一种接枝胰岛素和没食子酸的羟基磷灰石纳米口服体系的制备方法与应用与流程

本发明属于生物医药材料领域。更具体地，涉及一种接枝胰岛素和没食子酸的羟基磷灰石纳米口服体系的制备与应用。

背景技术：

糖尿病(Diabetes mellitus，DM)：糖尿病是一种以高血糖为特征的代谢性疾病。高血糖则是由于胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损，或两者兼有引起。糖尿病时长期存在的高血糖，导致各种组织，特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害、功能障碍。糖尿病是当前威胁全世界人类健康最重要的慢性非传染性疾病之一。截止2014年11月，全球患者人数已达3.82亿。糖尿病是一种多基因遗传性疾病，胰岛素分泌不足和胰岛素抵抗是其主要的病理特征。常用的治疗糖尿病方法：药物治疗以化学合成药为主，体外补充治疗以胰岛素注射为主。其中化学药物治疗糖尿病的方式会因为其长期服用对人体有巨大的副作用。到目前为止，皮下注射给药是胰岛素最主要的给药途径。尽管大量的事实证明这种给药方式是很有效的，但却导致局部胰岛素过多症，刺激平滑肌细胞增殖，使葡萄糖转化成动脉壁的脂类物质等。另外，心理压力、生理的不良影响、痛苦、不便、高昂的费用、危险、感染疾病、对胰岛素的依赖、在胰岛素注射部位由于胰岛素局部沉淀而导致的局部肥大以及脂肪沉淀都是长期注射固有的缺点。

尽管胰岛素体外补充除皮下注射以外还有肺吸入式、胰岛素泵和口服等方式，因为口服胰岛素能模拟体内胰岛素代谢并能提供一个较稳定的葡萄糖内环境，同时这也能减轻外周高胰岛素血症的发病率以及神经病等并发症。在过去的几十年中对于克服常规口服胰岛素的缺点和限制做了各种不同的尝试。主要集中在口服胰岛素的研制取得成功将要克服酶的降解、提高上皮细胞的渗透率以及在处理加工中保存药物的生物活性等方面。

口服胰岛素的研究策略：1.吸收促进剂和酶解抑制剂：吸收促进剂是通过提高药物的跨细胞转运来改善药物的吸收。胰岛素能被消化道内各种酶降解，而使用酶抑制剂可以减慢胰岛素的降解速率。2.化学修饰，化学修饰是蛋白质类药物口服的重要研究课题之一。化学修饰可以改变蛋白质分子的大小、电荷和受体结合能力，从而降低蛋白质药物的体内清除速率，通过修饰基团形成的空间位阻保护易受蛋白水解酶进攻的区域，延缓活性蛋白的降解，有效保持其生物活性。3.乳剂：乳剂制备工艺简单，可以有效地保护胰岛素不被胃肠道酶降解，可作为胰岛素口服给药的载体。目前胰岛素乳剂的研究包括普通乳、复乳、微乳等。4.载体包裹：载体包裹蛋白质多肽药物，可以保护其不被消化道内蛋白质多肽水解酶的降解，同时将蛋白质多肽药物与药物载体一起经消化道吸收进入血液。5.壳聚糖载体。6.脂质体。7.合成类聚合物：水凝胶和囊泡等。

虽然口服胰岛素的方式对于糖尿病患者是最佳的选择，但是如何找到一种方法简单、稳定性好、毒性小、成分天然、生物相容性好、载药率、释放率高、吸收效果好以及对糖尿病并发症有一定作用的口服药物目前还是一个难题。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是克服现有口服胰岛素的缺陷和技术不足，通过合成HAP-PEG粒子，制备搭载胰岛素和没食子酸的纳米口服输运系统，不仅细胞能够吸收，在有效的解决胰岛素口服输运的载体毒性问题的同时，能够有效控制糖尿病患者的血糖。

本发明的目的是提供一种接枝胰岛素和没食子酸的羟基磷灰石纳米口服体系的制备方法。

本发明另一目的所述接枝胰岛素和没食子酸的羟基磷灰石纳米口服体系的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种接枝胰岛素和没食子酸的羟基磷灰石纳米口服体系的制备方法，首先合成具有多孔表面形貌的羟基磷灰石(HAP)纳米粒，然后将PEG紧紧包裹住HAP表面，再将没食子酸(GA)连接到PEG的羟基上，最后将胰岛素连接在PEG表面，得到搭载胰岛素和没食子酸的纳米口服输运系统，即HAP-PEG-GA-INS纳米粒。

具体地，是首先以硝酸钙和磷酸氢二胺为原料通过反相微乳法分别合成具有多孔表面形貌的羟基磷灰石(HAP)纳米粒，紧接着通过羟基之间的氢键作用将PEG紧紧包裹住HAP表面，然后以DCC和DMAP催化酯化反应为原理，将没食子酸(GA)连接到PEG的羟基上，再用丁二酸酐将PEG羧基化，最后以EDC和NHS催化酰胺反应为原理，将胰岛素连接在PEG表面，得到搭载胰岛素和没食子酸的纳米口服输运系统，即HAP-PEG-GA-INS纳米粒。

更具体地，作为优选的可实施方案上，上述接枝胰岛素和没食子酸的羟基磷灰石纳米口服体系的制备方法，包括如下步骤：

S1.制备羟基磷灰石纳米粒(HAP纳米粒)：

S11.将Ca(NO₃)₂·₄H₂O和(NH₄)₂HPO₄分别溶于超纯水，分别用氨水调pH至10～12，再加入到混合体系中；将得到的两种溶液混合反应15～25min形成透明微乳；

所述混合体系为曲拉通X-100：环己烷：正丁醇的体积比＝7～9：27～29：2～4的体系；

S12.将无水乙醇添加到混合微乳中破乳，离心除去环己烷和曲拉通X-100(表面活性剂)，用无水乙醇再洗涤2～3次，烘干，得到HAP纳米粒；

S2.聚乙二醇(PEG)包裹HAP纳米粒：

将PEG和HAP纳米粒混合磁力搅拌，使PEG对HAP进行均匀包裹；然后离心、用超纯水洗2～3次(优选3次)后，冷冻干燥，既得PEG包裹的HAP纳米粒(HAP-PEG)；

S3.HAP-PEG纳米粒表面连接没食子酸(GA)和胰岛素(INS)：

S31.将GA和HAP-PEG纳米粒溶于二氯甲烷中，然后加入DMAP和DCC，混合搅拌24h，过滤副产物，乙酸乙酯萃取，蒸馏水洗至中性，冷冻干燥，减压蒸去有机溶剂，得到搭载GA的HAP-PEG纳米粒，即HAP-PEG-GA纳米粒；

S32.将HAP-PEG-GA纳米粒和丁二酸酐混合，氯仿为溶剂，DMAP为催化剂，50～70℃恒温反应40～50h，真空抽出部分溶剂，用无水乙醚沉析，抽滤后洗涤，35～45℃真空干燥40～50h，HAP-PEG-GA纳米粒中的PEG被羧基化；

S33.将PEG被羧基化的HAP-PEG-GA纳米粒、EDC和NHS混合加入蒸馏水中，pH调至5～6，冰浴20～40min并不断调整pH后，加入胰岛素混合搅拌20～25h，超纯水洗2～3次(优选3次)，冷冻干燥，即得HAP-PEG-GA-INS纳米粒。

其中，优选地，步骤S11所述Ca(NO₃)₂·₄H₂O和(NH₄)₂HPO₄的摩尔比为1.5～1.8mol：1mol。

更优选地，步骤S11所述Ca(NO₃)₂·₄H₂O和(NH₄)₂HPO₄的摩尔比为1.67mol：1mol。

优选地，步骤S11所述混合体系为曲拉通X-100：环己烷：正丁醇的体积比＝8：28：3的体系。

优选地，步骤S11所述pH均调至11。

优选地，步骤S11所述pH用氨水进行调节。

优选地，步骤S11所述混合反应的时间为20min。

优选地，步骤S12所述无水乙醇和混合微乳的体积比为14～16：37～40。

更优选地，S12所述无水乙醇和混合微乳的体积比为15：39。

优选地，步骤S12所述离心是10000～13000g离心10～20min。

更优选地，步骤S12所述离心是12000g离心15min。

优选地，步骤S12所述烘干是70～85℃烘干3～5h。

更优选地，步骤S12所述烘干是80℃烘干4h。

优选地，步骤S2所述PEG和HAP纳米粒的质量比为0.1～1.5：0.1～1.5。

更优选地，步骤S2所述PEG和HAP纳米粒的质量比为1：1。

优选地，步骤S2所述磁力搅拌的时间为12～24h。

优选地，步骤S2所述离心是4000～6000r/min、8～15℃条件下离心20～40min。

更优选地，步骤S2所述离心是5000r/min、10℃条件下离心30min。

优选地，步骤S31所述GA和HAP-PEG纳米粒的质量比1：1～3。

更优选地，步骤S31所述GA和HAP-PEG纳米粒的质量比1：2。

优选地，步骤S31所述GA和HAP-PEG纳米粒的总量与二氯甲烷的质量体积比为1～2mg/ml。

更优选地，步骤S31所述GA和HAP-PEG纳米粒的总量与二氯甲烷的质量体积比为1.5mg/ml。

优选地，步骤S31所述DMAP和DCC的摩尔比为0.01～0.015：0.15。

更优选地，步骤S31所述DMAP和DCC的摩尔比为0.025：0.3。

优选地，步骤S32所述HAP-PEG-GA纳米粒和丁二酸酐的用量比按照PEG和丁二酸酐的摩尔比为1：4～6进行。

更优选地，步骤S32所述HAP-PEG-GA纳米粒和丁二酸酐的用量比按照PEG和丁二酸酐的摩尔比为1：5进行。

优选地，步骤S33所述PEG被羧基化的HAP-PEG-GA纳米粒：EDC：NHS的摩尔比为0.1～2：0.1～2：0.1～2。

更优选地，步骤S33所述PEG被羧基化的HAP-PEG-GA纳米粒：EDC：NHS的摩尔比为1：1：1。

优选地，步骤S32所述恒温反应的条件为60℃恒温反应48h。

优选地，步骤S32所述真空干燥是40℃真空干燥48h。

优选地，步骤S33所述pH调至5.6。

优选地，步骤S33所述冰浴30min。

优选地，步骤S33所述混合搅拌24h。

优选地，步骤S33所述冷冻干燥的时间为1～3h。

更优选地，步骤S33所述冷冻干燥的时间为2h。

另外，由上述方法制备得到的接枝胰岛素和没食子酸的羟基磷灰石纳米口服体系，也在本发明的保护范围之内。

制备得到的接枝胰岛素和没食子酸的羟基磷灰石纳米口服体系在制备糖尿病治疗药物方面的应用，以及在作为或制备胰岛素口服制剂方面的应用，也都应在本发明的保护范围之内。

本发明将无毒、生物可降解和生物相容性好的羟基磷灰石作为口服药物的本底粒子，通过聚乙二醇包裹改性，增强其在胃肠环境的耐受程度，并且将胰岛素和没食子酸接枝到聚乙二醇表面，使其通过HAP-PEG这种载体粒子，共同输运进入人体消化道，并且研究其在肠道中的吸收以及控制血糖的效果。一系列表征证明，目前聚乙二醇包裹羟基磷灰石纳米粒，再接枝胰岛素和没食子酸的纳米粒子合成成功。通过胰岛素和没食子酸的接枝率和释放率的检测，证明胰岛素和没食子酸成功接枝，并且能在胃肠环境中释放，Caco-2细胞毒性试验显示其低细胞毒性，并且能够吸收进入细胞。同时进行的STZ大鼠降糖实验显示其在灌喂HAP-PEG-GA-GA纳米粒子以后在0-9小时都有一定的降糖效果。这为胰岛素口服输运和糖尿病口服药物治疗方面提供了新的思路。

羟基磷灰石(HAP)，又称羟磷灰石，碱式磷酸钙，是钙磷灰石(Ca₅(PO₄)₃(OH))的自然矿物化，是磷酸钙陶瓷中的一种生物活性材料，属于生物相容性材料的范畴。其空间结构为六方晶体，OH-基能被氟化物、氯化物和碳酸根离子代替，生成氟基磷灰石或氯基磷灰石，其中的钙离子可以被多种金属离子通过发生离子交换反应代替。HAP是脊椎动物骨骼和牙齿的主要无机组成成分，人的牙釉质中羟基磷灰石的含量约96Wt％，骨头中也约占69Wt％。羟基磷灰石具有与人体骨组织无机成分磷灰石极为相类似的化学组成和结构，具有优良的生物相容性和生物活性。本发明制备的具有多孔表面形貌的羟基磷灰石(HAP)纳米粒可以作为药物缓释载体以及作为化学反应、生物反应的催化剂或药物载体等生物医学领域。纳米羟基磷灰石与普通的羟基磷灰石材料相比，具有更佳的理化性质和生物学性能，如溶解度较高、表面能较大和生物活性更强。尤其重要的是，纳米羟基磷灰石颗粒本身具有抑制癌细胞生长的作用，羟基磷灰石还是一种高效的吸附材料，能够结合核酸和蛋白质。本发明利用反相微乳法制备多孔的羟基磷灰石纳米粒，药物负载量大，具有对药物很强的吸附能力，实现对没食子酸和胰岛素高效的载药效率。纳米羟基磷灰石作为药物载体的优势：1.比表面积大，有较强的吸附和承载能力。2.安全性强，生物相容性高，且不为胃肠液所溶解，免受水解酶的破坏，释放药物后可降解吸收或全部随粪便排出。3.体积微小，可被肠粘膜吸收进入肠壁。

聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)：是一种价廉、中性、无毒、免疫原性低、高度亲水性线型聚合物，具有独特理化性质和良好的生物相容性。而且其两端的羟基具有反应活性，能进行酯化、氰乙基化及与多种官能团反应。聚乙二醇是一种能同时溶于水和有机物的具有油水二亲性的高聚物。聚乙二醇同蛋白质相连可改变蛋白质生物化学特性，包括分子大小，疏水性及电荷等，增加蛋白水溶性和稳定性。PEG与药物相连，能够增大药物的相对分子质量，减少肾消除，延长药物的半衰期，增大药物的水溶性，并且PEG链包裹在药物表面，能够遮蔽药物的抗原决定簇，降低药物的免疫原性。本发明利用PEG两端富有羟基的特性，将PEG包裹在HAP表面，一方面能够增强HAP的耐胃肠液的能力，另一方面给胰岛素和没食子酸提供更好的修饰位点，延长半衰期，增加两种药物在胃肠吸收后的作用时间。另外，在粒径检测和透射电镜结果相结合分析，HAP外面包裹PEG，然后接枝GA和INS的过程中，单独HAP纳米粒和包裹PEG的HAP纳米粒的粒径可能由于其表面富集羟基团聚，而在GA接枝在PEG上以后，可能其表面原有很多羟基被修饰，粒子间的氢键作用减小因而团聚现象减弱，粒径减小。这一点在透射电镜结果中也有体现，即接枝过GA后的粒子变得更加分散，而在连接INS后，可能由于接枝体积较大的多肽，粒子之间基团相互作用增强，粒径因而有所增大。

胰岛素是目前治疗胰岛素依赖型糖尿病的首选和必备药物，临床常用的针剂剂型为糖尿病患者带来了极大的痛苦和不便。胰岛素口服途径给药具有方便、无痛，符合人体正常生理途径等优点。但胰岛素半衰期短，且口服时易被酶解。本发明通过化学修饰胰岛素来延长其半衰期，然后通过PH敏感材料和生物可降解材料包载，制备成PH敏感的聚合物纳米粒子，可防止胃肠道酶的降解。胰岛素用于治疗糖尿病存在以下问题：消化道酶屏障和上皮屏障使得胰岛素口服给药吸收差；肾脏的快速清除和体内蛋白酶的作用导致糖尿病人需要频繁注射胰岛素，而长期反复注射会引起体内产生抗体,甚至引起过敏和胰岛素抵抗；外源的胰岛素会引起免疫反应；PEG化可以提高胰岛素稳定性，增加其抵抗酶解的能力，消除其免疫原性和抗原性，并降低肾脏清除速率、延长体循环时间。

没食子酸(gallic acid)又名五倍子酸，在抑制α-葡糖苷酶和α-淀粉酶中有一定的作用。糖尿病患者将空腹和餐后状态下控制血糖在正常水平可以通过抑制α-葡糖苷酶和α-淀粉酶将碳水化合物水解。α-淀粉酶催化α-l,4-葡糖苷键、淀粉、糖原和各种低聚糖、α-葡糖苷酶进一步断裂下来的二糖为单糖，随时用于肠道吸收。抑制α-葡糖苷酶和α-淀粉酶的活性，可以在人的消化道中减少了淀粉的分解，延迟了碳水化合物的消化和延长总碳水化合物的消化时间，导致葡萄糖的吸收率减少，因此抑制了餐后血糖上升，是有效的通过抑制淀粉分解减少葡萄糖的吸收，以控制糖尿病的方法。

综上所述，本发明利用PEG包裹的HAP为载，表面接枝胰岛素和没食子酸的纳米药物输运系统，在口服胰岛素输运与协同降糖，以及今后在糖尿病并发症治疗方面有着很好的应用前景。

本发明具有以下有益效果：

本发明首先合成羟基磷灰石(hydroxyapatite，HAP)纳米粒，再通过羟基之间的氢键作用将聚乙二醇(PEG)包裹在HAP的表面，形成HAP-PEG粒子，最后将胰岛素(insulin，INS)和没食子酸(gallic acid，GA)连接在HAP-PEG的表面，得到以HAP-PEG为载体的胰岛素和没食子酸的纳米口服输运系统。

本发明的纳米口服输运系统稳定性好、成分天然、生物相容性好、载药率、释放率高、吸收效果好，在胃肠液中耐受能力较强，在小肠上皮细胞株吸收明显，细胞毒性低，口服有明显的降糖效果，在糖尿病的治疗和药物研究方面具有很好的应用潜力。

附图说明

图1为粒径检测结果，a为反相微乳法制备的HAP纳米粒的粒径分布图，b为PEG包裹HAP后的纳米粒的粒径分布图，c为GA连接在PEG上以后的纳米粒的粒径分布图,d为INS连接到PEG上以后的纳米粒的粒径分布图。

图2为透射电镜检测结果，a为反相微乳法制备的HAP纳米粒子的形貌，b为PEG包裹HAP后的纳米粒子的形貌，c为GA连接在PEG上以后的纳米粒子的形貌,d为INS连接到PEG上以后的纳米粒子的形貌。

图3为红外光谱检测结果，其中：a为羟基磷灰石纳米粒(HAP)，b为PEG包裹HAP(HAP-PEG)，c为PEG表面接枝没食子酸(HAP-PEG-GA)，d为PEG表面接枝胰岛素(HAP-PEG-INS-GA)。

图4为拉曼光谱检测结果，其中a为羟基磷灰石纳米粒(HAP)，b为PEG包裹HAP(HAP-PEG)，c为PEG表面接枝没食子酸(HAP-PEG-GA)，d为PEG表面接枝胰岛素(HAP-PEG-INS-GA)。

图5为紫外分光光度法检测GA和INS接枝率和释放率，a为HAP-PEG与不同比例GA反应后的接枝率，b为HAP-PEG-GA与不同比例INS反应后的接枝率，c为HAP-PEG-GA-INS纳米粒子在模拟胃肠液中INS的释放率检测，d为HAP-PEG-GA-INS纳米粒子在模拟胃肠液中GA的释放率检测。

图6为MTT法检测HAP-PEG-GA-INS纳米粒子对Caco-2细胞的细胞毒性，检测分别加入0、12.5、25、50和100μg/ml的HAP-PEG-GA-INS纳米粒子24小时后Caco-2细胞的存活率。

图7为Caco-2细胞分别在2和4小时对连接有FITC-胰岛素的粒子的吸收实验，不加入荧光粒子为对照组，从左到右分别为明场细胞形态、DAPI蓝色核染色、FITC绿色荧光以及蓝绿两种荧光的合成图。

图8为糖尿病大鼠和正常大鼠的对照图。

图9为糖尿病大鼠模型建立相关指标检测数据，在大鼠注射链脲佐菌素(STZ,50mg/kg)为起始(第0天),对照组注射生理盐水,图a为大鼠体重增长率统计图,图b为大鼠进食量增长率的统计图，图c为大鼠血糖监测的统计图,图d为大鼠饮水量的统计图。

图10为糖尿病大鼠在体小肠荧光吸收情况，左边为对照组，右图为连接有FITC绿色荧光胰岛素的实验组。

图11为建模成功的糖尿病大鼠在空腹情况下口服HAP-PEG-GA-INS纳米粒子(实验组)和口服生理盐水(对照组)，检测其在0,1,3,5,7,9,17,21小时的血糖值。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。

以下实施例所用到的实验材料如下：

细胞株：人克隆结肠癌细胞(Caco-细胞株)由广州药学院提供，经本实验室传代培养。

实验动物：实验大鼠均为SPF级SD雄鼠，购自南方医科大学实验动物中心。

主要试剂：牛胰岛素、聚乙二醇和链脲佐菌素，为Biosharp公司产品；没食子酸，购自广州试剂厂；胰酶、高糖DMEM培养基均为GIBCOBRL公司产品；胎牛血清，购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司；孔聚苯乙烯组织培养基板为美国Corning康宁公司产品。

仪器：紫外分光光度计、红外光谱检测仪、电镜、Sigma高速冷冻离心机、冷冻干燥机、磁力搅拌器、旋转蒸发仪、烘箱、液相色谱仪、扫描电镜、Thermo CO₂培养箱，江苏省金坛市医疗仪器厂-磁力搅拌器，高压灭菌器，无菌操作台，广州科桥实验技术设备有限公司恒温水浴锅等。

实施例1制备搭载胰岛素和没食子酸的纳米口服输运系统

1、羟基磷灰石(HAP)纳米粒的制备

(1)取Ca(NO₃)₂·₄H₂O和(NH₄)₂HPO₄分别溶于超纯水，分别用氨水调pH至11，再加入到混合体系中。

其中，所述Ca(NO₃)₂·₄H₂O：(NH₄)₂HPO₄＝1.67mol：1mol。

所述混合体系为曲拉通X-100：环己烷：正丁醇的体积比＝16ml：56ml：6ml的体系。

(2)将步骤(1)的两种溶液混合反应20min左右形成透明微乳，将30ml无水乙醇添加到混合微乳中破乳，离心机12000g下离心15min，除去环己烷和曲拉通X-100(表面活性剂)，用无水乙醇再洗涤2～3次，得到颗粒。

(3)将步骤(2)得到的颗粒放在烘箱中80℃烘干4h后，得到HAP纳米粒粉末。

2、PEG包裹HAP纳米粒的制备

按质量比1：1，将PEG和HAP纳米粒在磁力搅拌机上搅拌过夜，保证PEG对HAP进行均匀包裹。

将包裹所得纳米粒在离心机5000r/min，10℃下离心30min，用超纯水洗三次后，冷冻干燥，既得PEG包裹的HAP纳米粒(HAP-PEG)。

3、HAP-PEG纳米粒表面连接没食子酸(GA)和胰岛素(INS)

(1)5mg GA和10mg HAP-PEG纳米粒溶于10ml二氯甲烷中，然后加入0.025mol DMAP和0.3mol DCC，混合搅拌24h，过滤副产物，乙酸乙酯萃取，蒸馏水洗至中性，冷冻干燥，减压蒸去有机溶剂，得到搭载GA的HAP-PEG纳米粒，即HAP-PEG-GA纳米粒。

(2)按照PEG和丁二酸酐的摩尔比1：5，将HAP-PEG-GA纳米粒和丁二酸酐混合，氯仿为溶剂，DMAP为催化剂，60℃恒温48h，真空抽出部分溶剂，用无水乙醚沉析，抽滤后洗涤，40℃真空干燥48h，PEG被羧基化。

(3)PEG被羧基化的HAP-PEG-GA纳米粒、EDC和NHS按照1：1：1摩尔比加入蒸馏水中，pH调至5.6，冰浴30min并不断调整pH后，加入胰岛素混合搅拌24h过夜，超纯水洗三次，冷冻干燥2h，即得HAP-PEG-GA-INS纳米粒。

实施例2搭载胰岛素和没食子酸的纳米口服输运系统的表征

1、粒径检测

(1)将制备好的HAP纳米粒溶于丙酮中，取80μl加入样品池中，通过马尔文粒径检测仪检测。

(2)图1是马尔文粒径检测仪对反相微乳法制备的HAP纳米粒、PEG包裹HAP、GA连接在PEG上和最后将INS连接到PEG上以后的粒径的检测结果。

粒径检测图中，a图显示反相微乳法制备的HAP纳米粒平均粒径为100-200nm左右；b图显示PEG包裹HAP以后平均粒径在300nm左右；c图显示GA连接到PEG上以后粒径不到200nm；d图显示INS连接到PEG上以后粒径在500nm左右。

2、透射电镜观察

(1)将HAP、HAP-PEG、HAP-PEG-GA和HAP-PEG-GA-INS纳米粒悬浮于超纯水中，将溶液滴在透射电镜专用铜网的石蜡膜上，溶剂挥发出去，透射电镜(TEM，JEM-2100HR显微镜，200keV电子动能)测定纳米粒形貌。

(2)图2是透射电镜的结果显示，HAP的TEM图显示反相微乳法制备的HAP纳米粒的粒径大致为10nm的短棒状结构。HAP-PEG的TEM图显示PEG表面包裹了一层薄PEG。HAP-PEG-GA的TEM图显示纳米粒子PEG接枝上GA后粒子粒径进一步增大。HAP-PEG-GA-INS的TEM图显示HAP-PEG-GA表面接枝上INS后粒径有所增大，约20nm左右。

3、红外光谱检测

(1)将HAP-PEG-INS-GA，HAP，HAP-PEG-GA和HAP-PEG进行干燥处理，然后放入研钵中，加入一定量的KBr，研磨均匀使混合物研磨到粒度小于2μm，以免散射光影响，之后放入干燥机中进行干燥处理，在油压机上用10MPa左右的压力将混合物压成透明薄片，上机测定。

(2)傅里叶转换红外光谱检测结果如附图3，谱图a在3440cm^-1和1645cm^-1有一强的吸收峰，是羟基磷灰石表面OH^-的O-H伸缩振动和H₂O中的O-H伸缩振动，在962cm^-1和562cm^-1两个吸收峰为PO₃^-的特征谱带。

谱图b在2886cm^-1有一强吸收峰，为PEG的C-H的伸缩振动，1354cm^-1的较强吸收峰为-CH₂，961cm^-1有一强吸收峰为C-O-C的碳氧键伸缩振动。

谱图c在1648cm^-1、1556cm^-1和1419cm^-1处出现了手指状的三个峰，即为GA上苯环的C＝O振动峰。

谱图d在1542cm^-1处出现两个较强峰，为氨基的N-H振动峰，而在1654cm^-1处出现的峰为C-O伸缩振动峰。

4、紫外拉曼光谱检测

(1)通过紫外可见分光光度计，在200-400nm的波长范围内对样品进行扫描，可以获得样品在这个波长范围内的最大吸收波长。用样品，上述合成的为样品，然后以分散剂水为参比液，分别取适量的样品于比色皿中，在已测得的最大吸收波长上进行光谱扫描检测。

(2)利用拉曼光谱仪对相应的反应物和和产物的做出拉曼谱图分析。结果如附图4所示。

谱图a在3570cm^-1有一吸收峰，是羟基磷灰石表面OH^-的吸收峰，在961cm^-1吸收峰为PO₄的特征谱带。谱图b在1042cm^-1左右有一强吸收峰，为PEG的C-O-C的吸收峰，1472cm^-1的较强吸收峰为-CH₂，961cm^-1有一强吸收峰为C-O-C的碳氧键，在2909cm^-1的吸收峰为C-H；谱图c在1599cm^-1附近出现一系列连续的峰，为没食子酸苯环的吸收峰；谱图d在512cm^-1处出现较强的峰，为INS上的二硫键形成的峰，而在1123cm^-1有较强吸收峰，为C-N键所致，1659cm^-1出现的峰为-NH₂。

5、接枝率和释放率检测

图5的a图中显示在GA和粒子的加药比分别为1：3、1：6和1：9反应后，实际接枝率并无明显变化，接枝率大约在45～50％左右。b图中显示INS在和粒子加药比分别为1：3、1：6和1：9反应后，同样实际接枝率无明显变化，接枝率大约在50～61％左右。初步判断加大加药量对粒子表面接枝GA和INS无太大影响。c图显示，根据紫外分光光度法对粒子上INS的释放率进行检测，发现INS在模拟胃肠液6h内基本释放完全。d图显示根据紫外分光光度法对粒子上INS的释放率进行检测，发现粒子上的GA在模拟胃肠液1h内发生突释，基本释放完全。

实施例3细胞实验

1、MTT细胞毒性实验

(1)收集对数期Caco-2细胞，调整细胞悬液浓度，至5000～10000个/孔，孵育至细胞单层铺满孔底，加入浓度梯度的药物。孵育18～24小时，倒置显微镜下观察。加入MTT，终止培养，加入二甲基亚砜，以未经处理的空白细胞作为对照。通过酶标仪得出细胞存活率。

(2)图6显示在MTT法探究HAP-PEG-GA-INS纳米粒子对Caco-2细胞的毒性实验中，实验设定在0～100μg/ml的纳米粒子浓度梯度范围内，0μg/ml浓度的粒子为对照组，其细胞存活率设定为100％，加入粒子浓度为的12.5、25、50和100μg/ml的为实验组，实验组的细胞存活率随着粒子的浓度升高而降低。其中在25μg/ml的粒子浓度左右，细胞存活率最高，在此范围内纳米粒子的细胞毒性显示为最低。

2、细胞对粒子荧光吸收实验

(1)将荧光胰岛素(FITC-insulin)链接至HAP-PEG-GA粒子上后离心、洗涤，避光保存。然后在无菌环境下用220nm孔径的滤头避光过滤，最后滤液浓度为5mg/ml，避光保存备用。收集对数期Caco-2细胞，调整细胞悬液浓度，至个5000个/孔，孵育24小时左右至细胞单层铺满孔底，在每个孔加入0、12.5、25、50和100μg/ml终浓度的药物。分别孵育2小时和4小时后经PBS清洗、4％多聚甲醛固定、PBS清洗、0.2.％曲拉通X-100透化和PBS清洗，经DAPI染色在荧光倒置显微镜下拍照。

(2)Caco-2细胞对荧光粒子吸收实验结果如图7显示，在Caco-2细胞在24孔板培养24小时以后，细胞会成团平铺在板底，经过清洗、固定和透化处理后的细胞，再经DAPI染色后，荧光显微镜下分别用明场、蓝色荧光和绿色荧光状态下拍摄后显示，在对照组细胞中中并没有显现出FITC的绿色荧光，在2和4小时孵药组均有绿色荧光显示，并且4小时组绿色荧光更强。经过绿色荧光和蓝色荧光图片合成后发现，绿色荧光多聚集在蓝色荧光周围，即细胞质中。即认为合成的HAP-PEG-GA-INS纳米粒子能够被肠细胞吸收，且吸收量随加药时间而递增。

实施例4体内实验

1、糖尿病大鼠模型建立

(1)使用六周龄大鼠，体重约200g，禁食12h，保持供水，使用PH＝4.4的柠檬酸缓冲液溶解STZ，以50mg/kg的剂量腹腔注射STZ。注射后保持水粮充足，每日监测空腹体重、血糖两次。七天后，空腹血糖在16.7mmol/L的大鼠，认定为I型糖尿病鼠。

(2)图8显示通过一次注射50mg/kg STZ后的实验组大鼠和未注射STZ的正常大鼠在体型上有较大差异，身型较小，体重明显低于低于正常大鼠。

图9显示，通过注射STZ前一天开始到注射后第9天为止，进行为期10天的进食量、饮水量、体重和血糖的检测，发现STZ造模的大鼠在饮食方面都相对正常大鼠有显著提高，体重增长比例也相对较大，血糖值大部分也保持在15mmol/L，因此选取图c的除了1,3,4,6,8号鼠以外的11只血糖保持较高状态的大鼠作为最终实验大鼠。

2、在体肠段对载荧光胰岛素的粒子吸收情况观察

(1)取五只患1型糖尿病的SD大鼠，实验前饥饿一夜，可以喝水。使用戊巴比妥钠(0.05mg/kg)麻醉，腹部裸露后，结扎出5cm十二指肠，使用生理盐水清洗。在每只实验鼠的结扎肠断中分别注入0.5ml生理盐水、0.5ml游离FITC-胰岛素(异硫氰酸荧光素链接的胰岛素)、0.5ml HAP-PEG-INS-GA。结扎孵育2h后，处死鼠，取出每个结扎的肠断，用PBS清洗，然后，使用4％多聚甲醛固定2小时，在30％蔗糖溶液中浸一夜。样本埋藏并-20℃冷冻。使用冰冻切片机(Cryotome FSE，赛默飞世尔科技，中国)将冰冻回肠断切出20μm薄片，使用DAPI染色，再使用荧光显微镜观察。

(2)图10显示HAP-PEG-GA-INS连接FITC荧光后的粒子，在大鼠十二指肠孵育两小时后，经过清洗和固定切片，DAPI核染色蓝色荧光拍照和绿色荧光拍照后，经过图像合成显示出如下结果。左图中对照组小肠上皮绒毛细胞无绿色荧光粒子显示，而实验组肠段小肠绒毛中有分散的绿色荧光点显示，初步认为是连接FITC的HAP-PEG-GA-INS的药物经过孵育后被大鼠小肠肠绒毛吸收，即认为合成的粒子可以被大鼠小肠吸收。

3、口服降糖实验

(1)选取血糖相对稳定在15mmol/ml的6只注射STZ大鼠作为实验鼠，3只为灌药组，3只为灌生理盐水对照组，在灌药0,1,3,5,7小时时对其血糖值进行检测，并将数据制成折线图分析。

(2)图11显示为建模成功的糖尿病大鼠在空腹情况下灌喂HAP-PEG-GA-INS纳米粒后的血糖值下降情况。

如图显示在实验组灌喂粒子后，其血糖值在空腹情况下0～17小时下降趋势比对照组明显。而在21小时时刻对实验组和对照组的大鼠都采取喂食处理，而后两组大鼠血糖值都迅速回升，同时回升后的实验组大鼠血糖值与实验开始时基本吻合，即合成的HAP-PEG-GA-INS纳米粒对于糖尿病大鼠的血糖控制有明显的效果，且持续时间也比较长。