一种包封鳖甲肽的RGD‑SSL脂质体及其制备方法与流程

本发明涉及一种药物制剂领域，具体地说，是一种包封鳖甲肽的RGD-SSL脂质体及其制备方法。

背景技术：

脂质体具有磷脂双分子层结构，可包封亲水或亲脂性药物提高药物稳定性，增加药物的溶解度，其生物相容性和降解性良好，同细胞可发生膜融合、内吞等作用，具有较强的组织亲和力。另外，脂质体可通过组分改变、表面修饰、粒径控制等设计改变药物的药代动力学性质及体内分布，据有一定的组织或细胞靶向性。其中，粒径小于150nm的脂质体能穿过肝窦内皮细胞窗孔到达Disse腔，本发明脂质体粒径100nm左右，肝靶向性明显。同时，本发明的脂质体表面具有PEG链，具长循环性，循环半衰期高。

鳖甲是治疗肝纤维化的代表中药之一，目前，以H-G-R-F-G为氨基酸序列的寡肽从鳖甲中被成功分离，体外实验证明HGRFG具有肯定的抗肝纤维化作用。鳖甲作为鳖甲煎丸、复方鳖甲软肝片、鳖甲抗纤方等组方的君药，在中药治疗肝纤维化中具有重要地位，鳖甲肽HGRFG属于寡肽类物质，而肽类口服较易降解，稳定性差，需要频繁给药。因此，寻找在肝脏局部富集并发挥抗肝纤维化作用的递药系统尤为重要。而脂质体可减少给药剂量，生物相容性好，能够较好地发挥局部生物学效应，尤其是表面含配基的脂质体可通过配体-受体相互作用靶向特定组织与细胞。RGD序列是绝大多数整合素的最常见识别位点，而诸多慢性肝病的肝纤维化进程具有一致的整合素过表达现象。

整合素是一类介导细胞-细胞、细胞-细胞外基质(extracellular matrix，ECM)之间黏附作用的跨膜糖蛋白受体家族。整合素的配体主要是ECM成分，包括纤连蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋白等。肝纤维化进程中ECM过度沉积，而多数ECM蛋白中均存在RGD序列。因此，RGD可识别多种整合素，RGD修饰的脂质体可靶向肝纤维化过程中生成的ECM，以提高脂质体内部包封的鳖甲肽抗肝纤维化的治疗效果。

技术实现要素：

本发明正是针对现有技术的不足之处作出了改进，提供了一种针对便秘的铁皮石斛合剂。

本发明是通过以下技术方案来实现的：

本发明公开了一种RGD修饰的鳖甲肽长循环脂质体，所述的RGD修饰的鳖甲肽长循环脂质体包括脂质体和在脂质体中的鳖甲肽(HGRFG)，脂质体是含下列组分及摩尔比：蛋黄卵磷脂(EPC)：胆固醇(Chol)：mPEG2000-DSPE：RGD-PEG2000-DSPE的摩尔比为50：25：1：0.6，鳖甲肽(HGRFG)与EPC的重量比为1:5-1：30，鳖甲肽结构式为式I，Mw为573.25；

作为进一步地改进，本发明所述的EPC为高纯蛋黄卵磷脂，含磷脂酰胆碱98％以上；Chol为胆甾-5-烯-3β-醇，mPEG为甲基化PEG。

作为进一步地改进，本发明所述的RGD是以精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸为序列的环肽，其结构式如式Ⅱ所示：

一种RGD修饰的鳖甲肽长循环脂质体的制备方法，具体包括以下步骤：

1)制备RGD-PEG2000-DSPE：由RGD与DSPE-PEG2000-Mal偶联而成；

2)精密称取EPC：Chol：mPEG2000-DSPE(50：25：1，摩尔比)置于茄型瓶中，加入适量氯仿振摇，于40℃水浴，减压旋转蒸干氯仿，真空干燥2h，将适量含鳖甲肽的PBS缓冲液做为水化液逐滴滴入茄型瓶，旋涡振荡形成脂质体混悬液，将脂质体混悬液于60℃孵育30min，采用MiniExtruder挤出仪挤压，反复通过孔径50nm的聚碳酸酯膜15次，即得SSL-鳖甲肽，采用后插法将适量占EPC 1.2mol％的RGD-PEG2000-DSPE与空白脂质体55℃孵育1h，即得RGD-SSL-鳖甲肽。

本发明的有益效果如下：

本发明公开了一种RGD修饰的鳖甲肽长循环脂质体(RGD-SSL-鳖甲肽)的制备方法,该脂质体表面具PEG链，即长循环脂质体(SSL)，可增加循环半衰期。其粒径控制在平均100nm左右，静脉注射后具明显的肝靶向性，同时，脂质体表面通过以精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)为序列的环肽修饰，可特异性与肝纤维化进程中过表达的整合素结合。而脂质体内水相包封的鳖甲肽是从中药鳖甲中提取的以HGRFG为序列的单体，细胞水平已证明其显著的抗肝纤维化作用。由此，本发明针对鳖甲肽等寡肽口服易降解、生物利用度低，半衰期短的问题，采用粒径及RGD修饰双重设计的肝靶向脂质体包封鳖甲肽，可提高其局部生物学效应及循环半衰期，减少给药频次，适用于肝纤维化等肝脏疾病的治疗。

本发明克服鳖甲肽等寡肽口服易降解、生物利用度低，半衰期短的问题，采用粒径及RGD修饰双重控制的肝靶向脂质体包封鳖甲肽，得到一种RGD修饰的鳖甲肽长循环脂质体(RGD-SSL-鳖甲肽)，提高局部生物学效应及循环半衰期，减少给药频次，适用于肝纤维化等肝脏疾病的治疗。

附图说明

附图1是RGD-SSL-鳖甲肽结构示意图；

附图2是脂质体粒径及多分散系数(PDI)图表；

附图3是鳖甲肽HPLC谱图；

附图4是鳖甲肽HPLC标准曲线图；

附图5是不同药脂比的鳖甲肽包封率图表；

附图6是RGD-DiR-SSL在BALB/c裸鼠的体内分布荧光值。

具体实施方式

下面通过具体实施例子对本发明的技术方案作进一步地说明：

1.首先制备RGD-PEG2000-DSPE

原料为：一种精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)为序列的环肽，其结构式如式Ⅱ及一种DSPE-Poly(Ethylene Glycol)-Maleimide,Average Mw 2000，即DSPE-PEG2000-Mal，其结构式如式III所示：

RGD-PEG2000-DSPE的制备方法包括如下步骤：

精密称取适量RGD、DSPE-PEG2000-Mal粉末分别置于PBS(pH 6.0，含3mM EDTA，pH 4.0)缓冲液，配制成相应的储备液，同体积时摩尔比1:1，吸取不同体积的两种溶液分别使RGD：DSPE-PEG2000-Mal＝x:1(摩尔比，x＝1，1.5，2)，充分振荡后，37℃孵育2h。用50mM Na₂HPO₄(pH＝7.0)配制配制5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DNTB)标准溶液(10mM)，检测时用Tris－HCL缓冲液(0.25M)稀释为DNTB(0.1mM),现配现用，按表1配制相应溶液，每组取200μL加样于96孔板中，每组重复4孔，于412nm处检测吸光度，以RGD％(体积百分比浓度)为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得出回归方程为y＝7.9805x+0.0069，R²＝0.999。将孵育好的适量RGD及DSPE-PEG2000-Mal反应液与DNTB混合，静置10min，取200μL加样于96孔板中，每组重复4孔，于412nm处检测吸光度，将此吸光度带入回归方程，计算未反应的游离RGD％，计算RGD-PEG2000-DSPE偶联率，见表2。偶联率＝(总RGD％-游离RGD％)/(总RGD％-过量RGD％)*100％。

当RGD：DSPE-PEG2000-Mal摩尔比为1.5:1时(RGD过量，原反应摩尔比应为1:1)，偶联率最高，达到100％，即得RGD-PEG2000-DSPE，结构式见式IV。

表1标准曲线配制

表2偶联率测定反应

2.制备RGD-SSL-鳖甲肽

精密称取EPC：Chol：mPEG2000-DSPE(50：25：1，摩尔比)置于茄型瓶中，加入适量氯仿振摇。于40℃水浴，减压旋转蒸干氯仿，真空干燥2h。将含鳖甲肽的PBS缓冲液做为水化液逐滴滴入茄型瓶，旋涡振荡形成脂质体混悬液。将脂质体混悬液于60℃孵育30min。采用MiniExtruder挤出仪挤压，反复通过孔径50nm的聚碳酸酯膜15次，即得SSL-鳖甲肽。采用后插法将适量RGD-PEG2000-DSPE(占EPC 1.2mol％)与空白脂质体55℃孵育1h，即得RGD-SSL-鳖甲肽，见图1，RGD-SSL脂质体主要由脂质双分子层构成，表面含两种PEG链，其中一种为DSPE-PEG2000-RGD，即PEG一端具有RGD环肽，另一种为DSPE-mPEG2000，mPEG2000为甲氧基PEG2000，可避免与蛋白质分子侧链上的活性基团进行反应。脂质体内水相具有包封的鳖甲肽(HGRFG)。

3.表征检测

3.1粒径及多分散系数(PDI)检测

按2.1方法制备空白脂质体，稀释一定倍数后，以激光散射粒径测定仪测定粒径及多分散系数(PDI)。见图2，RGD-SSL的粒径在100nm左右，多分散系数(PdI)较小，均一性较好。

4.脂质体中鳖甲肽含量测定方法的建立

色谱分析条件：Alliance e2695液相色谱仪(Waters公司)，2489UV/Vis Detector，色谱柱为Sunfire-C18(4.6mm×250mm，5μm)，流动相：A为H2O，含0.1％三氟乙酸；B为乙腈，含0.1％三氟乙酸；洗脱条件：等度洗脱，0-6min,88％A，12％B；流速：1.0mL·min^-1；柱温：30℃；检测波长：220nm；进样量：10μL。见图3、4，图3中，最后一个峰测定的物质为HGRFG(6min左右)，峰形较好，分离度高，之前的峰为溶剂峰(乙腈)；图4中，HPLC测定HGRFG的标准曲线结果显示，鳖甲肽浓度与峰高进行线性回归计算后，y＝3437.4x-1627.3，R²为1，显示两者相关性极佳，适合用该回归方程估算未知鳖甲肽浓度。

5.超滤离心法筛选最佳药脂比

按不同药脂比(1：1，1：5，1：10，1：20，1：30)称取鳖甲肽配制成相应的水化液，按2法制备脂质体，EP管中分别加入等量的少量脂质体混悬液，用PBS稀释一定倍数并混匀，各组最终总体积相同。55℃孵育15min，冷水降温。接着将不同药脂比的RGD-SSL-鳖甲肽分别加入超滤离心管(100KD，4mL)在4000g下离心25min。收集滤液，按4建立的方法进行鳖甲肽含量检测，并计算包封率，筛选出最佳药脂比。包封率＝(1-游离药物药量/投药量)*100％。见图5，不同药脂比的包封鳖甲肽的脂质体采用超滤离心法测定包封率后，结果显示，当药脂比为1:5时，包封率达到最高。

6.RGD-DiR-SSL在BALB/c裸鼠中的肝靶向分析

将适量荧光染料DiR同EPC、Chol、DSPE-mPEG2000一起溶于氯仿，按2法制备脂质体，水化液为PBS缓冲液，即得RGD-DiR-SSL。取正常BALB/c裸鼠，用生理盐水适当稀释通过尾静脉注射，24h时间后，用颈椎脱臼法将裸鼠立即处死，取心、肝、脾、肺、肾及脑，用生理盐水洗涤后纱布吸干多余水分，置于35mm平皿中于小动物成像仪中拍摄，用相关软件统计各脏器荧光值。见图6，脂质体尾静脉注射于裸鼠24h后的各脏器的荧光值，提示脂质体的体内分布，当调整color scale设定Max及Min荧光值后，心及脑不含荧光，其余脏器的荧光值如图所示，肝脏的荧光值显著高于其他脏器，提示脂质体具有良好的肝靶向性。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。