戈氏梭菌驯化株在制备放疗增敏剂中的应用的制作方法

本发明涉及戈氏梭菌驯化株在制备放疗增敏剂中的应用，特别涉及戈氏梭菌驯化株(DerivativesofClostridiumghonii,DCG)在制备增加鼻咽癌(nasopharyngealcarcinoma，NPC)对X-ray敏感性药物中的应用，属于生物医药
技术领域：
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背景技术：
：放疗是肿瘤治疗三种传统手段之一，其在肿瘤治疗中占据着重要地位。近年来随着放射治疗技术和设备完善，取得了一定程度提高，但大多数肿瘤都存在一定的放射抗拒性，即使用最大可能的照射剂量或改变照射方法，放射野内肿瘤复发依旧存在。目前研究认为，放射抵抗的原因是多方面的，其中最重要的是由于实体肿瘤中普遍存在10％～50％乏氧肿瘤细胞，对射线有抗拒作用，限制了肿瘤放疗的效果。目前临床上用于放疗的增敏剂以化学药物为主，如多西他赛、5-氟脲嘧啶、顺铂和阿霉素等，但当化学药物与放疗联合虽提高了肿瘤细胞杀伤作用，同时也由于缺乏组织分布特异性而增加对正常细胞的毒副作用。因此，迫切需要找到一种能够满足在实体瘤中发挥放疗增敏作用，同时避免对正常组织细胞损伤的增敏药物。目前，戈氏梭菌驯化株的研究主要集中于利用其分泌的水解酶和介导的机体抗肿瘤免疫反应抑制杀伤肿瘤，至今未见有将细菌作为放疗增敏药物使用的报道。如中国专利文献CN104473973A(申请号201410803072.X)公开了一株驯化戈氏梭菌MW-DCG-HNCv-18菌株在制备治疗非小细胞肺癌药物中的应用。该发明还公开了驯化戈氏梭菌MW-DCG-HNCv-18菌株和多西他赛为药效成分联用的药物。其首次发现MW-DCG-HNCv-18菌株对非小细胞肺癌具有特异性抑制作用，对非小细胞肺癌抑制效果显著优于现有已知的其他类似菌株，并通过筛选发现其与多西他赛注射液联用时，对非小细胞肺癌抑制效果更加突出，为治疗非小细胞肺癌提供了新的途径。技术实现要素：本发明针对现有技术的不足，提供戈氏梭菌驯化株在制备放疗增敏剂中的应用。本发明技术方案如下：一株戈氏梭菌驯化株在制备放疗增敏剂中的应用，所述戈氏梭菌驯化株保藏于澳大利亚国家计量研究院，菌株编号为V12/001485。上述应用，所述放疗增敏剂特异性应用于鼻咽癌。上述应用，所述放疗增敏剂包括以戈氏梭菌驯化株菌株为有效成分和药学上可接受的辅料。根据本发明优选的，所述放疗增敏剂剂型为粉针剂；所述戈氏梭菌驯化株菌株为芽孢冻干粉，药学上可接受的辅料为溶媒。进一步优选的，所述溶媒选自林格氏液、质量浓度为0.9％的生理盐水、磷酸盐缓冲液。所述溶媒需要满足非毒性、可注射用的要求。通过静脉、肿瘤瘤内注射和腹腔等方式给药。进一步优选的，所述戈氏菌驯化株芽孢冻干粉的制备方法如下：将戈氏梭菌驯化株芽孢液在-80～-70℃条件下预冷冻1～1.5h，然后在冷阱温度-50～-40℃、真空度15～25Pa条件下冷冻干燥7～9h。有益效果1、本发明首次发现戈氏梭菌驯化株具有对肿瘤的放疗增敏作用。戈氏梭菌驯化株可特异性分布并维持于肿瘤组织中，并具有抑制肿瘤细胞增殖和将肿瘤细胞周期阻滞于G2/M期(对放疗最敏感的细胞周期阶段)和诱导肿瘤细胞凋亡等增加肿瘤细胞对放疗敏感性的作用。2、本发明首次将戈氏梭菌驯化株应用于鼻咽癌的放疗增敏剂中，较应用于其他类型癌细胞具有更加显著的增敏效果。附图说明图1、戈氏梭菌驯化株代谢产物对CEN-2Z细胞增殖的影响曲线图；图中，左图为CEN-2Z细胞增殖抑制率随浓度的变化；右图为CEN-2Z细胞增殖抑制率随时间的变化；图2、戈氏梭菌驯化株代谢产物对CEN-2Z细胞周期影响图；图中，左图为对照组CEN-2Z细胞周期分布；右图为实验组CEN-2Z细胞周期分布；图3、肿瘤生长曲线图；图4、组织匀浆RCM-Agar厌氧培养结果照片；图5、肿瘤组织切片Gramstain(40×)结果照片。具体实施方式下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。菌株来源戈氏梭菌驯化株来源于澳大利亚国家计量研究院，菌株保藏号为V12/001485；多西他赛购自齐鲁制药有限公司，批号：4040071TA，生产日期：2014年04月30日；小动物放疗仪PXI生产，型号：X-RAD225；细胞周期与凋亡检测试剂盒碧云天，货号：C1052；AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡试剂盒凯基生物，货号：GA105-KGA108。实施例1戈氏菌驯化株芽孢冻干粉的制备方法如下：将获得的戈氏梭菌驯化株芽孢液加入50g/L无菌甘露醇冷冻保护剂，预冻前检测冻干装液容器中总活芽孢量(5×107cfu)。分别将芽孢液置于-20℃、-40℃、-80℃冰箱中进行预冻，时间分别为0.5h、1.0h、2.0h和4.0h。在冷阱温度-45℃、真空度20Pa条件下，冷冻干燥8h得到戈氏梭菌驯化株芽孢冻干粉，计数芽孢数量。结果由表1可知，戈氏梭菌驯化株芽孢液预冻在-20℃、-40℃和-80℃条件下预冻0.5h芽孢数同预冻前相比下降较少，但预冻效果较差，呈黏液状，不利于后续真空冷冻干燥，其中以-80℃预冻效果为最好。与戈氏梭菌驯化株芽孢液预冻-20℃、-40℃预冻1h相比，虽-80℃预冻1h芽孢数量有所少量降低，但数量级仍为107，且芽孢液预冻完全，预冻物理状态要明显优于前两者。戈氏梭菌驯化株芽孢液预冻在-20℃、-40℃和-80℃条件下预冻2.0h和3.0h芽孢数量虽减少较少、预冻干效果好，但考虑到经济和时间节约的因素，不宜选择这两者。表1预冻温度及与预冻时间对芽孢数量的影响综上分析认为，戈氏梭菌驯化株芽孢液真空冷冻干燥过程为-80℃预冻1h，冷阱温度-45℃、真空度20Pa条件下冷冻干燥8h。实施例2研究方法：(1)对CEN-2Z细胞增殖的影响将不同终浓度的戈氏菌驯化株代谢产物冻干粉(0mg/ml、3mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、13mg/ml、17mg/ml和20mg/ml)分别与CEN-2Z细胞共培养24h后，进行MTT实验检测其对细胞增殖的剂量依赖性关系。每个浓度设6个复孔和设置调零孔。将终浓度为10mg/ml戈氏菌驯化株代谢产物冻干粉与CEN-2Z细胞分别共培养0h，6h，12h，18h，24h，48h进行MTT实验检测其对细胞增殖的时间依赖性关系。每组设6个复孔，每个时间设置调零孔。结果研究结果显示，随着作用时间和浓度的增加，细胞增殖抑制率逐渐增大，对细胞增殖抑制作用表现出显著的时间依赖性关系和剂量依赖性关系(如图1所述)。(2)对CEN-2Z细胞周期的影响将终浓度为10mg/ml戈氏梭菌驯化株代谢产物冻干粉和RCM(细菌培养液)分别与CEN-2Z共培养24h后，以细胞周期检测试剂盒进行流式细胞术检测实验组和对照组细胞DNA含量的变化以确定细胞所处周期阶段。结果与对照相比，10mg/ml戈氏梭菌驯化株代谢产物可使G2/M期细胞比例显著增高(0.29VS12.62)，可见其可将CEN-2Z细胞阻滞于放疗的敏感期-G2/M期(图2)。(3)对CEN-2Z细胞凋亡的影响将终浓度为10mg/ml戈氏梭菌驯化株代谢产物冻干粉与CEN-2Z分别共培养12h和24h后，以AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡试剂盒进行流式检测细胞凋亡的情况。结果与对照组相比，戈氏梭菌驯化株代谢产物与CEN-2Z作用12h后即可见到早起凋亡。作用24h后，CEN-2Z细胞出现较多晚期凋亡现象(表2)。结果表明，戈氏梭菌驯化株代谢产物对CEN-2Z细胞具有诱导凋亡作用。表2戈氏梭菌驯化株对CEN-2Z细胞凋亡的影响对照组12h24h细胞存活(％)98.4394.8590.16早期凋亡细胞(％)0.874.283.25后期凋亡(％)0.470.515.54综上所述，戈氏梭菌驯化株既可显著抑制CEN-2Z细胞增殖和诱导CEN-2Z细胞凋亡，又能将细胞周期阻滞于G2/M期，增加肿瘤细胞对放疗敏感性。实施例3研究方法：①荷瘤鼠模型建立采用细胞皮下注射法将鼻咽癌CEN-2Z细胞缓慢注入雌性Balb/c-nu/nu裸小鼠(5周龄，20g)右背部股外侧皮下处，待肿瘤体积长至300mm3时，进行体内试验。②动物分组与处理对照组：n＝10只(n代表每组的动物数量)，尾静脉注射PBS缓冲液0.2ml；戈氏梭菌驯化株芽孢组：n＝10只，第1天、第5天、第8天和第11天尾静脉注射戈氏梭菌驯化株芽孢，剂量为3.0×105cfu/(kg·bodyweight)。单独X-ray组：n＝10只，第4天、第7天、第10天、第13天放射治疗，1次/天，剂量400cGy/次。戈氏梭菌驯化株芽孢联合X-ray组：n＝10只，第1天尾静脉注射戈氏梭菌驯化株芽孢，剂量为3.0×105cfu/(kg·bodyweight)，第4天放疗，剂量400cGy。第5天尾静脉注射戈氏梭菌驯化株芽孢，剂量为3.0×105cfu/(kg·bodyweight)，第7天放疗，剂量400cGy。第8天尾静脉注射戈氏梭菌驯化株芽孢，剂量为3.0×105cfu/(kg·bodyweight)，第10天放疗，剂量400cGy。第11天尾静脉注射戈氏梭菌驯化株芽孢，剂量为3.0×105cfu/(kg·bodyweight)，第13天放疗，剂量400cGy。Docetaxel联合X-ray组：n＝10只，第4天、第7天、第10天和第13天腹腔注射Docetaxel，剂量为2.5mg/(kg·bodyweight)，6h后放射治疗1次，剂量400cGy/次。③检测指标以游标卡尺测量裸鼠移植瘤长径(a)和横径(b)，每周2～3次。④评价标准根据每次测量的肿瘤长径和横径数据计算肿瘤体积(V＝1/2×a×b2)，绘制曲线，动态观察肿瘤的变化。抑瘤率(％)＝(对照组平均瘤体积-实验组平均瘤体积)/对照组平均瘤体积×100％；肿瘤生长延缓(tumorgrowthdelay，TGD)＝治疗组肿瘤体积倍增时间-对照组肿瘤体积倍增时间；增强因子(EnhancementFactor，EF)＝(T细菌联合-T细菌)/(T放疗-T对照)。⑤结果与X-ray组相比，戈氏梭菌驯化株芽孢联合X-ray组抑瘤率(60.56％)显著高于单独放疗组(36.88％)和单独戈氏梭菌驯化株芽孢组(13.61％)，同时其抑瘤率高于Docetaxel联合X-ray组，但差异不显著(如表3所示)。同时肿瘤生长曲线显示，戈氏梭菌驯化株芽孢联合放疗后肿瘤体积整个观察过程小于戈氏梭菌驯化株和单独放疗组，也小于Docetaxel联合X-ray组肿瘤体积，并以后期最为明显(如图3所示)。当移植瘤肿瘤体积长至500mm3时，观察5组移植瘤肿瘤体积倍增(300mm3至500mm3)时间，并计算移植瘤生长延缓。研究结果显示，与对照组相比，戈氏梭菌驯化株芽孢组(剂量3.0×105cfu/(kg·bodyweight))肿瘤体积倍增时间(8.33vs9.17)、TGD(0vs0.84)和抑瘤率(0％vs13.61％)均无显著差异。但当戈氏梭菌驯化株芽孢与X-ray联合时，其肿瘤体积倍增时间(23.00vs15.17，p＝0.012)、TGD(14.67vs6.84)和抑瘤率(60.56％vs36.88％)均显著优于单独X-ray组。与对照组相比，戈氏梭菌驯化株芽孢联合X-ray组移植瘤生长延缓14.67d，超出了戈氏梭菌驯化株芽孢组与单独放疗组分别引起的移植瘤生长延缓之和(7.68d)(如表3所示)。戈氏梭菌驯化株芽孢联合X-ray组EF＝(23.00-9.17)/(15.17-8.33)＝2.02，即戈氏梭菌驯化株芽孢联合X-ray引起的移植瘤生长延缓是单独放疗的2.02倍(如表3所示)。与Docetaxel联合X-ray组相比，戈氏梭菌驯化株芽孢联合X-ray组肿瘤体积倍增时间(21.83vs23.00，p＝0.728)、TGD(14.67vs13.50)和抑瘤率(60.56％vs48.19％)等增敏指标均优于Docetaxel对放疗的增敏作用，但差别不显著(如表3所示)。如上分析可见，单独使用戈氏梭菌驯化株芽孢表现出一定的抗肿瘤作用，但其与放疗联合表现出显著增加放疗敏感性的作用。表3戈氏梭菌驯化株增敏指标检测注：与X-ray组相比，※p<0.05。实施例4研究方法：①荷瘤鼠模型建立采用细胞皮下注射法将鼻咽癌CEN-2Z细胞缓慢注入雌性Balb/c-nu/nu裸小鼠(5周龄，20g)右背部股外侧皮下处，待肿瘤体积长至300mm3时，进行体内试验。②动物分组与处理对照组：n＝8只(n代表每组的动物数量)，尾静脉注射PBS缓冲液0.2ml；单独X-ray组：n＝8只，第4天、第7天、第10天、第13天放射治疗，1次/天，剂量400cGy/次。戈氏梭菌驯化株芽孢-1组：n＝8只，第1天、第5天、第8天和第11天尾静脉注射戈氏梭菌驯化株芽孢，剂量为1.0×105cfu/(kg·bodyweight)。戈氏梭菌驯化株芽孢-2组：n＝8只，第1天、第5天、第8天和第11天尾静脉注射戈氏梭菌驯化株芽孢，剂量为2.0×105cfu/(kg·bodyweight)。戈氏梭菌驯化株芽孢-3组：n＝8只，第1天、第5天、第8天和第11天尾静脉注射戈氏梭菌驯化株芽孢，剂量为3.0×105cfu/(kg·bodyweight)。戈氏梭菌驯化株芽孢-4组：n＝8只，第1天、第5天、第8天和第11天尾静脉注射戈氏梭菌驯化株芽孢，剂量为4.0×105cfu/(kg·bodyweight)。戈氏梭菌驯化株芽孢-5组：n＝8只，第1天、第5天、第8天和第11天尾静脉注射戈氏梭菌驯化株芽孢，剂量为5.0×105cfu/(kg·bodyweight)。戈氏梭菌驯化株芽孢联合X-ray-1组：n＝8只，第1天、第5天、第8天、第11天尾静脉注射戈氏梭菌驯化株芽孢，剂量为1.0×105cfu/(kg·bodyweight)。第4天、第7天、第10天、第13天放射治疗，1次/天，剂量400cGy/次。戈氏梭菌驯化株芽孢联合X-ray-2组：n＝8只，第1天、第5天、第8天、第11天尾静脉注射戈氏梭菌驯化株芽孢，剂量为2.0×105cfu/(kg·bodyweight)。第4天、第7天、第10天、第13天放射治疗，1次/天，剂量400cGy/次。戈氏梭菌驯化株芽孢联合X-ray-3组：n＝8只，第1天、第5天、第8天、第11天尾静脉注射戈氏梭菌驯化株芽孢，剂量为3.0×105cfu/(kg·bodyweight)。第4天、第7天、第10天、第13天放射治疗，1次/天，剂量400cGy/次。戈氏梭菌驯化株芽孢联合X-ray-4组：n＝8只，第1天、第5天、第8天、第11天尾静脉注射戈氏梭菌驯化株芽孢，剂量为4.0×105cfu/(kg·bodyweight)。第4天、第7天、第10天、第13天放射治疗，1次/天，剂量400cGy/次。戈氏梭菌驯化株芽孢联合X-ray-5组：n＝8只，第1天、第5天、第8天、第11天尾静脉注射戈氏梭菌驯化株芽孢，剂量为5.0×105cfu/(kg·bodyweight)。第4天、第7天、第10天、第13天放射治疗，1次/天，剂量400cGy/次。③检测指标以游标卡尺测量裸鼠移植瘤长径(a)和横径(b)，每周2～3次。④评价标准抑瘤率(％)＝(对照组平均瘤体积-实验组平均瘤体积)/对照组平均瘤体积×100％。肿瘤生长延缓(tumorgrowthdelay，TGD)＝治疗组肿瘤体积倍增时间-对照组肿瘤体积倍增时间增强因子(EnhancementFactor，EF)＝(T细菌联合-T细菌)/(T放疗-T对照)⑤结果与对照组相比，单独戈氏梭菌驯化株芽孢各组的抑瘤率、肿瘤体积倍增时间、TGD未见明显差异，且单独戈氏梭菌驯化株芽孢各组之间也未见明显差异。可见，单独1.0×105～5.0×105cfu/(kg·bodyweight)的戈氏梭菌驯化株芽孢剂量抗肿瘤作用不明显。但当1.0×105～5.0×105cfu/(kg·bodyweight)剂量的戈氏梭菌驯化株芽孢分别联合放疗时均表现出显著抗肿瘤作用，抑瘤率、肿瘤体积倍增时间、TGD均显著优于单独X-ray组，并且抑瘤率、TGD超过了各剂量戈氏梭菌驯化株芽孢组与单独放疗组之和，表现出叠加增效的超敏作用(如表4所示)。1.0×105～5.0×105cfu/(kg·bodyweight)戈氏梭菌驯化株芽孢联合放疗引起的肿瘤生长延缓均大于单独X-ray的1.55倍(如表4所示)，各剂量组均表现出显著增敏作用。以抑瘤率、肿瘤体积倍增时间、TGD、EF和经济节约为指标综合评价，研究认为1.0×105～5.0×105cfu/(kg·bodyweight)戈氏梭菌驯化株芽孢是联合放疗增敏的优选范围，其中以3.0×105cfu/(kg·bodyweight)剂量戈氏梭菌驯化株芽孢联合放疗为戈氏梭菌驯化株增加鼻咽癌对放疗敏感性的最优剂量。表4不同剂量戈氏梭菌驯化株增敏指标检测注：与X-ray组相比，※p<0.05。实施例5研究方法：①荷瘤鼠模型建立采用细胞皮下注射法将鼻咽癌CEN-2Z细胞缓慢注入雌性Balb/c-nu/nu裸小鼠(5周龄，20g)右背部股外侧皮下处，待肿瘤体积长至300mm3时，进行戈氏梭菌驯化株体内分布试验。②组织培养与组织石蜡切片的Gramstain尾静脉注射DCG芽孢96h后脱颈处死荷瘤鼠，将处死的荷瘤鼠置75％乙醇溶液中杀菌1min。取荷瘤鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏(2个)和肿瘤组织，并将上述脏器均分为两份，其中一份以10ml/g固液比加入无菌PBS，迅速将组织研磨为匀浆液，操作过程严格无菌。分别取上述组织匀浆液300μl均匀涂布RCM-Agar培养基上中，37℃厌氧培养96h，记录各组织脏器细菌生长状况，并对菌落进行Gram染色观察。另一份以中性福尔马林缓冲液固定后，进行4μm石蜡切片制作，并对切片进行Gramstain和40×显微观察，检测细菌在上述主要脏器组织及肿瘤中的分布。结果小鼠主要脏器及肿瘤组织匀浆后37℃厌氧培养发现，尾静脉注射戈氏梭菌驯化株芽孢96hs后仅在肿瘤组织匀浆液对应的RCM-Agar培养基中出现圆形，白色，表面稍粘，湿润，不透明菌落(图4)，其菌落形态与戈氏梭菌驯化株菌落相同，并经Gramstain检测后确定为戈氏梭菌驯化株。小鼠主要脏器及肿瘤组织石蜡切片进行Gramstain和40X显微观察，发现仅在肿瘤组织中存在大量呈杆状、G+的戈氏梭菌驯化株(图5)，而其他主要脏器组织未发现该细菌存在。该研究结果与组织匀浆方法结果相吻合。由上述两种检测方法结果可以看出，戈氏梭菌驯化株作为增敏剂可特异性分布于肿瘤组织中，而目前放疗增敏药物均为化学药物或中药，经静脉给药后会全身分布并对正常组织细胞产生危害，无组织分布特异性。可见，戈氏梭菌驯化株作为增敏剂表现出显著优势。实施例6研究方法：①荷瘤鼠模型建立采用细胞皮下注射法分别将恶性黑色素瘤A375、鼻咽癌CEN-2Z和人结肠癌细胞HCT116细胞缓慢注入雌性Balb/c-nu/nu裸小鼠(5周龄，20g)右背部股外侧皮下处，待肿瘤体积长至300mm3时，进行体内试验。②动物分组与处理CEN-2Z对照组：n＝6只(n代表每组的动物数量)，尾静脉注射PBS缓冲液0.2ml；CEN-2Z单独芽孢组：n＝6只，第1天、第5天、第8天和第11天尾静脉注射戈氏梭菌驯化株芽孢，剂量为3.0×105cfu/(kg·bodyweight)(0.2ml)。CEN-2Z单独X-ray组：n＝6只，第4天、第7天、第10天、第13天放射治疗，1次/天，剂量400cGy/次。CEN-2Z芽孢联合X-ray组：n＝6只，第1天、第5天、第8天、第11天尾静脉注射戈氏梭菌驯化株芽孢，剂量为3.0×105cfu/(kg·bodyweight)(0.2ml)。第4天、第7天、第10天、第13天放射治疗，1次/天，剂量400cGy/次。③检测指标以游标卡尺测量裸鼠移植瘤长径(a)和横径(b)，每周2～3次。④评价标准根据每次测量的肿瘤长径和横径数据计算肿瘤体积(V＝1/2×a×b2)。抑瘤率(％)＝(对照组平均瘤体积-实验组平均瘤体积)/对照组平均瘤体积×100％。肿瘤生长延缓(tumorgrowthdelay,TGD)＝治疗组肿瘤体积倍增时间-对照组肿瘤体积倍增时间增强因子(EnhancementFactor，EF)＝(T细菌联合-T细菌)/(T放疗-T对照)戈氏梭菌驯化株芽孢影响黑色素瘤A375细胞和人结肠癌HCT116细胞对放疗敏感性的动物分组与处理、检测指标和评价标准均同鼻咽癌CEN-2Z的研究。⑤结果表5戈氏梭菌驯化株对不同肿瘤模型的增敏指标检测研究结果显示，戈氏梭菌驯化株芽孢联合X-ray对三个不同肿瘤模型的抑瘤率表现出：CEN-2Z芽孢联合X-ray组>HCT116芽孢联合X-ray组>A375芽孢联合X-ray组(62.11vs54.55vs46.58)(如表5所示)。同时，CEN-2Z芽孢联合X-ray组肿瘤体积倍增时间显著长于A375芽孢联合X-ray组，但与HCT116芽孢联合X-ray组肿瘤体积倍增时间无显著差异(如表5所示)。TGD亦以CEN-2Z芽孢联合X-ray组为最佳，高于其他两组戈氏梭菌驯化株芽孢联合X-ray组，表现为CEN-2Z芽孢联合X-ray组>HCT116芽孢联合X-ray组>A375芽孢联合X-ray组(14.77vs11.50vs8.50)(如表5所示)。戈氏梭菌驯化株芽孢联合X-ray对三个不同肿瘤模型延缓时间分别是单独放疗的2.04倍、1.3倍和1.5倍。综上所述可见戈氏梭菌驯化株表现出特异性增加鼻咽癌模型对放疗敏感性的作用。当前第1页1 2 3