚乙二醇400(PEG400)：批号20150514，天津市大茂化学试剂厂。实施例1按照表1中的实施例1的组成，将GMO与分散介质(EtOH)涡旋混匀后即得溶致液晶前体初级溶液。表1实施例1～7与对比例1-3的处方组成实施例2～3采用与实施例1相同的制备方法，由表1中实施例2-3的组成制得实施例2～3的溶致液晶前体初级溶液。实施例4按照表1中的实施例4的组成，将rhEGF溶于超纯水中，再将分散介质(EtOH)与GMO涡旋混匀，接着加入rhEGF的水溶液，不断涡旋使其形成均一稳定的重组人表皮生长因子溶致液晶前体溶液，即重组人表皮生长因子溶致液晶前体喷雾剂。实施例5采用与实施例4相同的制备方法，由表1中实施例5的组成制得实施例5的重组人表皮生长因子溶致液晶前体溶液。实施例6按照表1中的实施例6的组成，将rhEGF溶于超纯水中；将分散介质(EtOH)与PEG400混合均匀后，加入GMO，涡旋混匀；再加入rhEGF的水溶液，不断涡旋使其形成均一稳定的重组人表皮生长因子溶致液晶前体溶液。实施例7采用与实施例6相同的制备方法，由表1中实施例7的组成制得实施例7的重组人表皮生长因子溶致液晶前体溶液。对比例1采用与实施例4相同的制备方法，由表1中对比例1的组成制得对比例1的重组人表皮生长因子溶致液晶前体溶液。对比例2按照表1中的对比例2的组成，将rhEGF溶于超纯水中；将分散介质(EtOH)与PEG400混合均匀后，加入PYT，涡旋混匀；再加入rhEGF的水溶液，不断涡旋使其形成均一稳定的重组人表皮生长因子溶致液晶前体溶液。对比例3采用与对比例2相同的制备方法，由表1中对比例3的组成制得对比例3的重组人表皮生长因子溶致液晶前体溶液。实施例8对实施例1～7与对比例1～3的溶致液晶前体初级溶液或者重组人表皮生长因子溶致液晶前体溶液进行流变学考察、喷雾效果评价及胶凝时间的测定。流变学考察采用旋转流变仪(KinexusLab+，MalvernInstrumentsLimitsCo.)，测定各实施例和对比例在剪切速率为10s-1条件下的剪切粘度，选用的测量夹具型号为CP1/60SR0909SS，测定温度为25±0.5℃。胶凝时间测定指将生理盐水于水浴中加热至32℃，分别取实施例1～7与对比例1-3的前体溶液，用滴管滴入32℃的生理盐水中，记录胶凝时间。表2实施例1～7与对比例1～3的流变学数据及喷雾效果(n＝3)由表2结果可知，实施例1～2中，液晶材料GMO均可均匀地分散在介质EtOH或DMAC中，其单体性质得到良好的抑制，前体初级溶液均匀且稳定，流动性和喷雾效果良好，遇水立即胶凝；而实施例3中采用NMP为分散介质，前体初级溶液粘度增加，雾化阻力增大，喷雾效果一般，比实施施例1-2的效果差；实施例4～7中，GMO均可均匀地分散在介质EtOH/PEG400、DMAC/PEG400或较多量的EtOH或DMAC中，制备得到的重组人表皮生长因子溶致液晶前体溶液均匀且稳定，流动性和喷雾效果良好，遇水立即胶凝。当前体溶液刚接触到水时，先是外层形成了凝胶膜，当凝胶膜的强度及水对凝胶的压强足以抵抗凝胶膜内部流体的张力，则凝胶的形状保持为刚滴加入水的形状。接着外界的水介质逐渐向凝胶内部扩散和渗透，逐渐形成稳定的、水量分布均匀的凝胶。由对比例1与实施例2的比较可知：对比例1中DMAC与GMO的配比与实施例2相同，实施例2制备得到的液晶前体溶液均匀且稳定，流动性和喷雾效果良好，但是对比例1中加入重组人表皮生长因子的水溶液后制备得到的液晶前体溶液，由于受具体药物溶液的影响，少量的DMAC无法抑制GMO的单体性质，导致溶致液晶前体溶液的粘度大大增加，雾化阻力增大，喷雾效果较差。由对比例1与实施例7的比较可知：实施例7中由于加入了聚已二醇400，通过聚已二醇与各组分的协同作用，降低了制备得到的溶致液晶前体溶液的粘度，雾化阻力降低，喷雾效果良好。由于大量的分散介质会对重组人表皮生长因子的活性造成影响，因此溶剂用量不宜过大，聚已二醇400的加入可以降低溶剂的用量，从而降低溶剂对重组人表皮生长因子的活性的影响，提高了重组人表皮生长因子在制剂中的稳定性。由对比例2～3与实施例6-7比较可知：当采用PYT代替GMO作为液晶材料，制备得到的重组人表皮生长因子溶致液晶前体溶液的粘度增加，雾化阻力增大，无法达到良好的喷雾效果。实施例9按实施例4-7的组成以及制备方法，将其中的重组人表皮生长因子替换为牛血清白蛋白(BSA)，制备得到实施例9a-9d的牛血清白蛋白的溶致液晶前体溶液(处方组成如下表)。以实施例9a-9d的溶致液晶前体溶液考察各处方组成对药物释放的影响。采用无膜溶出法考察实施例9a-9d的溶致液晶前体中BSA的体外释放特性。分别将0.300g溶致液晶前体滴入10ml的PBS(pH7.4)中，并在37℃，100rpm的摇床中模拟体外释放，分别在投样后1、3、6、12、24、48h取1ml样品于经0.22μm微孔滤膜过滤并于4℃保存待测，每次取样后需加入等量释放介质继续按上述条件模拟体外释放。结果如图1所示。由图1可知，实施例9a和实施例9b的溶致液晶前体溶液在48h的BSA累积释放率仅达到12％，而实施例9c和实施例9d的溶致液晶前体溶液，其制备原料中由于加入一定比例的PEG400，其48h的BSA累积释放率达50％以上，说明PEG400大大提高了BSA在溶致液晶凝胶中的释放。由于溶致液晶凝胶致密的网络结构对药物具有较强的缓释效果，导致BSA在48h的累积释放率极低，而临床换药频率大约是两天换一次药，导致药物在换药周期内释放率较低无法达到良好的治疗效果，且造成药物的浪费。实施例9c和实施例9d由于加入了适量的亲水性物质PEG400，在不引起溶致液晶前体组合物原位性能改变的条件下，降低了药物在溶致液晶中的分配系数，促使药物在换药周期内释放完全，且PEG400的亲水性质还可促进药物的扩散行为，从而加速药物的释放，改善药物的释放特征，提高药物的治疗效果。实施例10对实施例6和实施例7的重组人表皮生长因子溶致液晶前体溶液进行体外释放度的测定。采用无膜溶出法考察溶致液晶前体中rhEGF的体外释放特性。分别将0.135g溶致液晶前体滴入10ml的PBS(pH7.4)中，并在37℃，100rpm的摇床中模拟体外释放，分别在投样后1、3、6、12、24、48h取1ml样品于经0.22μm微孔滤膜过滤并于4℃保存待测，每次取样后需加入等量释放介质继续按上述条件模拟体外释放。结果如图2所示。由图2可知，rhEGF液体制剂(将rhEGF溶于无菌PBS缓冲液中，载药量与实施例6相同)的释放呈现下降趋势，rhEGF药物在液体介质中容易降解，48h的降解率接近80％，说明rhEGF在溶液中及其不稳定。rhEGF在实施例6和实施例7的溶致液晶前体中的释放显示了低突释率和平稳的缓释效果，在48小时内，二者的累积释放率均达到了70％以上。本发明的溶致液晶前体喷雾剂在使用时与水可立即形成液晶凝胶，不仅可以很好的调节药物的释放，既有较好的缓释效果，又不至于使释放率过低，同时显著提高了rhEGF的稳定性，有效保持了药物的生物活性。通过Origin软件可拟合出rhEGF在实施例6和实施例7的溶致液晶前体中的释放模型均较符合一级动力学模型。实施例11对实施例4～7的重组人表皮生长因子溶致液晶前体溶液进行凝胶制备和机械性质的测定。凝胶制备方法如下：在搅拌过程中，逐渐向溶致液晶前体溶液中加入过量水，于室温条件下静置平衡，凝胶呈均匀的状态，于4000rpm转速下离心10min，除去多余的水，制备成界面为水平面的凝胶。凝胶机械性质包括凝胶强度和粘附性，本实施例使用TA.XTPlus质构仪(StableMicroSystemsLtd)对上述性质进行定量测定。实验中选择凝胶冻力专用探针P/0.5，垂直伸入凝胶中，当探针接触到凝胶界面时，以0.5mm·s-1的速度深入到凝胶5mm深度处，此时测定的值为凝胶的强度。接着探针以0.5mm·s-1的速度缓缓从凝胶中退出，此时便得到凝胶对探针的粘附力。实验结束后软件自动绘出随时间变化探针受力的变化曲线图，其中力的最大正值则是凝胶强度值，力的最大负值则是凝胶的粘附力(参见表3)。表3实施例4～7的凝胶机械性质(n＝3)由表3结果可知，实施例4～7中，凝胶强度均较大，且由实施例6～7的溶致液晶前体溶液制备的凝胶，其强度大于实施例4-5，说明本发明的溶致液晶前体喷雾剂与水形成的溶致液晶凝胶，其分子间作用力较大，所形成的分子结构较稳定，材料本身不易被损坏。另外，凝胶的粘附力均较大，具有良好的生物相容性和黏膜粘附性，且实施例6～7大于实施例4-5。实施例12对实施例6～7的溶致液晶前体喷雾剂进行凝胶晶相变化观察。采用热台偏光显微镜观察实施例6～7的溶致液晶前体喷雾剂制备的凝胶液晶相态随温度变化的改变，热台从25℃升温至40℃，升温速率为2℃/min。在此过程中用MShot软件拍摄偏光显微镜中的液晶双折射图案判断晶相。结果显示，当热台从25℃升温至40℃的过程中，实施例6～7的溶致凝胶液晶在偏光显微镜下的视野均为暗视野，即凝胶液晶相态在此温度范围内均为立方液晶相，由此可推测在临床给药过程中，本发明的溶致液晶前体喷雾剂与水形成的立方液晶凝胶，其晶相不随人体体温变化而变化，可稳定地发挥疗效。实施例13对实施例6～7的溶致液晶前体喷雾剂进行相转变温度的测定。采用差示扫描量热法(DSC)测定相转变温度，取约5～10mg的各实施例的溶致液晶前体喷雾剂制备的凝胶于铝坩埚中，DSC温度扫描范围为25～40℃，扫描速率为5℃/min。结果如图3所示，从25℃升温至40℃过程中，DSC图谱不出现任何吸热峰，由此更证明了在临床用药时，本发明的溶致液晶前体喷雾剂与水形成的溶致液晶凝胶，其晶相不随人体体温变化而变化，疗效稳定。以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。当前第1页1 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