本发明属于药物制剂技术领域。具体涉及一种含有卡非佐米的药物组合物、该药物组合物的无菌冷冻干燥制剂，以及该无菌冷冻干燥制剂的制备方法。
背景技术：
多发性骨髓瘤（MM）是发生在B淋巴细胞的恶性浆细胞病，其特征在于恶性浆细胞在骨髓微环境克隆增殖，血液或尿中单克隆蛋白质和相关的器官功能紊乱；是全球第二个最常见的血液系统肿瘤，约占肿瘤疾病的1%和血液肿瘤的13%。在西方国家，每年发病率为5.6例/10万人。
卡非佐米，英文名Carfilzomib，其化学名为(S)-2-((S)-2-(2-(2H-1,4-恶嗪-4(3H)-基)乙酰氨基)-4-苯基丁酰胺)-4-甲基-N-((S)-1-((S)-4-甲基-1-((R)-2-甲基环氧乙烷-2-基)-1-氧代戊烷-2-基氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)戊酰胺，分子式为C40H57N5O7，结构式如下：
卡非佐米是一种四肽基环氧骨架蛋白酶体抑制剂，可选择性的、不可逆地结合至20S蛋白酶体的苏氨酸活性位点的N-末端，蛋白水解的核心颗粒26S蛋白酶体。卡非佐米在体外对实体瘤以及血液肿瘤细胞有抗增殖和凋亡活性。在动物试验中，卡非佐米抑制在血液和组织中的蛋白酶体活性，并且在多发性骨髓瘤，血液学和实体瘤模型中延迟肿瘤生长。
2012年7月20日，美国食品与药物监督管理局（FDA）经优先审批程序批准了奥尼克斯(Onyx)制药公司开发的卡非佐米注射剂(carfilzomib)上市销售，商品名：Kyprolis，规格为60mg，用于单药治疗既往至少已接受过两种疗法、包括硼替佐米(bortezomib／Velcade)和一种免疫调节剂治疗且有在完成最后1次治疗后60天内疾病进展证据的多发性骨髓瘤患者。
尽管卡非佐米具有良好的抗肿瘤作用，但是其水溶性较差，且稳定性不好，冻干制剂是较为理想的剂型，目前上市的Kyprolis处方中含有60mg卡非佐米、3000mg磺丁基倍他环糊精钠以及57.7mg枸橼酸以及适量氢氧化钠，虽然环糊精包合物在一定程度上提高了药物的溶解性，但是其载药量仍然不足2%，且使用了较大量的环糊精，进入人体血液循环系统后会加重肾脏负担，同时环糊精能与血管内壁细胞膜发生作用，造成细胞伤害，长期使用可能造成静脉痉挛和静脉炎，存在安全隐患，并且在每次给药前须给予地塞米松预防输注反应。此外，该药物在水性介质溶液中非常不稳定，室温条件下最多稳定4小时，在实际临床应用中对用药的安全性也是挑战。
综上所述，目前上市的卡非佐米注射液在多发性骨髓瘤的治疗上具有较好的效果，但同时也给临床应用带来了诸多不便和安全性问题。
技术实现要素：
为解决上述问题，本发明人提供一种有效的方法：更换生物相容性更好的药物载体，将药理活性物质包入纳米级的粒子中，以增加卡非佐米的溶解度、载药量和稳定性。另外，本发明提供的用于静脉注射的纳米粒子可以缓释药理活性物质并延长其体内半衰期，并可以将粒子中的药理活性物质靶向释放。
针对现有技术的不足，本发明的主要目的是提供一种更好的用于体内递送卡非佐米的药物组合物，本组合物实际为一种纳米颗粒胶体分散系统，该组合物不含目前卡非佐米注射液中的磺丁基倍他环糊精，避免了过敏反应的发生，同时避免了卡非佐米注射液临床使用中引起的血管痉挛和静脉炎。此外，本发明的药物组合物在水性介质溶液中的稳定性显著优于现有制剂，在临床应用中增强了用药的安全性。
本发明的一种卡非佐米药物组合物，包含作为活性成分的卡非佐米、蛋白质和酸碱度调节剂，其pH值范围为2.0~5.0，平均粒径≤200nm，Zeta电位为-20~-30mv，其中卡非佐米与蛋白质的质量比为1: 6~12。
本发明中的卡非佐米药物组合物实际上是可静脉注射的卡非佐米蛋白纳米颗粒及其所结合的游离蛋白，其可通过孔径0.22µm的滤器进行除菌过滤，以制备可供静脉滴注的药物制剂；本药物组合物中不需要使用常规的表面活性剂、增溶剂或任何聚合物核心基质，其在水性介质溶液中室温条件下最多可保持长达8小时的稳定性，保证了用药的安全性。
本发明的卡非佐米药物组合物，其中，蛋白质在纳米颗粒中起分散、稳定微粒的作用，蛋白质用量较少无法制备稳定的蛋白纳米颗粒，蛋白质用量过多则载药量较低且不经济。
本发明的一种卡非佐米药物组合物，其pH值范围为3.0～5.0。
本发明的一种卡非佐米药物组合物，其中所述卡非佐米为非晶体、结晶体或两者的混合物；优选卡非佐米为非晶体。因为非晶体更易于溶解和吸收，从而达到更高的生物利用度。
本发明的一种卡非佐米药物组合物，其中所述蛋白质带有巯基或二硫键；优选地，所述蛋白质为人血白蛋白。
本发明的一种卡非佐米药物组合物，其中所述酸碱度调节剂选自枸橼酸、酒石酸、磷酸、苹果酸、盐酸、氢氧化钠、氢氧化钾、磷酸氢二钠、碳酸氢钠之一或其任意组合；优选枸橼酸与氢氧化钠的组合。
本发明还提供一种卡非佐米无菌冷冻干燥制剂，所述无菌冷冻干燥制剂为蛋白质结合卡非佐米的无菌冷冻干燥制剂，在所述无菌冷冻干燥制剂中包含上述卡非佐米药物组合物以及蛋白稳定剂，不含有冻干保护剂；其中所述蛋白稳定剂选自乙酰色氨酸、辛酸钠之一或其组合，且所述蛋白稳定剂随所述蛋白质同时加入。本发明中所使用的蛋白稳定剂优选不单独添加，而是选择蛋白质产品本身添加了该种稳定剂的蛋白质，稳定剂作为蛋白产品本身的固定组分随蛋白质一起加入使用。
由于蛋白质（例如，人血白蛋白）本身起冻干保护剂作用，因此不需要常规的冻干保护剂，如甘露醇、甘油或类似化合物及类似化合物组合。尽管不需要，但这些常规的冷冻保护剂及蛋白稳定剂也可以加入到本发明的配方中。
本发明的卡非佐米无菌冷冻干燥制剂，其可转化为可重新分散的粉末或块状物，采用适宜的水性介质能够使所述粉末或块状物复溶为含有至少1mg/ml卡非佐米的液体混悬液；所述适宜的水性介质选自生理盐水、缓冲生理盐水、水、缓冲的水性介质、氨基酸溶液、维生素溶液、碳水化合物溶液或类似介质之一或其任意组合。
本发明还提供一种上述卡非佐米无菌冷冻干燥制剂的制备方法，包括以下步骤：
1）将卡非佐米溶于有机溶剂中，为有机相；所述有机溶剂选自乙醇、丙酮、N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、乙酸乙酯、三氯甲烷、四氢呋喃、乙腈、甲基吡咯烷酮之一或其任意组合的混合物，其中卡非佐米在有机相中的浓度范围为5%~30%（w/v）；
2）将所述蛋白质分散于水性介质中，为水相，所述蛋白质在水性介质中的浓度范围为10~20%（w/v）；
3）将步骤1）的有机相与步骤2）的水相混合，将该混合物置于压力范围10,000～30,000psi的高压均浆器内高压均浆至少3个循环，制备的颗粒平均直径≤200nm；均浆时有机相组分浓度≥5%（v/v），混悬液中卡非佐米的浓度≥5mg/ml；
4）将步骤3）所得混悬液减压蒸发，除去有机溶剂，生成由蛋白质包被的卡非佐米纳米颗粒及游离蛋白质组成的胶体系统；
5）向步骤4）所得胶体系统中加入酸碱度调节剂调节其pH值至2.0~5.0；
6）将步骤5）中所得胶体系统进行除菌过滤，冷冻干燥，即得卡非佐米无菌冷冻干燥制剂。
本发明的制备方法，优选地，步骤3）中所述高压均浆器的压力范围为15,000~25,000；混悬液中卡非佐米的浓度可高达6~16mg/ml。发明人发现，所述混悬液中主药浓度＜5mg/ml时，室温条件下放置3～4小时即出现稳定性下降现象，粒径呈现增大趋势且除菌过滤后主药回收率下降。相反，当所述混悬液中主药浓度≥6mg/ml时，蒸发后得到的药液为稳定的纳米颗粒胶体分散系统，其室温稳定性可达到6小时，更优选地，所述混悬液中主药浓度为8mg/ml时，其室温稳定性可达8小时，且易于除菌过滤，有利于产业化。
本发明的制备方法，优选地，步骤4）中所述减压蒸发的温度为40℃。温度大于40℃药液稳定性低，小于40℃溶剂挥发速度较慢。减压蒸发的设备选择使用膜蒸发器、喷雾干燥器、冷冻干燥器，或类似设备。
为得到直径≤200nm并可无菌过滤的颗粒，有机相内含有一种与水不混溶的有机溶剂是非常必要的。在高压均浆条件下，上述溶剂在水相中形成极微细的非水性溶剂分散小滴（含溶解的药理活性物质），并在减压条件下快速去除，形成可无菌过滤纳米颗粒。
本发明的上述制备方法得到的卡非佐米的蛋白纳米颗粒冻干制剂，具有良好的化学稳定性与物理稳定性；其中所述蛋白纳米颗粒可包载占蛋白纳米颗粒总质量1%～14%的卡非佐米，载药量高。且因为使用了与人体生物相容性更好的人血白蛋白，未采用卡非佐米注射液中添加的大量环糊精，避免了过敏反应，且在用药前后不需要对患者进行水化，显著提高了临床用药的顺应性和安全性。
根据上述制备方法所述，卡非佐米被溶解在一种合适的溶剂内作为有机相，而在水相中加入蛋白质是起稳定剂作用，易形成稳定的纳米液滴。由于白蛋白本身即具有一定的表面活性，与常规的纳米颗粒形成方法不同，混合物内不需要加入大量的传统表面活性剂或增溶剂（例如，环糊精、十二烷基硫酸钠、卵磷脂、吐温80和类似化合物）。本发明优选采用生物相容性良好的人血白蛋白替代常规表面活性剂或增溶剂，避免了毒副作用以及注射部位的刺激反应。
本发明的卡非佐米无菌冷冻干燥制剂，还可以采用第二种制备方法：蛋白变性复性法
蛋白变性复性法的目的在于利用蛋白及多肽展开后与高压均质相结合的方法，将药理活性物质包入蛋白纳米颗粒，用于体内递送。本方法的重要特征在于针对利用蛋白及多肽展开后直接制备白蛋白纳米粒过程中容易出现凝聚现象的缺点，提供了一个更稳定的制备高浓度卡非佐米纳米颗粒的方法，其药液稳定性显著优于已有技术所制备的低浓度药液，并可进行除菌过滤，且更有利于产业化。
蛋白变性复性法包括以下步骤：
1）用水性介质溶解蛋白质获得蛋白质溶液，所述水性介质选自水、生理盐水、糖溶液；
2）将卡非佐米溶于有机溶剂中，为有机相；所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、二氯甲烷、乙酸乙酯、三氯甲烷、四氢呋喃、乙腈、甲基吡咯烷酮或类似溶剂之一或其任意组合的混合物；
3）将蛋白结构展开剂添加到步骤1）所得蛋白溶液中，持续反应0.1～4小时，除去蛋白结构展开剂；所述蛋白结构展开剂选自2-巯基乙醇、二硫苏糖醇、盐酸胍、尿素、甲巯丙 、过甲酸、青霉胺、谷胱甘肽、甲巯咪唑、乙酰半胱氨酸或它们的组合；
4）将步骤2）所得有机相加入步骤3）所得溶液中，混合后加入压力范围3,000～30,000psi的高压均浆器内，高压均浆至少3个循环，制备的蛋白纳米颗粒平均直径≤200nm，混悬液中药物浓度不低于5mg/ml，优选地，混悬液中药物浓度不低于6mg/ml；
5）将步骤4）所得混悬液减压蒸发，除去有机溶剂，生成由蛋白质包被的卡非佐米纳米颗粒及蛋白质组成的胶体系统；
6）将步骤5）中所得胶体系统进行除菌过滤，然后冷冻干燥，即制得卡非佐米无菌冷冻干燥制剂。
其中，步骤3）中所述蛋白结构展开剂优选谷胱甘肽，由于浓度过低无法将蛋白链充分展开，不利于药物的包裹；蛋白浓度过高则对蛋白结构破坏程度过高，很难再复性，因此其浓度为1～16mM。
本制备方法中有机相内可含有一种与水不混溶的有机溶剂，获得的蛋白纳米颗粒平均粒径≤200nm，这种颗粒由于可以经受无菌过滤而特别有利，避免了高温灭菌等更为强烈的除菌方法。
本制备方法在加入卡非佐米前通过及时的去除多余的蛋白展开剂及其它小分子化合物，发明人惊奇的发现蛋白纳米颗粒在后续的透析及其它操作中保持了良好的稳定性，Zeta电位在-20～-30mv之间，室温稳定性可达48小时。形成鲜明对比的是，发明人多次重复专利CN102048695A中的实施例，不曾实现其实施例及权利要求书中所说明的结果，尤其在通过透析及其他方式去除小分子化合物过程中，蛋白纳米颗粒稳定性较差，通常在室温6小时内已出现絮状沉淀。
上述除去有机溶剂的方式包括但不限于上述减压蒸发方法，其它的方法可以包括旋转蒸发、减压蒸馏、喷雾干燥或类似方法。
上述蛋白变性复性法中，由于蛋白变性剂在溶液体系中长时间的存在对于蛋白质本身的结构及蛋白质颗粒的稳定性均可以造成破坏性的影响，造成整个体系的不稳定，因此，蛋白展开后，在加入卡非佐米前及时的去除蛋白展开剂，从而使蛋白纳米颗粒在后续的透析及其它操作中保持了良好的稳定性，制备出了稳定性优越的卡非佐米纳米颗粒。
本发明制备的卡非佐米蛋白纳米颗粒够以较小体积输送高剂量药理活性物质，这可以使病人接受大体积液体输注时的不适感和住院时间减至最小。此外，蛋白质外壳或包衣通常在体内可被蛋白水解酶完全降解，因此本药物组合物不会带来副作用。
具体实施方式
通过参照以下实施例进一步详细说明本发明，但不限于此。
实施例1 使用水相溶溶剂作为有机相溶媒——对照组
将600mg卡非佐米溶解于2ml无水乙醇作为有机相。50ml人血白蛋白（10%,w/v）水溶液为水相。水相及有机相在高压微射流内（Microfulidics），15,000psi压力条件下均浆5次循环，得到的药液转移至旋转蒸发器内，40℃条件下减压（10-15KPa）蒸发30分钟除去无水乙醇。得到的分散悬浮液中卡非佐米颗粒平均直径大于300nm（Malvern Zetasizer）。
实施例2 可无菌过滤的卡非佐米颗粒的制备过程
将1000mg卡非佐米溶解于3.3ml三氯甲烷与0.58ml无水乙醇的混合溶液中，作为有机相。600ml（20%,w/v）的人血白蛋白水溶液中，作为水相。卡非佐米与蛋白重量比例为1:12。油水相转移至高压均浆器内（Microfulidics），25,000psi压力条件下均浆3次循环，得到的药液转移至旋转蒸发器内，40℃条件下减压（10-15KPa）蒸发30分钟除去有机溶剂。得到的分散悬浮液为半透明，以枸橼酸和氢氧化钠调整pH至2.0，Zeta电位为-30mv，卡非佐米颗粒平均直径一般为110～130nm（Malvern Zetasizer）。将分散悬浮液通过0.22μm微孔滤膜过滤器，其浑浊度及颗粒大小无明显变化。HPLC法测定结果显示，过滤后85%以上的卡非佐米得到回收。
分散悬浮液冷冻干燥48小时，所得块状物加入无菌水或生理盐水后很易再构成原来的分散液，复溶后的颗粒大小与冷冻干燥前相同。
实施例3 可无菌过滤的卡非佐米颗粒的制备过程
将1000mg卡非佐米溶解于3.3ml三氯甲烷中，作为有机相。600ml（10%,w/v）的人血白蛋白水溶液中，作为水相。卡非佐米与蛋白重量比例为1:6。油水相转移至高压均浆器内（Microfulidics），25,000psi压力条件下均浆3次循环。得到的药液转移至旋转蒸发器内，40℃条件下减压（10-15KPa）蒸发30分钟除去三氯甲烷。得到的分散悬浮液为半透明，以盐酸和碳酸氢钠调整pH为5.0，Zeta电位为-20mv，卡非佐米颗粒平均直径一般为120～160nm（Malvern Zetasizer）。将分散悬浮液通过0.22μm微孔滤膜过滤器，其浑浊度及颗粒大小无明显变化。HPLC法测定结果显示，过滤后80%以上的卡非佐米得到回收。
分散悬浮液冷冻干燥48小时，所得块状物加入无菌水或生理盐水后很易再构成原来的分散液，复溶后的颗粒大小与冷冻干燥前相同。
实施例4 可无菌过滤的卡非佐米颗粒的制备过程
将1000mg卡非佐米溶解于3.3ml二氯甲烷中，作为有机相。600ml（10%,w/v）的人血白蛋白水溶液中，作为水相。卡非佐米与蛋白重量比例为1:6。油水相转移至高压均浆器内（Microfulidics），25,000psi压力条件下均浆3次循环。得到的药液转移至旋转蒸发器内，40℃条件下减压（10-15KPa）蒸发30分钟除去二氯甲烷。得到的分散悬浮液为半透明，以枸橼酸和碳酸氢钠调整pH为5.0，Zeta电位为-21mv，卡非佐米颗粒平均直径一般为130～160nm（Malvern Zetasizer）。将分散悬浮液通过0.22μm微孔滤膜过滤器，其浑浊度及颗粒大小无明显变化。HPLC法测定结果显示，过滤后80%以上的卡非佐米得到回收。
分散悬浮液冷冻干燥48小时，所得块状物加入无菌水或生理盐水后很易再构成原来的分散液，复溶后的颗粒大小与冷冻干燥前相同。
实施例5 卡非佐米与蛋白重量比例为1:4制备纳米颗粒—对照组
将1000mg卡非佐米溶解于3.3ml三氯甲烷中，作为有机相。600ml（6.67%,w/v）的人血白蛋白水溶液中，作为水相。卡非佐米与蛋白重量比例为1:4。油水相转移至高压均浆器内（Microfulidics），25,000psi压力条件下均浆3次循环。得到的药液转移至旋转蒸发器内，40℃条件下减压（10-15KPa）蒸发30分钟除去三氯甲烷。得到的分散悬浮液为半透明，以枸橼酸和氢氧化钠调整pH为5.0，Zeta电位为-25mv，卡非佐米颗粒平均直径一般为220～280nm（Malvern Zetasizer）。将分散悬浮液通过0.22μm微孔滤膜过滤器，可滤性极差，无法有效除菌过滤。
试验例pH值对产品质量的影响
按照实施例2相同步骤进行一系列实验，溶剂蒸发结束后以枸橼酸和氢氧化钠分别调节pH至1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0，同时与已上市制剂产品KYPROLIS®（卡非佐米环糊精包合物产品）进行在25℃条件下的溶液稳定性研究，结果如下表所示：
根据上表数据，原研品溶液在25℃条件下只能维持4小时稳定性，而本产品在pH值2.0~5.0范围内25℃条件下可维持至少8小时稳定性，最优pH范围为3.0~5.0。