复方鳖甲软肝片用于治疗慢性乙型肝炎肝纤维化的用途的制作方法

专利名称：复方鳖甲软肝片用于治疗慢性乙型肝炎肝纤维化的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及中药组合物，特别是一种复方鳖甲软肝片用于治疗慢性乙型肝炎肝纤维化的用途。
慢性乙型肝炎肝纤维化是近年来肝病专业研究的热门课题，根据其临床表现当属中医的积聚病症范畴。积聚之为病，缘于肝病之初起，湿热邪毒伤及肝脾，失治误治，肝脾功能失调，正气渐伤，日久及肾，余邪留恋不净，气结血瘀阻于肝络。肝者主藏血，喜疏泄条达，故为体阴用阳之脏。肝伤即气失条达，肝气郁结；气为血帅，气行则血行，气滞则血瘀，瘀血聚于肋下，则生痞块。肝郁日久化热，耗伤阴血，不能柔养肝络，故胁肋隐痛。肝热羁留故口干且苦。乙癸同源，肝阴亏虚，子盗母气，暗耗肾阴，足少阴经也经过胁肋，故更加重胁肋隐痛之势，并可见面色晦暗，甚则黧黑。脾者与胃同居中州，互为表里，为后天之本。脾主升清，胃主降浊，胃主受纳腐熟，脾主运化转输，为气血化生之源。脾伤则纳化失司，气机升降不利，故可脘腹胀满，纳差便溏，神疲乏力。脾病延久，后天不能补养先天，肾气也虚，故更加重神疲乏力，精力渐衰。赤缕红痣，蛛砂掌，舌质黯或有瘀斑，皆为瘀血之象，舌苔薄黄腻为湿热邪毒未净之征；脉弦细为肝病迁延，本虚标实之象。
综上所述，慢性乙型肝炎肝纤维化的中医病理特点，为湿热邪毒不清，肝脾已伤。故既有热毒、瘀血之邪实一面，又有脾肾气虚及肝肾阴虚在同，因此，是一种本虚标实之证。
本发明的目的是提供一种具有软坚散结、化瘀解毒、益气养阴之功效的复方鳖甲软肝片用于治疗慢性乙型肝炎肝纤维化的用途。
本发明所述复方鳖甲软肝片中药制剂是由下述重量份数的原料组成的鳖甲110-130份赤芍 80-90份当归40-60份三七40-60份 党参 80-90份黄芪80-90份紫河车 40-50份 冬虫夏草 20-30份板蓝根 130-150份连翘130-150份莪术 20-30份本发明所述复方鳖甲软肝片中药制剂考虑到瘀血阻于肝络，宜化瘀通络为要，同时兼顾热毒余邪未清，适应正视肝脾肾三脏之虚，故宜清热解毒、养血柔肝、健脾益气、补肾填精，从而达到攻补兼施，标本兼顾的目的。本中药制剂主治胁肋隐痛或肋下痞块，面色晦黯，脘腹胀满，纳差便溏，神疲乏力，口干且苦，赤缕红痣，蛛砂掌，舌质黯或有瘀斑，舌苔薄黄腻，脉弦细。慢性乙型肝炎肝纤维化患者见上述瘀血阻络，气阴亏虚，热毒未尽证候者均可使用。
其中，所述鳖甲在本方中为君。它味成性平，人肝，肾经，其既可软坚散结，又可滋阴潜阳，故于本病的瘀血凝结、肝肾阴血已伤的证尤为贴切。《本经》谓“主心腹坚积、寒热、去痞、息肉、阴蚀、痔、恶肉”。《本草从新》谓“治厥阴血分之病”。
本方以当归、赤芍、三七三味为臣，以增强养血活血，化瘀散结之力。当归味甘辛性温，功专补血活血，从而养血柔肝，活血祛瘀。赤芍味苦微寒，具有清热凉血，化瘀通络之功，专入肝经，《本经》谓“主邪气腹痛，除血痹破坚积、寒热，止痛，利小便”。三七味甘微苦味温，为散瘀消肿，止血定痛之药。以上三药菜助鳖甲消瘕、去积聚、化痞块的作用，祛邪而不伤正。
本方中所述党参、黄芪健脾益气；所述冬虫夏草、紫河车益肾填精；所述板蓝根、连翘清热解毒，从三个不同方面协助治疗次要证候，是为佐药。党参甘平，补中益气《本草从新》谓“主补中益气和脾胃，除烦渴...中气微弱，用以调补，甚为平妥。”黄芪甘微温，被气升阳，固表托毒；《别录》谓“被丈夫虚损，五劳赢瘦，止渴、腹痛、泻痢、益气、利阴气”。参芪同用，温补脾胃，升提中气，化生气血，即所谓“见肝之病，知肝传脾，当先实脾”之要义。冬虫夏草味甘性平，为补益肺肾之品；《纲目拾遗》谓“性温暖，被精益髓。”紫河车味甘成性温，有补气、养血、益精功效，为血肉有情之品，故凡气血不足、肾精亏损之症皆可服用。此二味对于肝脾俱伤、日久及肾、气血阴精亏虚之体，均可起到益肾柔肝，被肾扶脾的作用。板蓝根味苦性寒，有泻火解毒、消肿散结之功，故为疮家药。《本经》谓“治寒热，鼠瘘，瘰疠，痈肿，恶疮，结热，毒。”二味清热解毒之品，针对热毒末清之象而设。
本方中所述莪术，其性苦辛性温，本品辛散苦泄温通，专入肝经血分，虽能行气祛瘀，散结消瘀之功，然方中本药用量较小，也起到引经报使之能，故为使药。
总之，本发明所述复方鳖甲软肝片中药制剂攻补兼施、标本兼顾，使热毒余邪得以清除，肝脾肾三脏功能得以恢复，现于肝络之瘀血得以消散，达到扶正消症的目的，具有软坚散结、化瘀解毒、益气养阴的功效，有效率为81.67％，治愈率达55.23％。
本复方鳖甲软肝片中药制剂的制备方法包括将鳖甲、三七、赤芍、冬虫夏草、紫河车粉碎成细粉；将当归、莪术、连翘蒸馏提取挥发油，蒸馏后的水溶液待用，将药渣加水煎煮1-2小时，滤过，滤液与上述水溶液合并；将党参、黄芪及板蓝根三味加水煎煮三次，每次1-2小时，合并三次煎液，过滤得滤液；将所有滤液和水溶液合并，离心去杂后，在50℃下减压浓缩至相对密度为1.25-1.30的稠膏状，真空干燥成干浸膏，粉碎成细粉，并与上述鳖甲、三七、赤芍、冬虫夏草、紫河车五味的细粉及辅料适量混匀，制成颗粒并干燥，再加入上述当归、莪术、连翘三味的挥发油，混匀，压制成片即可。
其中，所述鳖甲为制鳖甲，其化学成分含动物胶、角蛋白、碘质和VD等，均不宜长时间加热煎煮，而应粉末入药，其蜂窝状不规则性孔隙的骨组织特有显微结构，可作为与其它药材区别的主要特征，制备时应先对购进的制鳖甲应逐个检查，弃去在运输、贮藏期间所发生霉变、腐臭者，净品置烘箱中于100-110℃烘干备用；所述赤芍为含测药材，主含单萜类有效成分芍药甙的4种衍生物，对肝细胞DNA合成有明显增强作用，对心、肝微粒体有显著诱导作用而利于解毒，还含没食子酸鞣质等成分，但有效成分提得率偏低，粉末入药即可保持有效成分，又利于含量测定，制备时对购进的赤芍饮片，在含量测定符合要求后，先过筛，除去灰屑，再用清水迅速漂洗一次，除去泥沙，净品干燥备用；所述三七为名贵药材，含三七皂甙R1、人参甙Rh1、R2、Rc、Rg1，活血成分特殊氨基酸三七素，16种氨基酸，多种无机元素和生物碱等，一两种溶剂很难将有效成分提尽，故均以粉末入药为宜，制备时对购进的三七先过筛，除去灰屑，再用清水漂洗一次，除去泥沙，净品烘干备用；所述冬虫夏草为名贵药材，主含粗蛋白25.32％，碳水化合物28.9％，脂肪8.4％，粗纤维18.53％，另含Vit B120.29μg/100g等，一两种溶剂很难将其有效成分提尽，故均以粉末入药为宜，制备时先挑出似纤维状的附着物及杂质，然后置烘箱于75-85℃烘干备用；所述紫河车为制紫河车，其成分复杂，含多种抗体、干扰素、β-抑制因子、激素和酶等，不宜用醇或水加热煎煮提取，亦用粉末入药，制备时对购进的制紫河车应逐个检查，弃去腐臭者，净品置高压锅于121℃蒸0.5h，取出烘干备用。经上述前处理后的五味药材按处方量准确称量，混合均匀，粉碎成细粉，粉碎方法为机械粉碎方法，所用的粉碎机为烟台市芝罘制药机械厂生产，它由ZKF-3型自控粉碎机组控制台、WZS3-470型卧式转筛及hF3-200型粉碎机等三个主要部分组成，其工作效率为每小时粉碎20-200kg药材，过筛粒度可在20-400目之间任意调整，实际选用100目筛进行粉碎，由于它属于自动循环式粉碎方式，其出粉率可达95％以上。然后再将细粉用钴-60γ射线辐照灭菌方法，辐照剂量为5kGy，可保证本品卫生学合格。
所述蒸馏提取挥发油的方法为药典甲法(中国药典1990年版一部附录48页)，即按处方量取当归、莪术、连翘混合于烧瓶中，加7-9倍量的水蒸馏1-5小时，所述臣药当归，含挥发油、蒿本内酯、亚丁苯酚、胆碱、阿魏酸和多种氨基酸；使药莪术，含挥发油莪术醇、莪术双酮、酚性成分、有机酸、树脂、淀粉等；佐药连翘，含挥发油、连翘甙4.89％、白桦脂酸、熊果酸、齐墩果酸、连翘酸、连翘脂素、牛蒡子甙等，三味合并加热水(＞80℃，因有皂甙)用水蒸汽蒸馏，收集挥发油的平均得量为0.97ml。制剂中挥发油的加入量即挥发油的提得量；其加入方法为用7-9倍量的76％乙醇溶解挥发油，摇匀后喷洒到干燥颗粒上，密闭35-45分钟。
所述佐药党参，含多糖、皂甙、葡萄糖、蔗糖、9种甾醇成分、17种氨基酸、12种有机酸、14种无机元素等，对神经、免疫、消化系统多种作用；所述佐药黄芪，含黄芪甲甙、21种氨基酸、葡萄糖醛酸、叶酸、14种微量元素、多糖、胆碱等。黄芪甲甙是抗病毒、抗肝毒性损害的有效成分，其多糖和水溶性煎剂有明显的保肝护肝作用；所述佐药板蓝根，含靛甙、蔗糖、精氨酸等7种氨基酸、靛蓝、靛玉红等；三味药加热水煎煮提膏入药较宜。
所述所有滤液和水溶液混合后的浓缩过程是在E1-1型真空浓缩罐(由常熟制药机械厂生产)中进行的，真空度常控制在0.06-0.07MPa，以使液温在50-70℃下蒸发，每小时可蒸发水份60-80升。
所述浓缩稠膏的干燥过程的压力在620-670mmHg，温度为70-80℃，成干浸膏后粉碎成细粉，平均出膏量为10.8kg，平均出膏率为20.6％。
本复方鳖甲软肝片中药制剂的制备方法还可以包括将生药原粉及浸膏粉混匀后，加入蔗糖粉及淀粉，混合据均匀，用乙醇作为润湿剂制成软材，过筛制粒，置烘箱干燥得干燥颗粒。此颗粒的质控参数为1、水分含量3-5％通常为3.5％2、粒度大小14-22目。
3、芍药甙含量每0.5g颗粒含芍药甙不得少于2.1mg。
其中，所述蔗糖粉的加入量为5.5-9.5/药材总重量；淀粉的加入量为1.2/药粉总重量；所述乙醇的浓度为67-71％；所述过筛粒度为16目；所述烘箱温度为75-85℃，干燥时间为1.5-2.5小时。
本复方鳖甲软肝片中药制剂的制备方法还可以包括加入硬脂酸镁，此硬脂酸镁属疏水性润滑辅料，其在工艺中的作用是增加药物在压片过程中的流动性以减少药物颗粒与颗粒之间、颗粒与机械部分之间的摩擦力与粘着力，可在制粒后、压片前加入，加入量为0.25-1％。
所述当归、莪术、连翘三味药挥发油提取方法为取约65g当归、莪术、连翘于1000ml圆底烧瓶中，按中国药典1990年版一部附录48页挥发油测定甲法，加8倍量水中热回流5h进行提取，结果如表1。
表1当归、莪术、连翘挥发油提取结果投料量 挥发油量(ml) 挥发油提取率加水量(g) 1h2h3h4h5h(v/w)64.9228倍0.19 0.26 0.30 0.31 0.32 0.49％64.9958倍0.20 0.27 0.31 0.32 0.32 0.49％64.5708倍0.18 0.25 0.30 0.31 0.31 0.48％
从上述表可以看出，提取时间达3h，其挥发油基本提尽，因此，提取挥发油时间定为3h。
在挥发油提取3h后，分离出水溶液，将药渣经第二煎煮(加7倍量水，煎煮时间1h)，其浸出率锐减，再经第三次煎煮(加7倍量水，煎煮时间为1h)， 其浸出率更低(水溶液相对密度1.0037)，其水溶物具体提取结果见表2。
表2 当归、莪术、连翘水溶物提取结果煎煮次数 加水量 煎煮时间(h) 浸出率(％) 浸出率占合计百分率(％)一 8倍3 11.9 73.5二 7倍1 3.7 22.8三 7倍1 0.6 3.7从表2可以看出，前二次煎煮即已基本提尽当归等三味的水溶物，因此，水溶物提取方法为加水煎煮二次，第一次煎煮时间为3h(加8倍量水)，第二次煎煮时间为1h(加7倍量水)。
为进一步验证复方鳖甲软肝片的抗肝纤维化作用，可以通过动物实验，在以下七个方面观察该药对肝脏病理改变的影响，具体内容及过程如下一、复方鳖甲软肝片抗肝纤维化对阻断肝纤维化形成、溶解或吸收已形成的肝纤维化的作用。
实验动物体重180-200g，因本动物实验周期长达6-8个月；雌性大鼠在发情期及孕哺期机体内分泌系统改变，影响药物疗效的观察，则选用雄性S.D大鼠(中国医学科学院实验动物中心提供)。二级Wistar大鼠质量合格证，证号京动管质字(1994)第032号。
验证药物为华星药厂研制的复方鳖甲软肝片，每片含生药量0.46克。
动物模型制备以35mg/100ml的苯巴比妥钠溶液代替常水，喂饲动物10天；以鼠体重(0.15ul/g体重)增减确定给予四氯化碳量，每周一次，每次最大量不超过250ul；随机分6个组，每组16只大鼠。
(1)、复方鳖甲软肝片0.25g/kg阻断组给CCL4，每日在饲料内加复方鳖甲软肝片0.5g/kg，相当成人4倍(鼠0.25g/kg体重，人0.061g/kg体重)，饮常水。
(2)、复方鳖甲软肝片0.5g/kg阻断组给CCL4，每日在饲料内加复方鳖甲软肝片0.5g/kg，相当成人8倍，饮常水。
(3)、复方鳖甲软肝片0.5g/kg治疗组给CCL4三个月，形成肝纤维化后，每日饲料内加复方鳖甲软肝片0.5g/kg，饮常水。
(4)、肝安干糖浆14.4g/kg组给CCI4，每日在饲料内加肝安干糖浆14.4g/kg，相当成人15倍(鼠14.4g/kg体重，人0.96g/kg体重)。饮常水。肝安干糖浆为支链氨基酸配制而成的干糖浆制剂，含有三种氨基酸，其成份是L-异亮氨酸，L-亮氨酸，L-缬氨酸，其药理作用(1)可增加血中支链氨基酸，改善氨基酸失衡，对肝昏迷有苏醒和预防作用；(2)可促进蛋白质合成，降低蛋白质分解，有利于肝细胞的再生和修复。适用于肝性脑病，肝硬化及慢性活动性肝炎、慢性迁延性肝炎等的治疗和预防，用法每次1袋，每日3次，规格每袋14.5g(24.48％)(每袋含三种氨基酸总量为3.55g)。因该药成分中不含有复方鳖甲软肝片的成分，并获辽宁卫药(88)2263-61号，故选为阳性对照药物。
(5)、四氯化碳模型组给CCL4，喂固体饲料，饮常水。
(6)、正常对照组不给CCL4，每日在饲料内加复方鳖甲软肝片0.5g/kg(按生药量计算)，饮常水。
验证药物的配制将由鳖甲(制)、莪术、三七、黄芪、冬虫夏草等中药经优选工艺提取制成的复方鳖甲软肝片药粉70g(1g药粉相当含生药1.40g)加面粉3000g混匀，加蜂蜜，用压丸机，压出2000丸凉干，每丸含复方鳖甲软肝片生药50mg；晨起喂饲大鼠(喂饲空腹大鼠，因空腹大鼠急于进食，故很快先把药丸吞食，待观察大鼠吃尽丸药后，再给固体饲料，以保证受试药物不受损失)。
验证方法(1)、HE染色(2)、将标本置于10％的中性福尔马林固定液中，固定24小时，石腊包埋，切片厚度为5um，行苦味酸天狼星红一偏振光法将0.5g的天狼星红(Sirius Red F3BA-N，Mobory chemical CO.Vnion N、I)溶于饱和100ml苦味溶液中。切片脱蜡入水，在0.1％苦味酸、天狼星红溶液染1小时，自来水冲洗，经Harris苏木精染核，常规脱水，透明，树胶封片。应用Zeiss偏振光法显微镜观察。
(3)、可溶性胶原的提取及测定；将部分肝切除组织经丙酮脱酯后，用0.5M乙酸浸泡打碎成匀浆，4℃过夜，6000g4℃离心1h，取上清，测A260及A280值，以1.45A280-0.74A260换算成每毫克肝组织的蛋白量，采用Rennard等的ELISA方法，计算出胶原含量。
研证肝纤维化病理分级判定标准按0-6级分级O级肝组织正常，无胶原纤维增生；I级胶原纤维从汇管区或中央静脉周围轻度向外延伸；II级胶原纤维延伸明显，但尚未连接包绕整个肝小叶；III级胶原纤维延伸连接包绕整个肝小叶；IV级胶原纤维包绕分割肝小叶，正常肝小叶结构破坏，假小叶形成，以大方形假小叶为主；V级肝小叶结构完全破坏，假小叶形成，大方形与小圆形假小叶各占50％；VI级肝内布满小圆形假小叶，其间有粗大增生的胶原纤维。
研证结果1、复方鳖甲软肝片对大鼠实验性肝纤维化疗效见表1。
表1，复方鳖甲软肝片对实验性肝纤维化作用肝纤维化程度O级 I级 II级 III级 IV级 V级 VI级总计正常对照组16- - - - - - 16CCL4模型组 - - - - 2 8 3 13肝安干糖浆组 - - 1 3 3 2 1 10复方鳖甲软肝片0.25g/kg阻断组 - 4 2 2 1 2 - 11复方鳖甲软肝片0.5g/kg阻断组 - 3 2 2 1 1 1 10复方鳖甲软肝片0.5g/kg治疗组 - 1 3 2 2 2 1 11表1示各组与CCL4模型组相比P＜0.05；均有抗肝纤维化作用，复方鳖甲软肝片各组与肝安组比亦有差异P＜0.05。
2、苦味酸天狼星红一偏振光法观察结果。
正常肝组织切片经苦味酸天狼星红染色，在偏振光显微镜下中见汇管区及狄氏间隙周围由浅红色I型胶原纤维和绿色III型胶原纤维参半构成。CCL4模型组则粗大红色重迭的I型胶原成束排列，分割、包绕肝小叶。I型胶原明显多于III型胶原；肝安组60％类同CCL4模型组，40％为粗大红色I型胶原纤维束，重叠少，延伸明显，有延伸连接。复方鳖甲软肝片阻断组则为较细的红色I型胶原纤维束，多延伸，少重叠及连接；0.5g/kg治疗组由治疗前粗大红色重叠I型胶原纤维束包绕、分割肝小叶，变成少重叠，分割、多延伸连接的纤维束。
3、苦味酸天狼星红染色电子计算机图象分析表2。
表2，复方鳖甲软肝片对肝脏原纤维的影响I型胶原(红) III型胶原(绿)正常对照组 1.5632±0.04181.8371±0.0524CCL4模型组 41.2371±2.6314 27.0289±1.8217肝安干糖浆组28.4156±2.4726 16.0123±1.2635复方鳖甲软肝片0.25g/kg阻断组6.3261±1.4587 7.0461±1.1352复方鳖甲软肝片0.5g/kg阻断组 8.1365±1.2741 7.8612±1.5036复方鳖甲软肝片0.5g/kg治疗组 18.2248±2.7311 13.4666±2.1223复方鳖甲软肝片治疗前 36.4167±3.6771 23.6223±4.36714、复方鳖甲软肝片对肝组胶原含量的影响见表3。
表3，复方鳖甲软肝片对肝组胶含量的影响用药前胶原量(ug/mg肝脏蛋白) 用药后胶原量(ug/mg肝脏蛋白)I型 III型 I型 III型正常对照组2.783±0.361 2.934±0.214 2.914±0.132 2.973±0.232CCL4模型组 2.573±0.324 2.893±0.502 13.298±2.814 8.112±2.136肝安干糖浆组 2.627±0.296 2.741±0.223 8.734±1.431 5.542±2.103复方鳖甲软肝片0.25g/Kg阻断组 2.714±0.326 2.684±0.367 5.326±1.418 6.924±1.857复方鳖甲软肝片0.5g/kg阻断组 2.688±0.217 2.789±0.418 6.134±1.211 6.642±2.114复方鳖甲软肝片0.5g/kg治疗组 12.378±3.251 8.892±2.146 8.394±1.922 7.301±2.462表3示CCL4模型组与各组相比，I、III型胶原量均显著增高(P＜0.01)，各组相比复方鳖甲软肝片优于肝安(P＜0.05)；复方鳖甲软肝片阻断组优于治疗组(P＜0.05)。
以上研究结果进一步证实复方鳖甲软肝片对CCL4，损伤性肝纤维化有明确的抗肝纤维化作用。阻断组在肝纤维化尚未完全形成即给药，6个月后发现复方鳖甲软肝片0.25g/kg、0.5g/kg阻断组中I-III级纤维化程度分别占72.72％和70％，表明肝纤维化程度明显减轻，这种阻断肝纤维化发展的作用明显强于肝安组(P＜0.05)。治疗组在肝纤维化完全形成后，再投药治疗3个月后，发现I-III级纤维化程度占54.54％，较模型组纤维化程度明显轻。提示复方鳖甲软肝片既有抗肝纤维作用，又有溶解或吸收已形成的肝纤维作用。
苦味酸天狼星红一偏振光法观察结果表明，CCL4模型组因粗大I型胶原纤维束张力强，重叠、延伸、连接，封闭内皮细胞间的“窗”，导致血窦的“毛细管化”，而破坏肝脏的正常组织结构，使Disse腔中胶原过多沉积，造成肝组织中胶原量异常增多，改变胶原I/III值见(表2，3)，形成肝纤维化或肝硬变。复方鳖甲软肝片增强肝脏的胶原酶活力，促进胶原纤维束的溶解，阻断了血窦的“毛细管化”，使Disse腔中不能沉积大量胶原，维持肝脏结构完整，I型胶原含量增高不显，使I/III胶原值处于相对正常，从而阻断肝纤维化的形成，溶解或吸收已形成的肝纤维化。
总之，复方鳖甲软肝片抗肝纤维化的疗效是肯定的，具有阻断肝纤维化形成，溶解或吸收已形成的肝纤维化的作用。
二、复方鳖甲软肝片对储脂细胞I、III型胶原mRNA表达的影响肝纤维化特点是Disse腔中大量胶原蛋白沉积，使血窦“毛细管化”。目前认为贮脂细胞(Fat-Storicg Cells；FSCs)是Disse腔中胶原蛋白的主要来源。为弄清复方鳖甲软肝片抗纤维化的作用及其机理，本实验在CCL4损伤性纤维化中，研究复方鳖甲软肝片对FSCs I、III型胶原mRNA表达的影响。
实验动物体重180-200g，因本动物实验周期长达6-8个月；雌性大鼠在发情期及孕哺期机体内分泌系统改变，影响药物疗效的观察，则选用雄性S.D大鼠(中国医学科学院实验动物中心提供)。二级Wistar大鼠质量合格证，证号京动管质字(1994)第032号。
研证药材为华星药厂研制的复方鳖甲软肝片，每片含生药量0.46克。
动物模型制备(1)、以35mg/100ml的苯巴比妥钠溶液代替常水，喂饲动物10天。(2)、以鼠体重(0.15ul/g体重)增减确定给予四氯化碳量，每周一次，每次最大量不超过250ul。
随机分6个组，每组16只大鼠。
(1)、复方鳖甲软肝片0.25g/kg阻断组给CCL4，每日在饲料内加复方鳖甲软肝片0.25g/kg，相当成人4倍(鼠0.25g/kg体重，人0.061g/kg体重)，饮常水。
(2)、复方鳖甲软肝片0.5g/kg阻断组给CCL4，每日在饲料内加复方鳖甲软肝片0.5g/kg，相当成人8倍，饮常水。
(3)、复方鳖甲软肝片0.5g/kg治疗组给CCL4三个月，形成肝纤维化后，每日饲料同加复方鳖甲软肝片0.5g/kg，饮常水。
(4)、肝安干糖浆14.4g/kg组给CCI4，每日在饲料内加肝安干糖浆14.4g/kg，相当成人15倍(鼠14.4g/kg体重，人0.96g/kg体重)。饮常水。肝安干糖浆为支链氨基酸配制而成的干糖浆制剂，含有三种氨基酸，其成份是L-异亮氨酸，L-亮氨酸，L-缬氨酸，其药理作用1、可增加血中支链氨基酸，改善氨基酸失衡，对肝错迷有苏醒和预防作用。2、可促进蛋白质合成，降低蛋白质分解，有利于肝细胞的再生和修复。适用于肝性脑病，肝硬化及慢性活动性肝炎，慢性迁延性肝炎等的治疗和预防，用法每次1袋，每日3次，规格每袋14.5g(24.48％)(每袋含三种氨基酸总量为3.55g)。因该药成分中不含有复方鳖甲软肝片的成分，并获辽宁卫药(88)2263-61号，故选为阳性对照药物。
(5)、四氯化碳模型组给CCL4，喂固本饲料，饮常水。
(6)、正常对照组不给CCL4，每日在饲料内加复方鳖甲软肝片0.5g/kg(按生药量计算)，饮常水。
验证药物的配制将复方鳖甲软肝片药粉70g(1g药粉相当含生药1.40g)加面粉3000g混匀，加蜂蜜，用压丸机，压出2000丸凉干，每丸含复方鳖甲软肝片生药50mg；晨起喂饲大鼠(喂饲空腹大鼠，因空腹大鼠急于进食，故很快先把药丸吞食，待观察大鼠吃尽丸药后，再给固体饲料，以保证受试药物不受损失)。
验证方法1、FSCs纯化分离阻断组治疗6个月，治疗组投药3个月。动物在0.3％戊巴比妥钠麻醉下，剖腹，门静脉插管，按Friedman等分离FSCs的方法，分离，纯化FSCs，将获得纯度95％以上的FSCs。
2、核酸探针及地高标记α2(I)cDNA、α1(III)cDNA及GAP cDNA由中国预防医学中心劳动卫生与职业病研究所惠赠。按Dig-DNA Labeling and Detecteon kit(Boehringer Mannheim)说明书标记探针。标记的探针浓度为52ng/ul。
3、DNA-RNA斑点杂交用异硫酸胍法提取FSCs中总RNA。RNA纯度OD260/OD280为1.8。将变性处理的RNA以10xSSC PH7.0，等浓度稀释后，点样于NC膜上，按Sambrook等方法杂交，洗膜，最后按Dig-DNA Labeing and Detection kit方法，免疫显色。
4、核酸原位杂交①、组织切片制备新鲜肝组织经液氮速冻，恒冷冰冻连续切片，分别贴附于-氨丙基三乙氧硅烷(3-Amino Proyl-Triethoxysilane，APES)处理的载玻片上，4％多聚甲醛固定20min，PBS浸洗后逐级乙醇脱水。
②、杂交前预处理0.03％H2O2(甲醇)浸20min，PBS浸洗后乙醇脱水，5mM MgCL210m in，0.2NHCL20min，2xSSC-5mM EDTA50℃30min，蛋白酶水解(1ug/ml)-PBSPH7.4，37℃15min；0.5％甘氨酸(PBS PH7.4)10min；4％多聚甲醛固定30min，5mMMgCL2浸洗15min。
③、预杂交滴加预杂交液(5xDenbardt’s液2ml，葡聚糖硫酸0.5；血清DNA 5mg，tRNA2.5mg，甲酰胺5ml，4xssc 3ml)200ul，4℃孵育20min。
④、杂交用预杂交液稀释α1(III)及GAP Dig-CDNA为35pg/ul，65℃热变性，退火，42℃过夜。
⑤、杂交后处理6xssc-45％甲酰胺浸洗30min。2xssc浸洗30min，按Dig-DNALabeling and Detection kit说明，行免疫显色，苏木素10秒，漂洗、脱色、透明、封胶固定。
验证结果1、斑点杂交结果各组动物FSCs提取的总RNA经甲醛变性后，以5ug点样于NC模上与Dig-α1(III)cDNA，Dig-α2(I)cDNA及Dig-GAP cDNA作，斑点密度扫描统计见表1。表1，复方鳖甲软肝片对FSCsα2(I)、α1(III)mRNA水平的影响mRNA水平 (X±S)n6 α2(I) α1(III)GAP正常对照组 6 1.3382±0.24931.6531±0.4062.1236±0.6247CCL4模型组 6 23.4988±3.2864 17.0025±4.8634 3.2114±0.912240.25g/kg阻断组 6 4.3101±1.12574.8642±0.8796 2.6831±0.42210.5g/kg阻断组6 4.6432±0.91365.2831±1.2333 2.8937±0.89220.5g/kg治疗组6 11.2431±2.6753 7.4323±2.11896 2.1432± 0.9128肝安干糖浆组 6 16.1823±3.5896 8.4932±3.0241 3.3812±1.1241表1示CCL4模型组与各组相比，无论α2(I)或α1(III)mRNA水平显著差异(p＜0.05)；复方鳖甲软肝片与肝安组相比，均有显著差异(p＜0.05)，各组GAPmRNA水平均有相比，差异不显著(p＞0.05)。
2、原位杂交结果各组动物肝冰冻切片分别与Dig-α2(I)cDNA、Dig-α1(III)cDNA及Dig-GAPcDNA探针进行原位杂交，且CCL4模型汇管区α1(III)mRNA、α2(I)mRNA比正常对照明显增高，以α2(I)mRNA显著增高为特点，杂交颗粒主要集中于Disse腔周壁的间质细胞浆内或核周围。不同动物组间杂交颗粒密度有一定差异。
FSCs是近年来日益受到重视的一种肝脏非实质细胞，在肝纤维化形成和发展中起重要作用。多数学者利用该细胞进行抗肝纤维化机理的研究。
本文目的是观察复方鳖甲软肝片对CCL4损伤性肝纤维化中、FSCs α2(I)及α1(III)mRNA表达的影响。在CCL4模型中，斑点杂交表明α2(I)mRNA的表达水平比正常对照显著增高，尤其是α2(I)mRNA表达水平增高17.56倍(P＜0.01)，说明肝纤维化时FSCs中I型胶原mRNA过量表达，这结果与已有报道一致。
原位杂交表明CCL4模型组α2(I)mRNA水平及α1(III)mRNA过量表达，以α2(I)mRNA为突出，且不同组间杂交颗粒密度有一定差异。提示转录水平的差异性。我们过去的研究已证明复方鳖甲软肝片确有抗肝纤维化作用，促进胶原酶活力增强，溶解或吸收已形成的肝纤维化；抑制FSCs增殖和胶原蛋白的合成，阻断肝纤维化的形成。本研究进一步表明复方鳖甲软肝片对FSCs α2(I)mRNA的表达有较强的抑制作用，与CCL4模型组比较，复方鳖甲软肝片阻断组α2(I)mRNA水平分别降低了81.7％和80.3％(P＜0.01)；而复方鳖甲软肝片治疗组则降低了52.2％(P＜0.05)。提示在肝纤维化形成阶段，复方鳖甲软肝片可能有效地抑制FSCsα2(I)mRNA的高水平表达，对已形成肝纤维化的α2(I)mRNA高水平表达有一定程度的抑制作用。
总之，复方鳖甲软肝片具有抵制FSC α2(I)mRNA高水平表达，减少I型胶原的过量合成，阻断纤维化的发展的功效。
三、中药复方鳖甲软肝片对贮脂细胞增殖及合成胶原蛋白的影响肝纤维化是以Disse腔中大量胶原蛋白沉积为特点的，目前认为贮脂细胞(Fat-St oring Cells；FSCs)是Disse腔中胶原蛋白的主要来源，故应观察复方鳖甲软肝片对FSCs增殖及合成胶原蛋白的影响。
实验动物体重180-200g，因本动物实验周期长达6-8个月；雌性大鼠在发情期及孕哺期机体内分泌系统改变，影响药物疗效的观察，则选用雄性S.D大鼠(中国医学科学院实验动物中心提供)。二级Wistar大鼠质量合格证，证号京动管质字(1994)第032号。
验证药材为华星药厂研制的复方鳖甲软肝片，每片含生药量0.46克。
动物模型制备以35mg/100ml的苯巴比妥钠溶液代替常水，喂饲动物10天；以鼠体重(0.15μl/g体重)增减确定给予四氯化碳量，每周一次，每次最大量不超过250μl。
随机分6个组，每组16只大鼠。
(1)、复方鳖甲软肝片0.25g/kg阻断组给CCL4，每日在饲料内加复方鳖甲软肝片0.5g/kg，相当成人4倍(鼠0.25g/kg体重，人0.061g/kg体重)，饮常水。
(2)、复方鳖甲软肝片0.5g/kg阻断组给CCL4，每日在饲料内加复方鳖甲软肝片0.5g/kg，相当成人8倍，饮常水。
(3)、复方鳖甲软肝片0.5g/kg治疗组给CCL4三个月，形成肝纤维化后，每日饲料同加复方鳖甲软肝片0.5g/kg，饮常水。
(4)、肝安干糖浆14.4g/kg组给CCI4，每日在饲料内加肝安干糖浆14.4g/kg，相当成人15倍(鼠14.4g/kg体重，人0.96g/kg体重)。饮常水。肝安干糖浆为支链氨基酸配制而成的干糖浆制剂，含有三种氨基酸，其成份是L-异亮氨酸，L-亮氨酸，L-缬氨酸，其药理作用1可增加血中支链氨基酸，改善氨基酸失衡，对肝错迷有苏醒和预防作用。2可促进蛋白质合成，降低蛋白质分解，有利于肝细胞的再生和修复。适用于肝性脑病，肝硬化及慢性活动性肝炎，慢性迁延性肝炎等的治疗和预防，用法每次1袋，每日3次，规格每袋14.5g(24.48％)(每袋含三种氨基酸总量为3.55g)。因该药成分中不含有复方鳖甲软肝片的成分，并获辽宁卫药(88)2263-61号，故选为阳性对照药物。
(5)、四氯化碳模型组给CCL4，喂固本饲料，饮常水。
(6)、正常对照组不给CCL4，每日在饲料内加复方鳖甲软肝片0.5g/kg(按生药量计算)，饮常水。
验证药物的配制将复方鳖甲软肝片药粉70g(1g药粉相当含生药1.40g)加面粉3000g混匀，加蜂蜜，用压丸机，压出2000丸凉干，每丸含复方鳖甲软肝片生药50mg；晨起喂饲大鼠(喂饲空腹大鼠，因空腹大鼠急于进食，故很快先把药丸吞食，待观察大鼠吃尽丸药后，再给固体饲料，以保证受试药物不受损失)。
验证方法阻断组治疗6个月，治疗组投药3个月后，部分动物在0.3％戊巴比妥钠麻醉下，剖腹，门静脉插管，按Friedman等分离FSC的方法，分离，纯化FSC，将获得纯度95％以上的FSCs，悬浮于199完全培养基中，以1×106cells/ml，接种在35mm培养板中，每孔1.5ml，置36.5℃，湿度96％，5％CO2的培养箱中行原代培养，按时换液。FSCs特点是在光镜下胞浆有大量脂滴，紫外光328nm照射下，细胞呈兰绿色自发光，Desmin染色阳性。
1、贮脂细胞增殖的测定利用3H-胸腺嘧啶脱氧核苷(3H-TdR，原子能研究院产品)掺入量，测定FSCs增殖程度。FSCs原代培养48小时后，脉冲加入3H-TdR(1.0μci/ml)培养18小时，终止掺入，将FSCs转移到醋酸纤维膜上，用β-液烁测cpm，以cpm/well表示DNA复制。
2、脯氨酸及羟脯氨酸的测定利用3H-脯氨酸(3H-Pro，原子能研究院产品)3H羟脯氨酸(3H-HPro)分别掺入胶原和非胶原蛋白的合成过程，观察胶原与非胶原合成情况，将FSCs原代培养48小时后，脉冲加入3H-Hpro(10.0μci/ml)培养18小时，终止掺入。收集培养液和细胞。用10％TCA沉淀蛋白质。采用Rojkind以等方法分离3H-Rro及3H-HPro，经β-液闪测cpm；用Cesoar方法测每孔细胞中DNA量。以cpm/μgDNA和cpm/well表示3H-HPro不同水平的掺入量。
数据处理采用t检验，--上述所有数据均为三复数平均数。
1、复方鳖甲软肝片对FSCs增殖的影响CCL4模型组与各组相比，FSCs增殖明显增高(P＜0.01)；各组间相比，复方鳖甲软肝片0.25g/kg及0.5g/kg阻断组对FSCs抑制程度明显，分别降低了87.5％和88.4％(P＜0.01)；而复方鳖甲软肝片0.5g/kg治疗组仅降低了52.2％(P＜0.05)。
2、复方鳖甲软肝片对FSCs合成胶原的影响见表1。
表1 复方鳖甲软肝片对FSCs合成胶原的影响胶原量X+S(X104cpm/μgDNA) X±S(X103cpm/well)CCL4模型组(N＝4) 8.2556±1.94312.1365±1.2637复方鳖甲软肝片0.5g/kg治疗组(n＝4) 4.2824±1.36104 6.2688±0.96746肝安干糖浆组(n＝4) 4.2632±1.5109 4.8921±0.6125正常对照组(n＝4)2.007±1.00432.9215±0.1123复方鳖甲软肝片0.25g/kg阻断组(n＝4) 3.5501±0.9639 2.634±0.2213复方鳖甲软肝片0.5g/kg阻断组(n＝4) 3.7706±1.2367 2.2468±0.2825表1示CCL4模型组与各组相比，FSCs合成胶原能力明显增强(P＜0.05)；各组相比复方鳖甲软肝片0.25g/kg和0.5g/kg阻断组FSCs合成胶原能力降低2.235和2.189倍(P＜0.01)，而复方鳖甲软肝片0.5g/kg治疗组及肝安组分别高于阻断组1.206和1.316倍(P＜0.05)。
3、复方鳖甲软肝片对FSCs合成非胶原蛋白影响见表2。
表2 复方鳖甲软肝片对FSCs合成非胶原蛋白的影响非胶原量X+S(X104cpm/μgDNA) X±S(X103cpm/well)CCL4模型组(N＝4) 8.9429±0.51745.2905±0.6814复方鳖甲软肝片0.5g/kg治疗组(n＝4) 3.61413±0.9628 5.2905±0.6814肝安干糖浆组(n＝4) 4.6732±1.02454.8921±0.8632正常对照组(n＝4)3.1632±1.12874.6042±1.2175复方鳖甲软肝片0.25g/kg阻断组(n＝4) 3.7591±1.33032.2907±0.4728复方鳖甲软肝片0.5g/kg阻断组(n＝4) 3.61413±1.36104 2.15356±0.2216
表2示CCL4模型组与各组相比，FSCs合成非胶原蛋白能力明显增强(P＜0.05)；各组间相比复方鳖甲软肝片阻断组FSCs合成非胶原蛋白能力明显降低(P＜0.05)。
本实验结果表明各不同组对FSCs增殖的影响各不同，以复方鳖甲软肝片阻断组的抑制作用最强，而肝安组及复方鳖甲软肝片治疗组较弱；对正常对照组没有表现出抑制或促进作用。这种对FSCs的增殖影响的不同，提示复方鳖甲软肝片对暂时性活化的FSCs增殖抑制较强，即对肝纤维化形成初期的抑制作用较强，对持久性活化的FSCs增殖抑制较弱，则对已形成的肝纤维化的抑制作用较弱。
我们在cpm/μgDNA及cpm/well二个不同水平来反映各组对FSCs合成胶原蛋白的不同影响作用，即对单个FSCs合成胶原蛋白的影响及对FSCs总体合成胶原蛋白总量的影响证实，复方鳖甲软肝片阻断组对FSCs合成胶原及非胶原蛋白有较强的抑制作用；肝安组及复方鳖甲软肝片治疗组的抑制作用较弱，且复方鳖甲软肝片0.5g/kg治疗组在cpm/μgDNA及cpm/well二个水平上表现不一致的作用见(表1)。因该中药对已形成肝纤维化的FSCs增殖抑制较弱，尽管可减少cpm/μgDNA水平FSCs合成胶原量，但是FSCs总数没有明显减少，使cpm/well水平胶原合成总量增高。
总之，本实验证实了复方鳖甲软肝片确有抗肝纤维化作用，主要对肝纤维化形成早期阶段、抑制FSCs增殖、减少胶原蛋白的合成、降低胶原蛋白在Disse腔过量沉积、对已形成的肝纤维化亦有一定的改善作用，是值得推广，进一步加以验证。
四、复方鳖甲软肝片对胶原代谢的影响实验实验动物体重180-200g，因本动物实验周期长达6-8个月；雌性大鼠在发情期及孕哺期机体内分泌系统改变，影响药物疗效的观察，则选用雄性S.D大鼠(中国医学科学院实验动物中心提供)。二级Wistar大鼠质量合格证，证号京动管质字(1994)第032号。
验证药材为华星药厂研制的复方鳖甲软肝片，每片含生药量0.46克。
动物模型制备以35mg/100ml的苯巴比妥钠溶液代替常水，喂饲动物10天；以鼠体重(0.15μl/g体重)增减确定给予四氯化碳量，每周一次，每次最大量不超过250μl。
随机分6个组，每组16只大鼠。
(1)、复方鳖甲软肝片0.25g/kg阻断组给CCL4，每日在饲料内加复方鳖甲软肝片0.25g/kg，相当成人4倍(鼠0.25g/kg体重，人0.061g/kg体重)，饮常水。
(2)、复方鳖甲软肝片0.5g/kg阻断组给CCL4，每日在饲料内加复方鳖甲软肝片0.5g/kg，相当成人8倍，饮常水。
(3)、复方鳖甲软肝片0.5g/kg治疗组给CCL4三个月，形成肝纤维化后，每日饲料同加复方鳖甲软肝片0.5g/kg，饮常水。
(4)、肝安干糖浆14.4g/kg组给CCI4，每日在饲料内加肝安干糖浆14.4g/kg，相当成人15倍(鼠14.4g/kg体重，人0.96g/kg体重)。饮常水。肝安干糖浆为支链氨基酸配制而成的干糖浆制剂，含有三种氨基酸，其成份是L-异亮氨酸，L-亮氨酸，L-缬氨酸，其药理作用1、可增加血中支链氨基酸，改善氨基酸失衡，对肝错迷有苏醒和预防作用。2、可促进蛋白质合成，降低蛋白质分解，有利于肝细胞的再生和修复。适用于肝性脑病，肝硬化及慢性活动性肝炎，慢性迁延性肝炎等的治疗和预防，用法每次1袋，每日3次，规格每袋14.5g(24.48％)(每袋含三种氨基酸总量为3.55g)。因该药成分中不含有复方鳖甲软肝片的成分，并获辽宁卫药(88)2263-61号，故选为阳性对照药物。
(5)、四氯化碳模型组给CCL4，喂固本饲料，饮常水。
(6)、正常对照组不给CCL4，每日在饲料内加复方鳖甲软肝片0.5g/kg(按生药量计算)，饮常水。
验证药物的配制将复方鳖甲软肝片药粉70g(1g药粉相当含生药1.40g)加面粉3000g混匀，加蜂蜜，用压丸机，压出2000丸。
检测指标中药治疗前后均分别采血，同时剖腹行部分肝切除。分离血清，-20℃保存，做如下指标的测定血清中I、III型胶原水平，胶原酶活力及计算I/III型胶原值；肝组织中I、III型胶原含量，胶原酶活力及计算I/III型胶原值。
实验方法(1)、血清胶原测定采用Rennard等的ELISA方法。I、III型多克隆抗体(中国预防医学科学院劳动卫生与职业研究所提供)。
(2)、肝组织胶原测定将肝组织37℃烤干，称取等量肝组织，0.5m醋酸抽提，6000g，4℃离心一小时，取上清，测A260及A280值，以1.45A260-0.74A260，得出蛋白量，据ELISA法测出I、III型胶原量，即可得出每毫克肝组织蛋白中胶原的含量。
(3)、胶原酶活力测定采用胡柴玲等方法，略做改进。
a、纯化胶原酶(Sigma)用SepharexG-200(Sigma)层析，在278nm消光系数为1.76，分子量为80-90KD。
b、制备胶原酶底物用NaB3H4(Boston)标记鼠尾胶，制成3H-鼠尾胶，用0.05MTris-0.05MCaCL2缓冲液稀释底物至0.2％。
c、胶原酶测定取肝悬液(1mg湿肝/ml)及血清各100μl，加0.1％胰蛋白酶10μl，37℃孵育100min，加5mM马来亚基酰胺100μl加3H-鼠尾胶1ml，37℃孵育20小时，用0.5％BSA及2％TcA沉淀鼠尾胶，4℃放置30min，15600g，4℃离心30min，上清液移入5ml闪烁瓶中，行β-液闪烁计数。全部实验数据采用3复数均数。
验证结果
1、复方鳖甲软肝片对血清I、III型胶原改变的影响见表1。
表1，复方鳖甲软肝片对血清I、III型胶原的影响I型胶原量(ng/ml) III型胶原量(ng/ml)用药前用药后 用药前 用药后CCL4模型组(N＝11) 92.7±21.6 314.6±53.4△△ 118.26±33.6 168.5±42.6正常对照组(N＝11) 112.6±26.3 108.4±14.8**136.43±26.5 142.5±28.4肝安干糖浆组(N＝11) 101.3±32.4 246.4±46.1△△ 132.22±41.7 148.2±36.2复方鳖甲软肝片0.25g/kg阻断组(N＝11) 232.4±28.6 189.7±26.2△* 153.30±18.7 160.3±45.3复方鳖甲软肝片0.5g/kg阻断组(N＝11) 108.7±29.3 139.6±23.7**128.45±28.4 136.6±24.1复方鳖甲软肝片0.5g/kg治疗阻(N＝11) 116.8±13.4 141.3±32.6 133.68±31.7 128.7±24.8△用药前后相比P＜0.05，△△P＜0.01，*与CCL4模型组相比P＜0.05，**P＜0.01表1示复方鳖甲软肝片0.25g/kg、0.5g/kg阻断组与CCL4模型组相比I型胶原分别减少55.6％和55.1％(P＜0.01)；肝安组及模型组I型胶原分别高于治疗前2.4和3.4倍(P＜0.01)；0.5g/kg治疗组反减少40％(P＜0.05)。对III型胶原无显著改变。
2、复方鳖甲软肝片对肝组织I、III型胶原的影响见表2。
表2，复方鳖甲软肝片对肝组织I、III型胶原影响I型胶原量(μg/mg肝脏蛋白) III型胶原量(μg/mg肝脏蛋白)用药前 用药后 用药前用药后CCL4模型组(N＝11) 2.573±0.324 13.298±2.814 2.893±0.502 8.112±2.136正常对照组(N＝11) 2.783±0.361 2.914±0.1322.934±0.214 2.973±0.232肝安干糖浆组(N＝11) 2.627±0.296 8.734±1.4312.741±0.223 5.542±2.103复方鳖甲软肝片0.25g/kg阻断组(N＝11) 2.714±0.326 5. 326±1.418 2.684±0.367 6.924±1.857复方鳖甲软肝片0.5g/kg阻断组(N＝11) 2.688±0.217 6.134±1.2112.789± 0.418 6.642±2.114复方鳖甲软肝片0.5g/kg治疗阻(N＝11) 12.378±3.251 8.394±1.9228.892±2.146 7.301±2.462表2示肝安组，CCL4模型I型胶原量显著增高，分别为用药前3.39和5.17倍(P＜0.01)，复方鳖甲软肝片0.5g/kg治疗组减少32.2％；与CCL4模型组相比0.5g/kg治疗组，0.25g/kg及0.5g/kg阻断组分别减少36.9％、59.95％和53.9(P＜0.05)。III型胶原略增高，与模型组相比无差异。
3、复方鳖甲软肝片对血清及肝组织中I/III型胶原值的影响见表3。
表3，复方鳖甲软肝片对血清及肝组织中I/III型胶原值的影响血清中胶原I/III值肝组织中胶原I/III值动物数治疗前治疗后 动物数 用药前用药后CCL4模型组11 0.784±0.156 1.879±0.3256 0.899±0.635 1.728±0.324正常对照组 11 0.825±0.211 0.806±0.1726 0.969±0.207 0.951±0.316肝安干糖浆组 11 0.776±0.189 1.682±0.3486 1.045±0.421 1.623±0.214复方鳖甲软肝片0.25g/kg阻断组 11 1.523±0.231 1.217±0.1856 1.392±0.146 1.309±0.317复方鳖甲软肝片0.5g/kg阻断组11 0.846±0.178 1.022±0.2566 0.886±0.312 1.047±0.236复方鳖甲软肝片0.5g/kg治疗阻11 0.874±0.216 1.089±0.2466 0.924±0.218 1.134±0.223表3示肝安组及CCL4模型组明显高于治疗前，大于1.5(P＜0.05)；0.5g/kg治疗组与CCL4模型组相比可降低胶原I/III值；余者均小于1.5(P＜0.05)。
4、复方鳖甲软肝片对肝组织胶原酶活力的影响见表4。
表4、复方鳖甲软肝片对肝组织胶原酶活力的影响胶原酶活力(IU/mg湿肝)动物数 用药前 用药后CCL4模型组 924.5±1.22 13.9±0.31正常对照组 11 23.7±0.41 25.4±0.23肝安干糖浆组11 26.0±1.91 20.7±0.4复方鳖甲软肝片0.25g/kg阻断组12 16.3±0.72 24.7±0.34复方鳖甲软肝片0.5g/kg阻断组 12 24.7±0.51 49.3±1.23复方鳖甲软肝片0.5g/kg治疗阻 922.4±0.32 43.5±1.71表4示治疗后复方鳖甲软肝片0.25g/kg及0.5g/kg阻断组胶原酶活力增高101.2％和94.2％(P＜0.01)；10.5g/kg治疗组增高51.5％(P＜0.05)，而CCL4模型组及肝安组分别降低43.3％(P＜0.01)和20.4％(P＜0.05)。
关于复方鳖甲软肝片的药效学研究已证明，该药可减轻肝组织内炎症反应和肝细胞坏死，抑制纤维增生，本实验结果进一步表明，复方鳖甲软肝片对CCL4损伤性肝纤维化有明确的抗肝纤维作用。其中，阻断组系肝纤维化尚未完全形成，即给中药治疗6个月，发现肝组织、血清中胶原含量没有明显增高，尤以I型胶原没有增高为特点，使血清、肝组织中胶原I/III值在1上下；而治疗组是在肝纤维化完全形成后给药治疗3上月发现肝组织及血清中胶原量较治疗前或模型组有不同程度的降低，且主要是促进I型胶原的降低，使胶原I/III值由治疗前1.392和1.523降为1.309和1.217；使I/III值没有大于1.5，说明复方鳖甲软肝片不仅可使纤维化形成减少，也可使形成肝纤维化溶解吸收，从而起到抗纤维化作用。
复方鳖甲软肝片抗肝纤维作用机理，一方面是保护肝细胞，减轻炎症反应，而抑制胶原增生；另一方面影响胶原代谢，主要在肝纤维化形成阶段，增强胶原酶活力，促使新增生胶原降解，尤其是粗胶原纤维，即I型胶原的降解；同时可抑制贮脂细胞增殖及胶原蛋白合成，减少I型胶原mRNA量，从而抑制胶原增生，使肝组织和血清中I/III值处于正常范围内，阻断、延缓肝纤维化形成。
本实验表明血清和肝组织原水平有较好的一致性，提示血清胶原水平及I/III值变化可间接反映肝组织中的改变。
总之，复方鳖甲软肝片对肝纤维化形成阶段的胶原代谢有显著的影响作用，对已形成的纤维化有溶解、吸收作用。阻断、延缓肝纤维化的发展，因而有较好的抗纤维化作用。
五、复方鳖甲软肝片对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响实验采用生化免疫方法，观察该药对小鼠腹腔巨噬细胞特异吞噬功能作用的影响。巨噬细胞是体内具有吞噬、杀菌、抗肿瘤、抗原提呈及辅佐免疫功能的细胞，测定巨噬细胞特异吞噬功能是研究药物对机体免疫系统影响的重要指标之一。
实验材料1、昆明种小鼠，雌雄各半，体重18-20g，由中国医学科学院实验动物中心提供，三级KM小鼠质量合格证，证号京动管质字(1994)第029号。
2、5％鸡红细胞(CRBC)用肝素抗凝法采集一份一年龄以内公鸡血，置四份(V/V)的阿氏液中、4℃冰箱存放备用，最好用新鲜悬液。
3、复方鳖甲软肝片由华星制药厂提供，每片含生药0.46g。
4、Hank′s液NaCI 8.000gNa2HPO4.12H200.134gKCI 0.400gKH2PO40.060gCaCI20.140gNaHCO20.350gMgSO4.7H20 0.200gGIucose 1.000g溶于1000ml双蒸水中。
5、阿氏液
无水葡萄糖 2.05gNacl0.42g柠檬酸钠(Na3C6H5O7) 0.80g溶于100ml双蒸水中。
6、1/15M磷酸缓冲液7、肝素液浓度为500μ/ml验证方法(1)、实验小白鼠分为两组，正常对照组和复方鳖甲软肝片治疗组。
(2)、将复方鳖甲软肝片碾成细粉，用注射水配成混悬液，浓度为0.2g/ml，对治疗组小鼠灌胃，给药剂量为5g/kg/d，每天1次，连续给药7天。
(3)、实验前吸取CRBC储存液1ml，加Hank′s至5ml，离心(1000转/分，5′)去除红细胞外的有形成份。通常洗两次。第二次离心2000转5′，以细胞压积方法计算，(用Hank，s稀释成5％V/V即为CRBC悬液)。
(4)、将配好的CRBC悬液0.3ml注入小鼠腹腔，2.5-3小时后脱颈处死，消毒后剪开腹部皮肤，经腹膜注入Hank′s液2-3ml，轻揉动物腹部，使之充分洗涮腹腔内的巨噬细胞，然后自腹部中央剪一小孔，用滴管吸取腹腔细胞液约2ml(尽量多吸)，于刻度离心管中，离心1000转，5′，弃去上清液，然后再加Hank′s(或生理盐水)2ml混匀滴片。
(5)、每鼠滴片两张，每片滴悬液不少于0.5ml(以免巨噬细胞数量不足)，在37℃培养箱温育30-50，蒸馏水冲洗玻片细胞滴液，保留玻片贴壁细胞。
(6)、待玻片风干，以甲醇固定5′，选用姬姆萨稀释液(磷酸缓冲液与染液10∶1)，边染边在镜下观察，一般20′左右。
(7)、在蒸馏水冲洗下分化数秒种，滤纸吸干多余染液，镜下观察染色程度，兰色表示分化不够，再用蒸馏水冲洗，待细胞核镜下呈紫色为宜。
(8)、标本完全凉干后，用二甲苯透明十几秒钟，立刻用加拿大树胶封片。
(9)、镜下看染色标本。
(10)、计算巨噬细胞吞噬率和吞噬指数。
实验结果观察复方鳖甲软肝片对小鼠腹腔巨噬细胞特异吞噬功能的影响，比较给药组与正常组小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞吞噬力的差别，判断标准采用吞噬率和吞噬指数的高低，结果见表1-2。
表1、复方鳖甲软肝片对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响组别 鼠号 吞噬率(％)X±SD(％)12.027.0正常对照组32.0 5.0±3.5411.053.0128.0212.0药物治疗组311.014.0±7.0417.059.067.0表1结果说明，正常小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞吞噬率为5.0％；而复方鳖甲软肝片治疗组吞噬率为14.0％，比正常对照组平均提高9.0％，说明复方鳖甲软肝片确有促使小鼠腹腔巨噬细胞特异吞噬功能，增强机体免疫力的作用。
表2 给药组与正常组吞噬指数的比较组别 鼠数(只)吞噬指数提高(％)正常对照组5 1.08药物治疗组6 1.156.5表2结果说明，正常对照组巨噬细胞巨噬指数为1.08，而药物组为1.15，提高吞噬指数6.5％，表明给药后的小鼠腹腔巨噬细胞吞噬力加强。
验证结果1、通过小鼠腹腔巨噬细胞特异吞噬功能的测定，治疗组小鼠平均腹腔巨噬细胞对鸡红细胞吞噬率为14.0％，而正常组小鼠吞噬率为5.0％，复方鳖甲软肝片组吞噬率提高9.0％。说明复方鳖甲软肝片有促巨噬细胞特异吞噬作用。
2、从巨噬细胞吞噬指数来看，给药组为1.15，而正常组为1.08，平均提高指数6.5％，进一步证明复方鳖甲软肝片确实具有促进巨噬细吞噬功能，增强机体免疫机能的作用。
3、结果证明，复方鳖甲软肝片“增强机体免疫机能”的临床功效与本实验结论相吻合。
六、复方鳖甲软肝片对大鼠急性肝损伤保护作用的实验本实验以CCL4制造大鼠肝损伤实验动物模型，而后设置复方鳖甲软肝片不同剂量组给予灌胃治疗，测血清转氨酶，根据降酶情况评价本药抗急性肝损伤的治疗效果。
实验动物纯种大鼠，大鼠体重180-200g，雌雄各半，由中国科学院实验动物中心供给，二级Wistar大鼠质量合格证证号京动管质字(1994)第032号。符合国际动物标准。
验证药材为华星药厂研制的复方鳖甲软肝片，每片含生药量0.46克；四氯化碳(CCL4)分析纯，北京化工厂生产；液体石蜡医用，抚顺市制药厂；注射用水由本院动物实验中心提供；Photometer 4010型生化分析仪。
动物模型制备8％CCL41.8ml/kg体重(用液体石蜡配制)，给大鼠皮下注射致大鼠急性肝损伤，6小时后可作为急性肝损伤动物模型，供实验用。
随机分5组(一)正常对照组16只大鼠，不给CCL4，给注射用水2ml灌胃一日二次(其余给常规饲料)，共48小时。
(二)模型对照组20只大鼠，给CCL4，6小时造成模型后，给注射用水2ml灌胃一日二次(其余给常规饲料)，共48小时。
(三)治疗组设三个剂量组(0.5g/kg/d，1.5g/kg/d，5.0g/kg/d)，每组9只大鼠，给CCL46小时后将已用研钵研成细粉的复方鳖甲软肝片，按每克药粉相当含生药1.40克计算，根据每公斤体重每天三个不同剂量组的50％，以2ml注射用水溶解，一日二次，分别给三个剂量治疗组大鼠灌胃(其余给常规饲料)，共48小时。
检测方法48小时终止治疗后，五组皆股动脉取血，由本实验室用photometer4010型生化分析仪，检测血清谷丙转氨酶，以光密度值(OD)表示。
实验结果为了观察和比较复方鳖甲软肝片对实验性大鼠急性肝损伤治疗效果，测定48小时治疗组和对照组血清转氨酶含量变化，对复方鳖甲软肝片降酶效果进行观察。见下表。
表一复方鳖甲软肝片对实验性大鼠急性肝损伤保护(降酶)作用结果组别鼠数(只) 光密度(OD) 为模型的(％)正常对照组 16 0.152±0.029 ----
模型对照组 200.385±0.135 100小剂量组0.5g/kg/d 9 0.282±0.94 73.25中剂量组1.5g/kg/d 9 0.335±0.112 87.12大剂量组5.0g/kg/d 9 0.315±0.112 81.82结果说明1、以模型对照组转氨酶光密度值(OD)为100％，复方鳖甲软肝片小、中、大剂量组转氨酶水平分别降低了26.75％，12.88％和18.18％。
2、为了评价复方鳖甲软肝片剂量与降酶效果的关系，将三个剂量组分别与模型对照组实验数据以及各剂量组之间做显著性计算，结果小剂量组、大剂量组与模型组相比，p＜0.01和0.05。小剂量组降酶水平非常显著，大剂量组显著，中剂量组与大剂量组无统计学差别处于同等水平，所以三个剂量组均有降酶作用。
3、复方鳖甲软肝片对CCL造成的大鼠急性肝损伤有保护作用，转氨酶的下降率约13-27％。
4、本动物实验结果与我们临床应用有极好疗效相一致，初步证实复方鳖甲软肝片不仅有抗肝纤维化作用，还具有抗肝损伤，保护肝功能作用，因此，是治疗慢性乙型肝炎肝纤维化及早期肝硬变的有效药物。
七、复方鳖甲软肝片抗鸭乙型肝炎病毒的效果观察实验采用一日龄北京鸭，静脉感染鸭乙型肝炎病毒，7天后给复方鳖甲软肝片，观察药物对鸭乙型肝炎病毒DNA(DHBV-DNA)的影响。实验共设计四个剂量组0.0536g/kg/d；0.268g/kg/d；1.0g/kg//d；4.0g/kg/d组，共10天。
材料和方法(一)药物复方鳖甲软肝片粉剂(1g含生药1.40g)，本院华星药厂提供。批号930206，阳性药物无环鸟苷(ACV)，湖北科益公司购入。
(二)病毒鸭乙型肝炎病毒，鸭乙型肝炎病毒DNA(DHBV-DNA)血清，-70℃保存，由中国医学科学院医药生物技术研究所提供。
(三)动物1日龄北京鸭，体重80-100g，购自北京莲花池鸭场。
(四)试剂32P-dcTP购自北京福瑞生物工程公司，缺口翻译药合购自普洛麦格公司(Promega Co.)；Sephadex G-50；FicoII PVP购自瑞典Pharmacia公司；SDS为西德Merok公司产品；鱼精蛋白DNA；牛血清白蛋白为中国科院生物物理所产品；硝酸纤维素膜(0.45μm)为Amersham公司产品。
(五)实验方法
1.鸭乙型肝炎病毒感染1日龄北京鸭，经静脉感染DHBV-DNA阳性血清，0.2ml/只，感染7天后，分离血清，-70℃保存待检。
2.药物治疗DHBV感染北京鸭7天后，按体重随机分组，每组6-7只，设病毒对照组(DHBV)，以生理盐水代替药物，阳性药物组用无环鸟苷，灌胃给药200mg/kg/d，2次/天，10天，治疗组分4个剂量(按含生药量)，0.0536g/kg/d；0.268g/kg/d；1.0g/kg//d；4.0g/kg/d，灌胃，2次/天，1ml/次(将药用生理盐水稀释为1ml，内含不同浓度)，共10天。分别于感染后7天即用药前(T0)，用药后5天(T5)和停药后3天(T10)和停药后3天(P3)，自鸭腿静脉取血，分离血清，-70℃保存待检。
3.检测方法按缺口翻译试剂盒说明，采用32P标记DHBV-DNA探针，做鸭血清斑点杂交。放射自显影胶片斑点，用酶标检测仪测定OD值(滤光片为490nm)，计算血清DHBV-DNA密度，以杂交斑点OD值作为标本DHBV-DNA水平值。
(六)药效计算计算每组鸭不同时间血清DNA OD值(X±SD)，并将给药后不同时间(T5，T10)和停药后(P3)血清DHBV-DNA水平与同组给药前(T0)OD值比较，用配对t检验，计算p值，分析差异的显著性，观察药物对病毒感染的抑制率(％)。
将给药后治疗组不同时间DHBF-DNA抑制率，分别与病毒对照组相同时间DHBV-DNA抑制率比较，采用成组t检验计算P值，分析差异的显著性，判断药效。
实验结果1.1日龄北京鸭感染DHBV后7天，治疗组及病毒对照组感染鸭血清DHBV-DNA全部呈阳性。病毒对照组13只鸭感染后20天内，除第一批第10天和第二批停药后3天血清DHBV-DNA有明显的波动外，其余不同时间均未见明显的变化，为自然波动。
2.实验选用4个剂量组，0.0536g/kg/d；0.268g/kg/d；1.0g/kg//d；4.0g/kg/d组。首先将给药第5天、第10天和停药后3天的OD值与给药前OD值进行自身比较。除0.0536g/kg/d组未见明显的抑制作用外(P＞0.05)，其余各剂量组均有明显的抑制作用。0.268g/kg/d组在给药后第10天及停药后3天，鸭血清DHBV-DNA OD值与给药前比较有明显的抑制作用，并均有非常显著性意义(P＜0.01)；1.0g/kg/d组停药后3天与给药前比较，抑制作用仍非常显著(P＜0.01)；4.0g/kg/d组在给药后5天、10天及停药后3天与自身给药前比较，均表现出明显的抑制作用(P＜0.05)，见表1。
表1.复方鳖甲软肝片在鸭体内不同时间血清DHBV-DNA OD值鸭数鸭血清DHBV-DNA 0D值(X±SD)组别(只)T0T5T10P3N.S6 1.09±0.23 1.23±0.17 1.40±0.11* 1.22±0.290.0536g/kg/d 6 1.03±0.37 0.85±0.35 1.00±0.331.19±0.470.268g/kg/d6 1.82±0.29 1.38±0.52 1.15±0.24** 1.10±0.40**N.S7 0.67±0.15 0.67±0.15 0.76±0.211.02±0.07**1.0g/kg/d 6 1.21±0.30 0.98±0.34 0.98±0.420.63±0.30**4.0g/kg/d 6 1.42±0.26 1.10 40.21* 1.05±0.24* 0.99±0.30**N.S6 0.26±0.05 0.22±0.07 0.29±0.060.30±0.10ACV200mg/kg/d 6 0.23±0.03 0.15±0.06* 0.15±0.07* 0.13±0.05**注给药组各时相DHBV-DNA OD值与病毒对照组各时相DHBR-DNA OD值比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
再将4个剂量组的抑制率与病毒对照组抑制率作成组分析，除0.0536g/kg/d组外，其余3个剂量组仍有显著性意义，见表2。
表2、复方鳖甲软肝片治疗组与病毒对照组在鸭体内对DHBV-DNA的抑制率组别 鸭数 抑制率(％)(只)T5T10P3病毒对照组 6 -12.80 -28.40-11.900.0536g/kg/d6 17.502.90 15.500.268g/kg/d 6 24.2036.80 39.60*病毒对照组 7 0-13.40-52.20
1.0g/kg/d 6 19.0019.0047.90**4.0g/kg/d 6 22.5026.1030.30**病毒对照组 6 0.20 -0.12-0.15ACV 200mg/kg/d 6 0.35 0.35** 0.43*注给药组各时相DHBV-DNA抑制率分别与病毒对照组各时相DHBV-DNA抑制率比较，*P＜0.05.**P＜0.01从表2中看出，0.268g/kg/d组在给药后第10天，停药后3天对DHBV-DNA都有非常显著的抑制作用(p＜0.01，p＜0.05)；1.0g/kg/d组及4.0g/kg/d组在停药后第3天仍可以看出很强的抑制作用(p＜0.01)。无环鸟苷200g/kg/d组给药后第10天和停药后第3天也有明显的抑制作用(p＜0.01，p＜0.05)，未见反跳现象。
在复方鳖甲软肝片在鸭乙型肝炎病毒感染鸭血清DHBV-DNA治疗作用的实验中，4个剂量组，除最小剂量0.0536g/kg/d组效果不明显，无统计学意义外，其余剂量组分别在给药后第5天、10天和停药后3天表现出明显的抑制作用，统计学处理结果为显著(p＜0.05)或非常显著(p＜0.01)。值得注意的是，0.268g/kg/d组、1.0g/kg/d组和4.0g/kg/d组在停药后，对DHBV-DNA没有出现反跳作用，反而表现出很强的抑制作用，统计学处理非常显著(p＜0.01)。以上实验结果表明，中药制剂复方鳖甲软肝片在治疗鸭乙型肝炎病毒感染有较好的抑制效果，并表现出持久的抑制病毒作用。
权利要求
1.复方鳖甲软肝片的用途，其特征是用于治疗慢性乙型肝炎肝纤维化。
2.复方鳖甲软肝片的用途，其特征是用于治疗早期肝硬变。
全文摘要
本发明为一种复方鳖甲软肝片的用途,即复方鳖甲软肝片可用于治疗慢性乙型肝炎肝纤维化及早期肝硬变。本发明在七个方面证明了本复方鳖甲软肝片具有阻断肝纤维化的形成、溶解和吸收已形成的肝纤维的作用,有效率为81.67%,治愈率达55.23%。
文档编号A61P1/16GK1273105SQ0010569
公开日2000年11月15日 申请日期2000年4月18日 优先权日2000年4月18日
发明者陈德永, 宋喜秀, 杨永平 申请人:内蒙古福瑞制药有限责任公司