专利名称：鳖甲dna检测试剂盒及鉴定方法
技术领域：
本发明涉及中药材鉴定技术，具体地说是一种鳖甲DNA检测试剂盒及鉴定方法。
背景技术：
鳘甲为鳘科的动物鳘(Trionyx sinensis Wiegamann)的背甲，又名:别甲、团甲壳、上甲、王八盖子、鳖壳、鳖盖子、水鱼壳等。其原动物为中华鳖，俗称团鱼、甲鱼、王八等，属于爬行纲(Repitlia);龟鳘目(Testudinata);鳘科(Tironychidae);鳘属(Peodiscus)。在我国除西藏、青海及新疆以外其他地区均有分布，以长江流域和华南地区最为多见。我国中华鳖养殖产量居世界之首，但20世纪90年代以来，大量境外走私鳖涌入多我国，加上各养殖场相互之间引种、倒种极不规范，不注重培育品种，严重危害了中华鳖的种质资源，种质是产业的源头，影响到鳖甲的资源，影响到鳖甲的用药。鳖甲性味咸、微寒，归肝、肾经。始载于《神农本草经》，列为中品。鳖甲中含有多种成分，主要含有动物胶，角蛋白，碘质，维生素D，磷酸钙，鳖甲多糖，多种氨基酸和多种微量元素等。丰富的成分使鳖甲的药用价值很高。具有滋阴潜阳，退热除蒸，软坚散结等功能，用于阴虚发热，骨蒸劳热，阴虚阳亢，头晕目眩，虚风内动，手足瘈疯，经闭，癥瘕，久疟疟母。为常用中药之一，在临床应用广泛，除临床的配方使用外，尚在复方鳖甲软肝片、人参鳖甲煎丸、参桂鹿茸丸等数种中成药中应用。《中国药典》(2010年，一部)中的鉴别方法为:性状鉴别和浸出物鉴别。文献中尚有显微鉴别、理化鉴别、光谱鉴别、色谱鉴别、生化鉴别等，但这些方法尚不能对鳖甲进行快速、有效的鉴别。分子遗传标记技术开始与中药领域渗透，并快速融合、发展，其中DNA指纹图谱在中药材(除矿物药外)的鉴定方面具有专属性强，准确性高，重复性好等优点，从分子水平解决了以前中药鉴定中宏观鉴定水平上的不完善。现代分子生物学在中药的质量控制领域逐步扩大，方法逐渐完善，大大加快了中药现代化的进程。线粒体是存在于真核细胞内的一种细胞器，线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)是一共价闭合的双链环状的遗传物质，具有分子量小、结构简单、易于分离、拷贝数高、突变率高、进化速度快、母性遗传、无组织特异性、高保守性等特点。其中细胞色素b (cytochrome b, cyt b)基因和细胞色素 C 氧化酶亚基 I (cytochrome c oxidase subunit
I,CO I)基因存在于所有动物中，进化速度适中，较短的一个片段就能包含从种内到种间信息，且其DNA序列很少存在插入和缺失，能够保证足够交异，是分析种内和近缘种间遗传多样性和进化关系的适当的DNA片段，可应用于生物的分类、系统发育和遗传多样性的研究。这两个片段的基因可被作为动物中物种鉴定标记进行研究，因此，以线粒体DNA分子特征为遗传标记的中药鉴定更为准确、可靠。我们依托吉林省科技 厅(2008年I月立项)和吉林省教育厅资助课题(2010年I月立项):《中药DNA指纹检测试剂盒的研究与开发》(2012年5月吉林省科技厅鉴定成果)，基于线粒体DNA建立动物中药材的DNA指纹特征，成功开发出紹心、鹿鞭和鹿茸三种中药材DNA鉴定试剂盒。
貂心属细贵药材，是国家药监局局标准(原卫生部部颁标准)利心丸中的主药。目前，国家标准中尚无貂心的法定鉴别方法，对貂心的成分研究及鉴别国内外文献中也未见报道，常用中药材鉴别方法无法区别貂心与易混动物的心脏，故给貂心及其制剂的质量控制带来了很大困难。课题组在发现貂心线粒体DNA的全部基因组前提下，利用貂心mtDNA独特的优势，应用DNA扩增技术及测序技术研究貂心线粒体DNA的基因组部分序列，设计的寡核苷酸片段可特异鉴定鸡心、鸭心、鹅心和兔心，成功发明了一种简便、快速、特异的鉴定貂心专利技术(貂心DNA检测试剂盒及鉴定方法，发明专利:ZL200810051643.3 ;2011.4授权)。相关成果发表在吉林大学学报《貂组织线粒体DNA及细胞色素b鉴定及特征》[2008，34(5):790-793]，中国药学杂志《水貂心肌线粒体mtDNA鉴定及RFLP特征》[2012,4(3):182-185]。在此基础上，课题组应用分子生物学与中药鉴定的相融合的理论对鳖甲的鉴定技术进行研究，主要应用线粒体DNA的cyt b高保守性及特异性对鳖甲进行鉴定。采用盐析法方法从鳖甲中提取线粒体DNA，利用Genbank中的相关信息，根据中华鳖与其他相关动物的线粒体DNA序列的差异,选取cyt b基因序列,应用primer premier5.0引物设计软件设计鳖甲一对特异性引物，进行PCR(聚合酶链式反应)扩增，此方法可从分子水平对鳖甲鉴定提供依据。相关成果发表在中国药学杂志《中药材龟甲细胞色素b特异性鉴定研究》[2012，4(3):182-185]。国内杜胃$等人通过对细胞色素C氧化酶亚基I (cytochrome c oxidase subunitI，CO I)基因序列对比研究发现，中华鳖CO I基因序列种内变异很小，种间存在较多的变异位点，可以作为DNA条形码技术鉴别鳖甲杜鹃，崔丽娜，张辉，等:鳖甲及其伪品的DNA分子鉴定.世界科学技术-中医药现代化，2011，13(2) =429-434.。实验证明了中华鳖CO I基因可以作为鉴别靶位。但是，DNA条形码技术要求至少选择两个基因位点，单独选择一个位点不能避免突变导致的变异。刘忠权等人利用位点特异性PCR技术，配合测序技术鉴别鳖甲及其同科动物刘重权，等.中药材鳖甲的位点特异性PCR鉴定研究.中药材，2001，32(8) =736-739.;吴平，等.用聚合酶链反应产物直接测序技术鉴定中药材鳖甲.中国药科大学学报，1998，29 (I):28-30.。实验证明了中华鳖一些基因位点可以通过特异性PCR和测序技术进行鉴别。在此基础上，本发明专利基于同时选择两个特异位点用于中华鳖鉴别。从中华鳖CO I基因和cyt b基因中，采用高通量技术分析两个基因具有鉴别序列片段作为鉴别点。建立多重引物PCR(又称复合PCR)反应体系。多重PCR具有高效性特点，即在同一 PCR反应管内同时检出多种目的基因，或对有多个型别的目的基因进行分型，特别是用一个样本就可检测多种项目。由于鳖甲型别较多，种间存在较多的变异位点，多重PCR可提高其检出率并同时鉴定其型别及突变等。此外，多重PCR具有经济简便性特性，多种目的基因在同一反应管内同时检出，将大大的节省时间，节省试剂，节约经费开支。对中药材鉴定具有节约样本等优势，具有节省时间、降低成本和提高效率的特点。
发明内容
本发明专利采用生物信息学技术对中华鳖鳖甲线粒体DNA基因组进行筛选，利用Genbank中的相关信息，根据中华鳖与其他相关动物的线粒体DNA序列的差异，选取COX I和cyt b基因序列,应用primer premier5.0设计软件,设计可有效地区分鳘甲和伪品的特异性DNA序列，利用多重PCR技术在一个反应体系中加入二对特异性引物，针对一个模板可扩增二个具有差异的目的片段。提供一种能够准确鉴别鳖甲和伪品特异性分子标志，使用方便的鳖甲和伪品多重PCR检测试剂盒，具有节省时间、降低成本和提高效率的特点，并提供其简便、快速、检测结果可靠的鉴定方法。本发明的目的是由以下技术方案来实现的:一种鉴别鳖甲和伪品多重PCR检测试剂盒，其特征是，它包含:1.样本前处理液及脱钙液每样品取2g，刷洗干净后用前处理液(主要含有去离子水)冲洗干净，室温干燥，用紫外灯照射30min以上。使用研钵将样品研碎至2 3mm左右，置于离心管中，每份按质量体积比1: 20加入相应体积脱钙液(主要含有0.5mol/L pH8.0EDTA)，56C水浴48h 60h,转速100r/min。每12h更换一次新鲜的脱I丐液。脱I丐后8000r/min离心5min弃上清，沉淀待用。2.线粒体DNA提取体系(I)裂解液向经过前处理的样品中加入5ml裂解液[lOmmol/L Tris-HCl (pH8.0)，10m mol/L EDTA(ρΗ8.0)，100m mol/L NaCl，2% SDS，40 μ g/ml 蛋白酶K，0.039mol/L DTT]，置于水浴锅中，56°C水浴过夜，转速100r/min。(2)沉淀液直接向裂解后的样品中加入2ml沉淀液(主要含有NaAC)，充分混匀，6，000r/min4°C离心IOmin,吸取上清,弃沉淀。向上清中加入等体积的预冷的异丙醇,混勻后，低温放置20 30min, 12, 000r/mi`n4°C离心20min,弃上清，留沉淀。(3)洗涤液使用洗涤液(主要含有70%乙醇)洗涤沉淀两到三次，干燥沉淀，溶于灭菌双蒸水中，_80°C保存备用。3.PCR反应体系(a)鉴定反应体系总体系为IOOyL,其中含有缓冲液10yL，12.5mM dNTP4 10μ L,0.1mM鳖甲COX I引物和cyt b引物各1.5 4.0 μ L，Taq DNA聚合酶2 10 μ L，待测样品DNA2 5 μ L，余为双蒸馏水；(b)阳性对照反应体系总体系为100 μ L，其中含有缓冲液10 μ L，12.5mM dNTP4 10μ L,0.1mM鳖甲COX I引物和cyt b引物各1.5 4.0 μ L，Taq DNA聚合酶2 10 μ L，中华鳖鳖甲DNA2 5yL，余为双蒸馏水；(c)阴性对照反应体系总体系为IOOyL,含有缓冲液10yL，12.5mM dNTP4 10μ L,0.1mM鳖甲COX I引物和cyt b引物各1.5 4.0 μ L，Taq DNA聚合酶2 10 μ L，伪品DNA2 5 μ L,余为双蒸懼水；(d)设计反应程序分别将鉴别鳖甲和伪品PCR检测试剂盒的(a)鉴定反应体系、
(b)阳性对照反应体系和(c)阴性对照反应体系的总体系各IOOyL加入反应管中，置于PCR反应仪(市场有售，任意型号)中按下列程序进行:94°C预变性3min 7min，94°C 30s，退火温度 56°C Imin 30s, 72°C Imin 30s, 40 个循环，72°C延伸 5min 8min, 4°C。4.结果观察体系制备用1.5琼脂糖凝胶(市场有售，可购买)，电泳，分子量100 1500bp的DNAMarker (标准分子量，市场有售)作参照，凝胶成像分析系统(市场有售，可购买)观察和分析结果。鳖甲DNA鉴定方法，其特征是，它包含以下步骤:1.检测样本前处理每个样品取2g，刷洗干净后用前处理液冲洗干净，室温干燥，用紫外灯照射30min以上。使用研钵将样品研碎至2 3mm左右，置于离心管中，每份按质量体积比1: 20加入相应体积脱钙液，56°C水浴48h 60h，转速100r/min。每12h更换一次新鲜的脱钙液。脱隹丐后8000r/min离心5min弃上清,沉淀待用。2.线粒体DNA提取(I)样本裂解向经过前处理的样品中加入5ml裂解液，置于水浴锅中，56°C水浴过夜，转速 100r/min。(2)沉淀直接向裂解后的样品中加入2ml沉淀液，充分混匀，6，000r/min4°C离心lOmin，吸取上清，弃沉淀。向上清中加入等体积的预冷的异丙醇，混匀后，低温放置20 30min, 12, 000r/min4°C离心 20min,弃上清，留沉淀。(3)洗涤使用洗涤液洗涤沉淀两到三次，干燥沉淀，溶于灭菌双蒸水中，-80°C保存，作为检测DNA模板。 3.PCR引物设计与合成(I)设计鳖甲线粒体DNA 二对特异寡核苷酸引物，含有鳖甲DNA序列，如下Primerl、Primer2:Primerl (COX I)5' ATACATCCGATACAACAGC 3'5' GATAAATGGGAGATAAGTG 3'Primer2 (cyt b)5' ATCATCCGATCAATAACAG 3'5, AGGGAGAATAATAAAGTGAAA 3,(2)人工合成鳖甲线粒体DNA 二对特异寡核苷酸引物，采用ABI3900高通量合成仪。(委托上海生工完成)4.建立PCR反应(a)鉴定反应总体系为100 μ L，其中含有缓冲液10 μ L，12.5mM dNTP4 10 μ L，0.1mM引物I和引物2各1.5 4.0 μ L，Taq DNA聚合酶2 10 μ L，待测样品DNA2 5 μ L，余为双蒸馏水。(b)阳性对照反应总体系为IOOyL,其中含有缓冲液10yL，12.5mM dNTP4 10μ L,0.1mM鳖甲COX I引物和cyt b引物各1.5 4.0 μ L，Taq DNA聚合酶2 10 μ L，中华鳖鳖甲DNA2 5 μ L，余为双蒸馏水。(C)阴性对照反应总体系为100 μ L，含有缓冲液10 μ L，12.5mM dNTP4 10 μ L，0.1mM鳖甲COX I引物和cyt b引物各1.5 4.0 μ L，Taq DNA聚合酶2 10 μ L，伪品DNA2 5 μ L,余为双蒸懼水。(d)设计反应程序分别将鉴别鳖甲和伪品PCR检测试剂盒的(a)鉴定反应体系、(b)阳性对照反应体系和(c)阴性对照反应体系的总体系各IOOyL加入反应管中，置于PCR反应仪(市场有售，任意型号)中按下列程序进行:94°C预变性3min 7min，94°C 30s，退火温度 56°C Imin 30s, 72°C Imin 30s, 40 个循环，72°C延伸 5min 8min, 4°C。5.结果判定产物用1.5-1.8%琼脂糖凝胶(市场有售)电泳，分子量IOObp 1500bp的DNAMarker (标准分子量，市场有售)作参照，凝胶成像分析系统(市场有售，可购买)观察和分析结果。同时出现IOOObp和500bp条带为正品鳖甲，只出现一条或不出现均为伪品鳖甲(图1)。本发明的鉴别鳖甲和伪品鉴定试剂盒是利用鉴别鳖甲和伪品线粒体DNA与细胞色素b和c具有的种属特异性位点，能够准确同时区别鉴别鳖甲和伪品的特异性；建立的多重PCR鉴定方法具有简便、快速、检测结果可靠等优点。
图1为鳖甲试剂盒检测结果示意图。其中:1.为正品鳖甲结果，同时扩增出IOOObp和500bp ；2.为阳性对照，同时扩增出IOOObp和500bp ；3.为标准分子量；4.为阴性结果，不出现或只出现I条扩增产物。图2实施例一鳖甲试剂盒检测结果示意图。其中:1.为正品鳖甲结果，同时扩增出IOOObp和500bp ；2.为阳性对照，同时扩增出IOOObp和500bp ;3 .为标准分子量；4.为阴性结果，不出现或只出现I条扩增产物。5.为阴性对照。图3实施例二对市售鳖甲药材进行鉴定结果示意图。其中:1.为阳性对照，扩增出IOOObp和500bp ；2.为正品鳖甲结果，扩增出IOOObp和500bp ；3:緬甸陆龟甲；4:凹甲陆龟甲；5:黄额闭壳龟甲；6:黄喉拟水龟甲；7:三线闭壳龟甲；8.为标准分子量；9.为阴性结果
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步说明，下面实施例仅用于说明本发明而并非对本发明的限制。实施例一1.检测样本前处理检测样品(两种，I为鳖甲正品，2为花龟，鳖甲伪品，均由中国药品生物制品检定所提供并鉴定)，每份取2g，刷洗干净后用前处理液冲洗干净，室温干燥，用紫外灯照射30min以上。使用研钵将样品研碎至2 3mm左右，置于离心管中，每份按质量体积比1: 20加入相应体积脱钙液，56°C水浴48hh，转速100r/min。每12h更换一次新鲜的脱钙液。脱隹丐后8000r/min离心5min弃上清,沉淀待用。2.线粒体DNA提取(I)样本裂解向经过前处理的样品中加入5ml裂解液，置于水浴锅中，56°C水浴过夜，转速 100r/min。(2)沉淀直接向裂解后的样品中加入2ml沉淀液，充分混匀，6，000r/min4°C离心IOmin,吸取上清,弃沉淀。向上清中加入等体积的预冷的异丙醇，混勻后，低温放置30min,12，000r/min4°C离心20min,弃上清，留沉淀。(3)洗涤使用洗涤液洗涤沉淀两到三次，干燥沉淀，溶于灭菌双蒸水中，-80°C保存，作为检测DNA模板。3.PCR引物设计与合成(I)设计鳖甲线粒体DNA 二对特异寡核苷酸引物，含有鳖甲DNA序列，如下Primerl、Primer2:Primerl (COX I)5' ATACATCCGATACAACAGC 3'5' GATAAATGGGAGATAAGTG 3'Primer2 (cyt b)5' ATCATCCGATCAATAACAG 3'5, AGGGAGAATAATAAAGTGAAA 3,(2)人工合成·鳖甲线粒体DNA 二对特异寡核苷酸引物，采用ABI3900高通量合成仪。(委托上海生工完成)4.建立PCR反应(a)鉴定反应总体系为100 μ L，其中含有缓冲液10 μ L，12.5mM dNTP4 μ L，0.1mM引物I和引物2各2.0 μ L，Taq DNA聚合酶2 μ L，待测样品DNA2 μ L，余为双蒸馏水。(b)阳性对照反应总体系为IOOyL,其中含有缓冲液10yL，12.5mM dNTP4 μ L,
0.1mM鳖甲COX I引物和cyt b引物各2.0 μ L，Taq DNA聚合酶2 μ L，中华鳖鳖甲DNA2 μ L，余为双蒸馏水。(C)阴性对照反应总体系为100 μ L，含有缓冲液10 μ L, 12.5mM dNTP4y L,0.1mM鳖甲COX I引物和cyt b引物各2.0 μ L，Taq DNA聚合酶2 μ L，伪品DNA2 μ L，余为双蒸馏水。(d)设计反应程序分别将鉴别鳖甲和伪品PCR检测试剂盒的(a)鉴定反应体系、
(b)阳性对照反应体系和(c)阴性对照反应体系的总体系各IOOyL加入反应管中，置于PCR反应仪(市场有售，任意型号)中按下列程序进行:941:预变性51^11，941: 30s，退火温度 56。。30s, 720C lmin，40 个循环，72°C延伸 5min，4°C。5.结果判定PCR产物用1.5琼脂糖凝胶电泳，标准分子量IOObp 1500bp的DNA Marker作参照，凝胶成像分析系统观察和分析结果(图2)。实施例2对市售鳖甲药材进行鉴定1.材料市售鳖甲样品5种，鳖甲正品I种(由吉林市药品检定所提供并鉴定)2.方法2.1检测样本前处理每份检测样品取2g，刷洗干净后用前处理液冲洗干净，室温干燥，用紫外灯照射30min以上。使用研钵将样品研碎至2 3mm左右，置于离心管中，每份按质量体积比1: 20加入相应体积脱钙液，56°C水浴48hh，转速100r/min。每12h更换一次新鲜的脱韩液。脱韩后8000r/min离心5min弃上清,沉淀待用。2.2线粒体DNA提取(I)样本裂解向经过前处理的样品中加入5ml裂解液，置于水浴锅中，56°C水浴过夜，转速 100r/min。
(2)沉淀直接向裂解后的样品中加入2ml沉淀液,充分混勻,6，000r/min4°C离心IOmin,吸取上清,弃沉淀。向上清中加入等体积的预冷的异丙醇，混勻后，低温放置30min,12，000r/min4°C离心20min,弃上清，留沉淀。(3)洗涤使用洗涤液洗涤沉淀两到三次，干燥沉淀，溶于灭菌双蒸水中，-80°C保存，作为检测DNA模板。2.3PCR引物设计与合成(I)设计鳖甲线粒体DNA 二对特异寡核苷酸引物，含有鳖甲DNA序列，如下Primerl、Primer2:Primerl (COX I)5' ATACATCCGATACAACAGC 3'5' GATAAATGGGAGATAAGTG 3'Primer2 (cyt b)5' ATCATCCGATCAATAACAG 3'5, AGGGAGAATAATAAAGTGAAA 3,(2)人工合成鳖甲线粒体DNA二对特异寡核苷酸引物，采用ABI3900高通量合成仪(委托上海生工完成)。2.4建立PCR反应(a)鉴定反应:总体系为100 μ L，其中含有缓冲液10 μ L，12.5mM dNTP4 μ L，0.1mM引物I和引物2各2.0 μ L，Taq DNA聚合酶2 μ L，待测样品DNA2 μ L，余为双蒸馏水。(b)阳性对照反应:总体系为100 μ L，其中含有缓冲液IOyL, 12.5mM dNTP4 μ L,0.1mM鳖甲COX I引物和cyt b引物各2.0 μ L，Taq DNA聚合酶2 μ L，中华鳖鳖甲DNA2 μ L，余为双蒸馏水。(C)阴性对照反应:总体系为100 μ L，含有缓冲液10 μ L, 12.5mM dNTP4y L,0.1mM鳖甲COX I引物和cyt b引物各2.0 μ L，Taq DNA聚合酶2 μ L，伪品DNA2 μ L，余为双蒸馏水。(d)设计反应程序分别将鉴别鳖甲和伪品PCR检测试剂盒的(a)鉴定反应体系、
(b)阳性对照反应体系和(c)阴性对照反应体系的总体系各IOOyL加入反应管中，置于PCR反应仪(市场有售，任意型号)中按下列程序进行:941:预变性51^11，941: 30s，退火温度 560C 30s, 720C lmin，40 个循环，72°C延伸 5min，4°C。3.结果判定
PCR产物用1.5琼脂糖凝胶电泳，标准分子量IOObp 1500bp的DNA Marker作参照，凝胶成像分析系统观察和分析结果(图3)。
权利要求
1.一种鳖甲DNA检测试剂盒，其特征是，它包含样本前处理液及脱钙液、线粒体DNA提取体系、PCR反应体系、结果观察体系。
(1)样本前处理液及脱钙液 (a)前处理液:去离子水。(b)脱钙液:0.5mol/L ρΗ8.0EDTA0 (2)线粒体DNA提取体系(a)裂解液:10mmol/L Tris-HCl (ρΗ8.0)，IOm mol/L EDTA(ρΗ8.0)，100m mol/L NaCl，2% SDS,40y g/ml 蛋白酶 K，0.039mol/L DTT。
(b)沉淀液:饱和NaAC。
(c)洗涤液:70%乙醇。
(3)PCR反应体系 (a)鉴定反应体系:总体系为100μ L，其中含有缓冲液10 μ L，12.5mM dNTP4 10 μ L，0.1mM鳖甲COX I引物和cyt b引物各1.5 4.0 μ L，Taq DNA聚合酶2 10 μ L，待测样品DNA2 5 μ L,余为双蒸懼水； (b)阳性对照反应体系:总体系为IOOyL,其中含有缓冲液10yL，12.5mMdNTP4 10μ L,0.1mM鳖甲COX I引物和cyt b引物各1.5 4.0 μ L，Taq DNA聚合酶2 10 μ L，中华鳖鳖甲DNA2 5 μ L，余为双蒸馏水； (c)阴性对照反应体系:总体系为100μ L，含有缓冲液10 μ L，12.5mM dNTP4 10 μ L，0.1mM鳖甲COX I引物和cyt b引物各1.5 4.0 μ L，Taq DNA聚合酶2 10 μ L，伪品DNA2 5 μ L,余为双蒸懼水； (4)结果观察体系 (a)琼脂糖凝胶:1.5 %琼脂糖。
(b)标准分子量:100bp 1500bp的DNAMarker (可以选用其它种类的标准分子量，要求最大的不能超过2000bp，要含有IOOObp和500bp)。
2.鳖甲DNA鉴定方法，其特征是，它包含检测样本前处理、线粒体DNA提取、PCR引物设计与合成、建立PCR反应、结果判定五个步骤。
(1)检测样本前处理 每个样品取2g，刷洗干净后用前处理液冲洗干净，室温干燥，用紫外灯照射30min以上。使用研钵将样品研碎至2 3mm左右，置于离心管中，每份按质量体积比1: 20加入相应体积脱钙液，56°C水浴48h 60h，转速100r/min。每12h更换一次新鲜的脱钙液。脱隹丐后8000r/min离心5min弃上清,沉淀待用。
(2)线粒体DNA提取 (a)样本裂解向经过前处理的样品中加入5ml裂解液，置于水浴锅中，56°C水浴过夜，转速 100r/min。
(b)沉淀直接向裂解后的样品中加入2ml沉淀液，充分混勻,6，000r/min4°C离心lOmin，吸取上清， 弃沉淀。向上清中加入等体积的预冷的异丙醇，混匀后，低温放置20 30min, 12, 000r/min4°C离心 20min,弃上清，留沉淀。
(c)洗涤使用洗涤液洗涤沉淀两到三次，干燥沉淀，溶于灭菌双蒸水中，-80°C保存，作为检测DNA模板。(3)PCR引物设计与合成 (a)设计鳘甲线粒体DNA二对特异寡核苷酸引物,含有鳘甲DNA序列，如下Primerl、Primer2:Primerl(COX I)5' ATACATCCGATACAACAGC 3'5' GATAAATGGGAGATAAGTG 3'Primer2(cyt b)5' ATCATCCGATCAATAACAG 3'5' AGGGAGAATAATAAAGTGAAA 3' (b)人工合成鳖甲线粒体DNA二对特异寡核苷酸引物，采用ABI3900高通量合成仪(委托上海生工完成)。
(4)建立PCR反应 (a)鉴定反应总体系为100μ L，其中含有缓冲液10 μ L，12.5mM dNTP4 10 μ L，0.1mM弓丨物I和引物2各1.5 4.0 μ L，Taq DNA聚合酶2 10 μ L，待测样品DNA2 5 μ L，余为双蒸馏水。
(b)阳性对照反应总体系为100μ L，其中含有缓冲液IOyL, 12.5mM dNTP4 10 μ L，,0.1mM鳖甲COX I引物和cyt b引物各1.5 4.0 μ L，Taq DNA聚合酶2 10 μ L，中华鳖鳖甲DNA2 5 μ L，余为双蒸馏水。
(c)阴性对照反应总体系为100μ L，含有缓冲液10 μ L，12.5mM dNTP4 10 μ L，0.1mM鳖甲COX I引物和cyt b引物各1.5 4.0 μ L，Taq DNA聚合酶2 10 μ L，伪品DNA2 ,5 μ L,余为双蒸懼水。
(d)设计反应程序分别将鉴别鳖甲和伪品PCR检测试剂盒的(a)鉴定反应体系、(b)阳性对照反应体系和(c)阴性对照反应体系的总体系各100 μ L加入反应管中，置于PCR反应仪(市场有售，任意型号)中按下列程序进行:94°C预变性5min，94°C 30s，退火温度560C 30s, 720C lmin，40 个循环，72°C延伸 5min，4°C。
(5)结果判定 产物用1.5琼脂糖凝胶电泳，分子量IOObp 1500bp的DNA Marker (标准分子量，市场有售)作参照，凝胶成像分析系统(市场有售，可购买)观察和分析结果。同时出现IOOObp和500bp条带为正品鳖甲，只出现一条或不出现均为伪品鳖甲。
3.如权利要求1和权利要求2所述的一种鳖甲DNA检测试剂盒及鉴定方法，其特征是，所述鳖甲DNA检测试剂盒及鉴定方法为中华鳖鳖甲。
4.如权利要求2所述的鳖甲DNA检测试剂盒的鉴定方法，其特征是，结果鉴定是利用比较样品PCR扩增片段DNA大小与DNA标准分子量的相同，根据出现判定标准完全一致对鳖甲样品进行真伪鉴定。
5.一种权利要求1和权利要求2所述的一种鳖甲DNA检测试剂盒及鉴定方法，可应用于鳖甲样品的真伪鉴定。
全文摘要
本发明涉及中药鉴定技术领域，具体为一种鳖甲DNA检测试剂盒及鉴定方法。一种鳖甲DNA检测试剂盒包括样本前处理液及脱钙液，线粒体DNA提取体系，PCR反应体系，结果观察体系四部分组成。一种鳖甲DNA鉴定方法，包括检测样本前处理，线粒体DNA提取，PCR引物设计与合成，建立PCR反应，结果判定五步。判断标准为同时出现1000bp和500bp条带为正品鳖甲，只出现一条或不出现均为伪品鳖甲本发明建立的多重PCR鉴定方法具有简便、快速、检测结果可靠等优点，能够准确同时区别鉴别鳖甲和伪品的特异性。
文档编号C12Q1/68GK103074433SQ201310027918
公开日2013年5月1日 申请日期2013年1月14日 优先权日2013年1月14日
发明者李明成, 苑广信, 张丽华, 夏薇, 王冰梅 申请人:吉林市雷博科技有限公司