本发明属于微生物次生代谢产物应用技术领域，具体涉及狭旋毛壳次生代谢产物可皆霉素在制备抗炎药物中的应用。
背景技术：
狭旋毛壳（Chaetomium angustispirale）属于子囊菌门毛壳属真菌，世界性分布，具有重要的经济学价值和生态意义。研究表明：毛壳菌作为生防菌能够在防治植物病害方面发挥积极作用，且多数具有降解纤维素的能力。可皆霉素（Cochliodinol）为狭旋毛壳的次生代谢产物，分子式为C32H30N2O4；分子量：506.22；CAS登录号：11051-88-0，结构式为：
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炎症为具有血管系统的活体组织对局部损伤的反应。体表的外伤感染和各器官的大部分常见病和多发病(如肺炎、肝炎、肾炎等）都属于炎症性疾病。炎症反应具有潜在的危害性，过度的炎症反应会造成机体的严重损伤。免疫系统、血液凝固系统和纤维蛋白溶解系统以及细胞因子都是炎症反应的必要因素。而NO不但在血管反应中起主要作用，而且还参与免疫系统反应和血小板的调节反应，并且作为细胞因子在炎症反应中扮演了重要的角色。其在免疫系统中有多种作用，其中通过对淋巴细胞功能和某些细胞凋亡的影响是其参与自身免疫性疾病的一重要机制。其诱导促炎症细胞因子产生，如、IL-I等。因此，抑制NO在体内的的分泌，可有效抑制炎症反应。
NO合成酶抑制剂的研究众多，按照来源可将其分为天然产物中提取和化学合成两大类。然而，天然产物分离原料稀少，纯度低，很少能够进入工业化生产；以天然产物为母体通过化学合成的方法进行修饰，可加强对酶的亲和特异性，但是对人体的毒副作用大。微生物代谢提取药物是利用菌株自身的天然产物合成途径产生比较复杂的大分子产物，生产可达工业化，人体副作用很少，且具有可持续发展性。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种可皆霉素在制备抗炎药物中的应用。
优选的，本发明的目的是提供一种可皆霉素在制备NO合成酶抑制剂药物中的应用。
本发明产生的有益效果是：可皆霉素具有良好的NO分泌抑制活性，其对NO的分泌抑制率可达到96.88%，抑制作用显著强于地塞米松片。
具体实施方式
实施例1
1 实验材料
1.1实验药品
可皆霉素及其阳性对照药物地塞米松片、脂多糖。
1.2 实验使用的细胞系
小鼠单核巨噬细胞RAW264.7购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。RAW264.7细胞以含有10%特级胎牛血清的RPMI-1640培养基（添加100 U/mL的青霉素和100 μg/mL的链霉素）培养于37 ℃、5% CO2的培养箱内。
1.3 实验使用的试剂
RPMI-1640培养基、胎牛血清、青链霉素混合液 （双抗）、内毒素脂多糖、二甲基亚砜、NO试剂盒、CCK-8试剂盒、地塞米松片、磷酸盐缓冲液 、75%医用乙醇。
1.4 实验使用的仪器及设备
仪器设备：超净工作台、倒置显微镜、细胞培养板、血球计数板、细胞培养皿、细胞养箱、全自动酶标仪、无菌细胞刮刀、普通冰箱 、Milli-Q超纯水器、涡旋混合器、电热恒温水浴锅 、TGL-16G型离心机、手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器、AR1140型电子分析天平 。
2 实验方法
2.1 主要试剂的配制
培养液的配制：将胎牛血清和青链霉素混合液加到RPMI-1640培养基中（使胎牛血清的浓度为10%、青链霉素混合液的浓度为1%），混匀，保存在4℃冰箱中。细胞冻存液的配制：培养液、胎牛血清和高压灭菌的DMSO以7:2:1（V:V:V）混匀，密封，4 ℃保存。
脂多糖溶液的配制：用DMSO溶解，再用培养液稀释，DMSO终质量分数不超过0.1%，配成浓度为100 μg/mL的溶液。用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，保存在4 ℃冰箱中，实验前用培养液稀释成所需要的浓度。然后用微孔滤膜过滤后使用。
可皆霉素和阳性对照药物溶液的配制：将可皆霉素及其阳性对照药物地塞米松片、脂多糖（LPS）分别用DMSO溶解，再用培养液稀释，可皆霉素及地塞米松片配成浓度为50 μg/mL的母液，用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，4 ℃保存。实验前用培养液稀释成所需要的浓度，然后用微孔滤膜过滤后使用。在每次的试验中DMSO的浓度均应小于0.1%（g/V），以保证对实验结果无明显的影响。
2.2 细胞培养
（1）细胞培养与传代：将细胞置于细胞培养皿中，加入约10 mL细胞培养液，在 37 ℃、5% CO2 培养箱中孵育，隔天换液一次。当细胞长满培养皿底的80%以上时对细胞进行传代；用移液枪吸去旧的培养液，用3 mL PBS 冲洗2-3遍，加入3 mL培养液，用无菌细胞刮刀刮下，在倒置显微镜下观察。用移液枪轻轻吹打使细胞混匀，然后按照1传3接种到新的培养皿中。
（2）细胞冻存：在倒置显微镜下观察，若细胞处于对数期且状态良好，可以对其进行冻存。离心收集细胞加入1 mL冻存液，吹打成悬浮细胞后吸入冻存管中。于4 ℃冰箱中放置30 min，-20 ℃冰箱中放置30 min，-80℃冰箱中放置过夜，最后放入液氮罐中保存。
（3）细胞复苏：从液氮罐中取出细胞冻存管后，立刻放入37 ℃的水浴中快速摇动，使其迅速溶解，转移至离心管后1000 rpm离心5 min，将细胞转入细胞培养皿中，加入细胞培养液10 mL，并用移液枪轻轻吹打混合均匀，置于CO2细胞培养箱中培养，待细胞贴壁后，更换培养液。
（4）细胞计数：取出细胞计数板，把细胞计数板和盖玻片用酒精棉球擦拭干净，晾干，用镊子将盖玻片盖于计数板上。用无菌细胞刮刀使细胞脱壁，离心后加入5 mL新的细胞培养液，并轻轻吹打使细胞混匀，取出200 μL稀释成1 mL细胞悬液，吹打均匀后，吸取10 μL，沿着盖玻片边缘滴加，使其充满细胞计数板和盖玻片之间的空隙，不能有气泡；在倒置显微镜下，计数4个大格内的细胞总数（若细胞压线，只计压上线和左线者，细胞团按单个细胞计数）。按下式计算细胞总数：细胞总数（个/mL）=（4大格细胞总数/4）×104×稀释倍数（1.1）。
2.3 LPS刺激RAW264.7细胞构建炎症细胞模型及最佳剂量的确定
取对数期的RAW264.7细胞，以105 个/mL的单细胞悬液，接种于96 孔细胞培养板(每孔100 μL)，将培养板置于37 ℃，5% CO2的培养箱中孵育24 h后用LPS进行诱导。实验分为饥饿组和无饥饿组，饥饿组在加LPS之前将旧的细胞培养液弃掉换成无FBS 的培养液。LPS 的终浓度分别为0、0.01 μg/mL、0.1 μg/mL、1 μg/mL、10 μg/mL、100 μg/mL，每个浓度设5个复孔，每孔100 μL，置于培养箱中培养。24 h后终止培养，按照NO 检测试剂盒的说明书操作，在波长为550 nm 处测定OD值，计算出细胞的NO 分泌量。以确定LPS 刺激的最佳作用浓度。计算公式: NO含量（μmol/L）=（测定OD值-空白OD值）/（标准OD值-空白OD值）×标准品浓度×稀释倍数（1.2）。
不同浓度的LPS刺激RAW264.7细胞分泌NO量如表1所示，由表1可以看出：不同浓度的LPS 对RAW264. 7细胞分泌NO 的水平均具有促进作用，但饥饿处理组作用较无饥饿处理组明显，且作用强度与剂量有关。因此表明LPS 可促进RAW264. 7 细胞分泌NO，且LPS刺激RAW264.7细胞构建炎症细胞模型的最佳方法和浓度为：饥饿处理、1 μg/mL。
表1 不同浓度的LPS刺激RAW264.7细胞分泌NO量（±s）
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2.4 可皆霉素和脂多糖对RAW 264.7细胞活力的影响（CCK-8法）
（1）取对数生长期的RAW264.7细胞，以105 个/mL的单细胞悬液，接种于96孔细胞培养板（每孔100 μL），将培养板置于37 ℃、5% CO2的培养箱中孵育24 h。（2）实验分为空白组、正常对照组和药物组。空白组：只加入细胞培养液；正常对照组：只加入细胞；药物组：可皆霉素稀释到不同浓度（5 μg/mL、12.5 μg/mL、25 μg/mL）， 脂多糖稀释至不同浓度（0.01 μg/mL、0.1 μg/mL、1 μg/mL、10 μg/mL、100 μg/mL），每孔加入100 μL，每个浓度设5个复孔。然后将培养板置于培养箱中孵育48 h。（3）每孔加入10 μLCCK -8试剂，然后放置于培养箱中培养1-4h。（4）用酶标仪在波长为450 nm 处测定其OD值。细胞存活率=（药物组OD值-空白组OD值）/（正常对照组OD值-空白组OD值）×100%（1.3）。
表2为不同浓度的可皆霉素作用48h后的RAW 264.7细胞存活率。由表2中数据可见，当可皆霉素质量浓度为12.5 μg/mL及以上时，细胞存活率较低，对细胞毒性较大，IC50为11.51μg/mL。
表2不同浓度的可皆霉素作用48h后的RAW 264.7细胞存活率
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表3为不同浓度的LPS作用后的RAW 264.7细胞存活率，由表3可见，LPS质量浓度为0.01～100 μg / mL时，细胞存活率为（97.14± 6.07）%～（139.08±9.15）%，表明在此浓度范围内LPS无明显细胞毒性作用。而且LPS 1 μg/ mL作用RAW 264.7细胞48小时后，细胞活力增加到 139.08± 9.15%，且细胞多由圆形变为梭形等不规则形态，并出现细长伪足。由此可知，LPS刺激RAW 264.7细胞后，细胞形态发生明显变化，说明RAW264.7 细胞受到 1 μg/ mL LPS 作用48小时后，活力增强。
表3 不同浓度的LPS作用后的RAW 264.7细胞存活率
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2.5 可皆霉素对LPS刺激RAW264.7细胞分泌炎症介质NO水平的影响
（1）取对数期的RAW264.7细胞，以105 个/mL的单细胞悬液，接种于96 孔细胞培养板(每孔100 μL)，将培养板置于37 ℃，5% CO2的培养箱中孵育24 h。（2）实验分为空白组、LPS刺激模型组、药物组、地塞米松片阳性对照组。空白组只加入细胞培养液；LPS刺激模型组加入含有1 μg/mL脂多糖的细胞培养液；药物组加入含有1 μg/mL脂多糖的细胞培养液，并将可皆霉素设置5个浓度梯度（5 μg/mL、12.5 μg/mL、25 μg/mL）；地塞米松片阳性对照组加入含有1 μg/mL脂多糖的细胞培养液，并将地塞米松片设置3个浓度梯度（5 μg/mL、12.5 μg/mL、25 μg/mL）。每孔加入100 μL，每个浓度设3个复孔。然后将培养板置于培养箱中孵育，24 h后终止培养，按照NO检测试剂盒的说明书操作，在波长为550 nm 处测定OD值，计算出细胞的NO分泌量。计算公式：NO含量（μmol/L）=（测定OD值-空白OD值）/（标准OD值-空白OD值）×标准品浓度×稀释倍数（1.4）。
2.6 统计方法
实验所得数据采用GraphPad Prism 5 软件处理，采用均数±标准差（±s）的方式来表示各组的实验数据，若出现P<0.05说明具有显著统计学差异 ，P<0.01 说明具有非常显著统计学差异。
可皆霉素对LPS刺激RAW264.7细胞分泌炎症介质NO水平的影响
表4为经不同浓度的单体化合物作用后，细胞的NO分泌量及NO抑制率。由表4中数据可知，与空白组相比，RAW264.7细胞在受到LPS刺激时，NO的含量明显增加（P<0.01）。当可皆霉素和阳性药物地塞米松作用时，与LPS模型组相比，NO含量均明显减少，统计分析其差异具有统计学意义（P<0.01）。分析抑制率可以看出，阳性药物地塞米松对LPS 刺激 RAW264.7细胞分泌的炎症介质NO抑制作用显著，且剂量依赖性明显。可皆霉素对LPS 刺激RAW264.7细胞分泌的NO都有抑制作用，但与阳性药物地塞米松组相比抑制作用较弱，且无明显剂量依赖性。在浓度为12.5 μg/mL时，可皆霉素对NO的分泌抑制率达到96.88%，抑制作用显著强于阳性对照地塞米松片（91.71%）。
表4 不同浓度的单体化合物作用后细胞的NO分泌量及NO抑制率
注：与空白组相比，**p<0.01；与LPS模型组相比，# #p<0.01。