一种具有改善胃肠道功能紊乱作用的复合物的制作方法

技术领域

本发明属于功能食品和生物医药领域，具体涉及用于改善腹泻致胃肠道功能紊乱的口服制剂。

背景技术：

胃肠道功能是否正常直接影响食物中营养成分的消化吸收，对维持人体各器官的正常功能至关重要。不洁饮食、不良的饮食习惯、烟酒及药物等，都可导致腹泻、胃肠道功能紊乱，给患者带来痛苦，损害人体健康。目前防治腹泻的药物多为止泻药、抗菌药物，存在疗效不佳、副作用大、易产生耐药性等问题。为了避免此类现象的发生，市场需要研制开发来源于天然、效果显著、无明显不良反应的防治腹泻和改善胃肠道功能的新型口服制剂，以减轻患者的痛苦。长期腹泻致胃肠道功能紊乱患者众多，因此开发此类制剂产品具有良好的应用前景，是十分有益和必要的。

凹凸棒是一种晶质层链状结构含水镁铝硅酸盐的粘土矿物，由于本身独特的微观结构、外貌以及荷电性质，凹土棒具有许多优良性能，如胶体性、吸附性、抗菌性和粘结性等，因而被广泛应用于化工、医药、农业和环保等领域。凹凸棒粉末具有吸附、清除多种致病因子的能力。当凹凸棒粉末进入胃肠道后，可覆盖在胃肠粘膜表面，从而修复和稳定胃肠粘膜屏障，对消化道粘膜屏障具有修复保护作用；因凹凸棒能够吸附消化道内细菌、病毒及其产生的毒素，从而达到抑制细菌增殖、阻止微生物扩散、抑制炎症反应的作用。在美国凹凸棒以口服OTC的形式用于腹泻的治疗。凹凸棒因其结构的特殊性，可作为无机物或有机物的载体，凹凸棒作为载体的研究，大多数是在凹凸棒层间嵌入无机物，作为有机物载体的研究极少。

生姜是一种常用的调味料，也是传统的药食同源的保健植物资源，具有祛寒祛湿、暖胃健胃、舒筋活血、抗炎等多种作用。生姜精油含有多种具有营养保健作用的物质，如姜醇、姜酮、姜烯、姜酚类化合物，姜精油在食品、化妆品、保健品、药品等领域具有十分广泛的应用。姜精油是指从姜根茎中得到的挥发性油分，呈棕色透明油状液体，具有抗菌抗炎、保肝利胆等药理作用。姜精油中最丰富的活性成分是6-姜酚，存在不耐热、不耐酸碱、容易挥发等稳定性不佳的特点。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种具有改善胃肠道功能紊乱作用的复合物，为凹凸棒粉末与姜精油经化学反应生成的凹凸棒姜精油复合物，既可发挥凹凸棒的吸附、修复功能，将致病微生物集中，有利于姜精油抗菌作用的发挥、提高抗菌性能，又可提高姜精油的稳定性。

所述凹凸棒粉末与姜精油的质量比为10：0.1-2。

所述凹凸棒粉末，选择凹凸棒晶体含量大于50%、碳酸盐含量小于10%的凹凸棒粘土矿石类型，将凹凸棒粘土矿石研磨至100-320目；所述姜精油由生姜中提取，其中姜酚含量大于20%。

本发明还公开了所述凹凸棒姜精油复合物的制备工艺：

（1）凹凸棒的活化：a、取凹凸棒粉末加入含有20%盐酸的烧杯中，用塑料薄膜密封，60℃水浴磁力搅拌10h，反应溶液颜色由浅黄色逐渐变为深黄色；

b、10000rpm离心，除去上清液，去离子水洗涤沉淀多次，至上清液pH值至中性、颜色透明；

c、将上述反复水洗后的沉淀加入10%氯化钠溶液中，超声形成悬浮体系，再60℃水浴磁力搅拌10h；

d、10000rpm离心，取上层浅灰色固体，电热恒温鼓风干燥箱中70℃干燥至恒重，研磨后过100-320目筛。

（2）姜精油的制备：取生姜，去皮洗净切片，干燥后粉碎。生姜粉加70%乙醇回流提取2次，第一次加10倍量，提取90min；第2次加8倍量，提取60min，合并乙醇提取液，过滤，滤液减压浓缩蒸尽乙醇，得姜精油，采用HPLC法测定6-姜酚含量。

（3）凹凸棒姜精油复合物的制备：首先，取活化后的凹凸棒粉末加入去离子水中，超声分散形成悬浮体系；取姜精油溶解于无水乙醇中，再加入到凹凸棒粉末悬浮体系中，在磁力搅拌器上在温度30-90℃下搅拌2-3h；然后，10000rpm离心分离后得到沉淀，并收集上清液；沉淀以50%乙醇溶液洗涤后再离心，再次收集上清液；最后，将上述洗涤后的沉淀置于电热恒温鼓风干燥箱中60℃下干燥，研磨过200目筛，最终复合物的粒径50-100μm。

所述凹凸棒姜精油复合物可与赋形剂混合制成散剂或胶囊剂。

HPLC法测收集上清液中6-姜酚含量，计算6-姜酚与凹凸棒的结合率：E=(C₀V₀-C₁V₁)/M×100%。其中E（%）为6-姜酚与凹凸棒石的结合率；C₀ 和 C₁ (mg/mL)分别为6-姜酚的初始浓度和收集上清液中的浓度；V₀ 和 V₁ (mL) 分别为初始溶液和收集上清液体积；M（mg）为活化的凹凸棒粉末质量。

采用单因素和响应面试验法，对制备工艺过程中的反应条件进行优化。考察凹凸棒粉末与姜精油的反应时间、6-姜酚初始浓度、反应温度三种因素，确定最优的反应条件。考察的反应时间分别为30 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180min；6-姜酚初始浓度为60 mg·mL^-1、120 mg·mL^-1、180 mg·mL^-1、240 mg·mL^-1、300 mg·mL^-1；反应温度分别为30℃、45℃、60℃，75℃、90℃。试验结果表明，反应时间120 min-180min、6-姜酚初始浓度180-240 mg·mL^-1、反应温度分别为75℃-90℃为最佳反应条件。所得凹凸棒姜精油复合物为淡黄色粉末固体，其中6-姜酚含量约为1%。

对所得凹凸棒姜精油复合物进行一系列的表征研究，试验结果如下：

红外光谱（FTIR）分析：FTIR图谱见图1。凹凸棒姜精油复合物具有凹凸棒在1089cm^-1，3413cm^-1，3548cm^-1和3613cm^-1处的特征吸收峰，也具有姜精油在1517cm^-1，2927cm^-1和2856cm^-1处的特征吸收峰；表明姜精油已经结合在凹凸棒结构上。

X射线光电子能谱（XPS）分析：XPS扫描光谱见图2、图3。Si2p，C1s，O1s，Mg1s的信号分别出现在102eV，284eV，532eV，1303eV。与凹凸棒X射线光电子能谱相比，凹凸棒姜精油复合物表面的元素Si、O和Mg含量分别下降了4.78%，18.28%和0.45%，可能是由于姜精油在凹凸棒表面的覆盖。姜精油主要活性成分6-姜酚，分子式C₁₇H₂₆0₄，碳元素含量大；凹凸棒姜精油复合物表面碳元素含量增加了24%，说明凹凸棒表面引入了含碳原子的官能团，XPS分析证明姜精油和凹凸棒的结合。

热重（TG）分析：热失重曲线见图4，凹凸棒、凹凸棒姜精油复合物在不同温度范围内的质量损失比率见表1。热失重曲线显示凹凸棒、凹凸棒负载姜精油复合物有四个不同的脱水过程：分别归因于去除表面吸附水和沸石水（30℃-100℃）、剩余的沸石水和部分结构水（100℃-300℃）、残留的结构水（300℃-700℃）、Mg-OH基团的脱羟基(700℃-800℃)。在100℃-700℃，凹凸棒质量损失率明显低于凹凸棒姜精油复合物，主要由于姜精油的氧化分解。根据失重率的差异，可估算凹凸棒姜精油复合物中姜精油的含量约为18.66%。通过热重分析，再次证明姜精油与凹凸棒的结合。

表1 凹凸棒、凹凸棒姜精油复合物在不同温度范围内的质量损失比率（%）

场发射扫描电子显微镜（SEM）分析：SEM 图谱见图5。凹凸棒、凹凸棒姜精油复合物由棒晶紧密的平行聚集而成晶束，棒晶束间又相互聚集形成聚集体，图中（a）表示凹凸棒，（b）表示复合物。图5-1a, 1b（×1000）可见，凹凸棒姜精油复合物外观规整化程度明显提高，粒径明显增大，轮廓变圆滑，毛刺明显减少。图5-2a, 2b（×20000）可见，凹凸棒姜精油复合物团聚成不规则形态，边缘模糊化，比表面积减小，可能是由于姜精油的负载使得复合物的排斥力减小。图5-3a, 3b（×100000）可见，凹凸棒姜精油复合物清晰度明显降低，表面图像模糊，导电性变差，表明有机物的负载。因此，通过场发射扫描电子显微镜的观察分析，凹凸棒已经负载姜精油，并在形态上发生了变化。

本发明通过凹凸棒与姜精油化学复合形成新的复合物具有协同增强药效的优势，更好地提高了各自的功能、克服了各自的不足之处；并具有保护胃肠道黏膜、调理胃肠道功能、抗菌抗炎的作用；疗效显著，使用安全，作用优于市场上常用的药剂产品，具有良好的临床应用前景。

附图说明

图1为本发明凹凸棒、姜精油及其复合物的红外光谱图；

图2为本发明凹凸棒的X射线光电子能谱图；

图3为本发明凹凸棒姜精油复合物的X射线光电子能谱图；

图4为本发明凹凸棒与复合物的热失重曲线；

图5为本发明凹凸棒与复合物的SEM图；

图6为本发明实现小鼠的小肠黏膜组织病理组织学显微观察图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步地描述。

实施例1：

凹凸棒的活化：选择凹凸棒晶体含量大于50%、碳酸盐含量小于10%的凹凸棒粘土矿石类型，将凹凸棒粘土研磨至200目。a、取凹凸棒粉末，加入含有20%盐酸的烧杯中，用塑料薄膜密封，60℃水浴磁力搅拌10h。b、10000rpm离心，除去上清液，用去离子水洗涤沉淀多次，至上清液pH值至中性、颜色透明。c、将上述多次水洗后的沉淀加入10%氯化钠溶液中，超声形成悬浮体系；60℃水浴磁力搅拌10h。d、10000rpm离心，取上层浅灰色固体，电热恒温鼓风干燥箱中70℃干燥至恒重，研磨后过200目筛。

姜精油的制备如下：取生姜，去皮洗净切片，干燥后粉碎。生姜粉加70%乙醇回流提取2次，第一次加10倍量，提取90min；第2次加8倍量，提取60min，合并乙醇提取液，过滤，滤液减压浓缩蒸尽乙醇，得姜精油。本品性状为：浅黄色油状物，有辛辣味，溶于醇，不溶于水。6-姜酚含量测定：采用HPLC法。用无水乙醇（色谱纯）将姜精油溶解，过滤。在柱温：室温；流动相：乙腈-甲醇-水（40：5：55）；流速0.8ml/min；进样量：20μl；检测波长280nm。根据标样的保留时间进行定性，用外标法计算6-姜酚的含量。本品6-姜酚含量为235.62mg/g。

凹凸棒姜精油复合物的制备：取活化后的凹凸棒粉末100g加入去离子水中，超声分散形成悬浮体系。取姜精油10g溶解于无水乙醇中，再加入到凹凸棒粉末悬浮体系中，75℃下磁力搅拌120 min。10000rpm离心分离后得到沉淀，收集上清液。沉淀以50%乙醇溶液洗涤后再离心，再次收集上清液。将上述洗涤后的沉淀置于电热恒温鼓风干燥箱中60℃下干燥，研磨过200目筛。所得凹凸棒姜精油复合物为淡黄色粉末固体。

散剂的制备：按散剂制备工艺制备散剂。每袋含本发明凹凸棒姜精油复合物2g。

实施例2：

选择凹凸棒晶体含量大于50%、碳酸盐含量小于10%的凹凸棒粘土矿石类型，将凹凸棒粘土研磨至100目。

凹凸棒姜精油复合物的制备：取活化后的凹凸棒粉末100g加入去离子水中，超声分散形成悬浮体系。取姜精油1g溶解于无水乙醇中，再加入到凹凸棒粉末悬浮体系中，90℃下磁力搅拌150min。10000rpm离心分离后得到沉淀，收集上清液。沉淀以50%乙醇溶液洗涤后再离心，再次收集上清液。沉淀置于电热恒温鼓风干燥箱中60℃下干燥，研磨过200目筛。所得凹凸棒姜精油复合物为淡黄色粉末固体。

胶囊剂的制备，按胶囊剂制备工艺制备胶囊剂。每粒含本发明凹凸棒姜精油复合物500mg。

其它同实施例1。

实施例3：

选择凹凸棒晶体含量大于50%、碳酸盐含量小于10%的凹凸棒粘土矿石类型，将凹凸棒粘土研磨至320目。

凹凸棒姜精油复合物的制备：取活化后的凹凸棒粉末100g加入去离子水中，超声分散形成悬浮体系。取姜精油20g溶解于无水乙醇中，再加入到凹凸棒粉末悬浮体系中，30℃下磁力搅拌180min。离心10000rpm分离后得到沉淀，收集上清液。沉淀以50%乙醇溶液洗涤后再离心，再次收集上清液。沉淀置于电热恒温鼓风干燥箱中60℃下干燥，研磨过200目筛。所得凹凸棒姜精油复合物为淡黄色粉末固体。

散剂的制备：按散剂制备工艺制备散剂。每袋含本发明凹凸棒姜精油复合物2g。

其它同实施例1。

每日口服剂量，散剂服用方法为每日3次，每次0.5-1袋，温开水冲服；胶囊剂服用方法为每日3次，每次2-4粒。7天为一疗程。

用以上方法制成的口服制剂，进行相关的药效学试验和安全性评价试验。下面是本发明的动物实验数据：

大肠杆菌菌悬液的制备：将大肠杆菌接种于LB培养基中，37℃气浴恒温振荡器上振荡培养12 h后，将液体培养基离心得到沉淀，用灭菌生理盐水冲洗菌落2次，离心后再用灭菌生理盐水制成大肠杆菌菌悬液，根据平板计数法分别配制浓度为2×10⁷CFU/mL、2×10⁸CFU/mL、2×10⁹ CFU/mL、2×10¹⁰ CFU/mL细菌悬液，4℃保存备用。

建立大肠杆菌感染动物腹泻模型：小鼠实验前12h禁食、自由饮水。腹腔注射相应浓度的菌液，注射体积为0.5mL，对照组腹腔注射等体积的无菌生理盐水。小鼠出现明显的腹泻症状、水样便、精神萎靡、行动迟缓等表明模型建立成功。

试验设计：小鼠80只，雌雄各半，体重30g±2g，分8组，每组10只，分别为正常对照组、模型对照组、阳性对照组、本发明高剂量组、中剂量组、低剂量组、凹凸棒组、姜精油组。阳性对照组小鼠造模后4h口服蒙脱石散1g/kg，本发明高剂量组、中剂量组、低剂量组小鼠造模后4h口服本发明凹凸棒石姜精油复合物600、300、100mg/kg，凹凸棒组小鼠造模后4h口服凹凸棒600mg/kg。姜精油组小鼠造模后4h口服姜精油125mg/kg。每天1次，连续6天。

检测指标：

每天定时称量各组小鼠体重，并计算小鼠摄食量。

腹泻指标：将小鼠放入铺有滤纸的鼠笼内，观察小鼠腹泻情况。计算腹泻率：每组动物中排稀便的动物数占该组动物总数的百分比。

病理组织学观察：取小肠组织，福尔马林溶液固定，常规取材，系列乙醇脱水，石蜡包埋后常规制片（4μm），HE染色，在光学显微镜下观察小肠黏膜组织病理学变化并摄片（200×）。

动物实验结果如下表2-4所示：

表2 对小鼠体重的影响

表3 对小鼠摄食量的影响

表4 对小鼠腹泻率的影响

结果表明，与正常对照组相比，模型对照组小鼠体重、摄食量明显降低，腹泻率明显升高。本发明凹凸棒石姜精油复合物可明显恢复腹泻小鼠的体重和摄食量，降低腹泻率，促进小鼠的康复。图6病理组织学观察结果表明，图中A正常对照组；B模型对照组；C阳性对照组；D本发明低剂量组；E本发明中剂量组；F本发明高剂量组；G凹凸棒组；H姜精油组；显微镜下观察模型组小鼠小肠绒毛明显萎缩、断裂、脱落，杯状细胞数量增多，绒毛尖端膨胀和绒毛基部缩小，空泡化显著，上皮细胞明显脱落；本发明组小鼠小肠绒毛结构清晰，排列整齐紧密，黏膜完整，上皮细胞完整紧致。说明本发明具有调理胃肠道功能、抗菌抗炎、对肠黏膜具有明显的保护作用；且作用优于阳性对照、凹凸棒或姜精油单用。说明凹凸棒与姜精油两者复合具有协同增强药效的作用。

本发明经急性毒性试验结果表明，小鼠灌胃给本发明一日最大给药量（MTD）为21.5g/kg，相当于有效剂量72倍；动物未出现任何不良反应。说明本发明产品安全，几乎无毒副反应。