本发明涉及止血凝胶技术领域，具体涉及一种利用微晶纤维素接枝改性胎牛皮胶原纤维制备的止血凝胶。
背景技术：
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在外科和创伤手术中经常会伴随着创面的大量出血，从而使患者面临极大的生命危险，因此制备快速有效的止血材料一直作为医用领域的研究热点。传统的止血材料存在不易携带和消毒保存的缺点，且止血几乎靠机械作用，止血效果不好。近年来，人们研制出生物可吸收止血材料，其中动物皮胶原基材料作为一种生物性能良好的医用材料，与人体具有良好的组织相容性，可生物降解且无毒副作用，同时能够促进细胞的粘附、增殖和创口的复合；并且通过其特有的微孔结构和良好的粘附性，促进生物因子的生长扩散，诱导并促进成纤维细胞的生长，从而促进伤口的愈合。
目前，普遍的动物皮胶原提取制备方法为酸酶结合提取法，主要包括原料的预处理、脱脂、酶解消化、盐析、离心和纯化等步骤，但存在所得皮胶原纯度和产率低、成本高等问题，并且会因提取过程中处理不当而使皮胶原降低或失去生物力学性能，从而影响其止血效果。针对这一问题，本公司从皮胶原的提取方法入手，并结合对提取皮胶原的改性处理以及助剂的添加制备止血凝胶材料，在低成本的基础上提高止血效果、生物相容性、生物降解性和使用安全性。
技术实现要素：
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本发明所要解决的技术问题在于提供一种使用方便、止血效果好且具有优异生物相容性与生物降解性的利用微晶纤维素接枝改性胎牛皮胶原纤维制备的止血凝胶。
本发明所要解决的技术问题采用以下的技术方案来实现：
利用微晶纤维素接枝改性胎牛皮胶原纤维制备的止血凝胶，包括如下步骤：
(1)胎牛皮预处理：以可溯源纯化胎牛皮为原料，将其完全展开后用保鲜膜包裹好，并置于-5～0℃环境中冷冻5～8h，再用温度10-15℃、质量分数5％的小苏打与三聚磷酸钠混合水溶液浸泡10～15min，然后在去离子水冲淋下用海绵刷刷洗表面2～3次；
(2)胶原纤维提取溶剂的制备：按照摩尔比1.2～1.5:1的比例将环丙基溴和2-吡咯烷酮充分混合，先于超声频率40kHz、功率50W下超声处理15～30min，再于微波频率2450MHz、功率700W下微波处理3～5min，然后加热至回流状态保温搅拌30～60min，待混合溶液自然冷却至50-55℃后加入等重量的5-10℃去离子水，充分搅拌后静置分层，取水相，即得提取溶剂；
(3)胶原纤维溶液的制备：将上述刷洗后的胎牛皮送入冷冻干燥机中，干燥至含水量为10-15％后利用碎皮机粉碎成粒度为2-3mm的颗粒，再加入上述所制提取溶剂中，充分分散后静置10～15min，静置结束后转入球磨机中，球磨至细度小于50μm，然后加入pH＝3的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，充分混合后利用工作频率40Hz、功率600W的等离子表面处理机对所得混合物处理10～15s，处理结束后转入0～5℃环境中静置3～5h，随后加入聚丙烯酸和聚氧化乙烯，并加热至回流状态保温搅拌15～30min，最后过270目筛，所得滤液即为胶原纤维溶液；
(4)改性胶原纤维溶液的制备：向上述所制胶原纤维溶液中加入微晶纤维素、聚乙二醇6000和L-天冬氨酸，分散均匀后于35～40℃密封静置1～2h，充分混合，然后于微波频率2450MHz、功率700W下微波处理2～3min，再次充分混合，并利用工作频率40Hz、功率600W的等离子表面处理机处理10～15s，所得混合物在冰水浴下以10～15℃/min的速度冷却降温，待温度降至0～5℃后保温搅拌10～15min，即得改性胶原纤维溶液；
(5)止血凝胶的制备：向上述所制改性胶原纤维溶液中加入聚乙醇酸、聚卡波菲、维生素K和氨基己酸，充分混合均匀后分装入模具中，并利用γ射线消毒灭菌，最后经包装后于0～5℃条件下低温保存。
所述步骤(1)中小苏打与三聚磷酸钠的用量质量比为2～3:1。
所述步骤(3)中胎牛皮、提取溶剂、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、聚丙烯酸和聚氧化乙烯的用量质量比10～15:40～50:0.5～1:0.5～1:0.5～1。
所述步骤(3)中聚丙烯酸使用前经过化学改性，其改性方法为：将聚丙烯酸和酪氨酸加入两倍重量份乙醇中，分散均匀后加热至回流状态保温搅拌10min，再加入白藜芦醇和乙二胺四乙酸二钠，继续于回流状态下保温搅拌30min，所得混合物自然冷却至35-40℃后立即转入0-5℃环境中静置8h，然后送入喷雾干燥机中，干燥后所得固体经研磨制成粉末。
所述聚丙烯酸、酪氨酸、白藜芦醇和乙二胺四乙酸二钠的用量质量比为10～15:1～2:3～6:0.5～1。
所述步骤(4)中胶原纤维溶液、微晶纤维素、聚乙二醇6000和L-天冬氨酸的用量质量比25～30:3～6:1～2:0.5～1。
所述步骤(5)中改性胶原纤维溶液、聚乙醇酸、聚卡波菲、维生素K和氨基己酸的用量质量比25～30:2～3:1～2:0.5～1:0.5～1。
本发明的有益效果是：本发明以可溯源纯化胎牛皮为原料，提取制备胶原纤维溶液，并利用微晶纤维素接枝改性所提取的胶原纤维，以及辅以多种助剂制得止血凝胶，该止血凝胶可直接覆盖到出血位置，发挥止血效果，且止血迅速，有效减少出血量的同时促进创面的修复；同时具有优异的生物相容性和生物降解性，使用安全性高，使用后无任何毒副作用。
具体实施方式：
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
实施例1
(1)胎牛皮预处理：以可溯源纯化胎牛皮为原料，将其完全展开后用保鲜膜包裹好，并置于-5～0℃环境中冷冻8h，再用温度10-15℃、质量分数5％的小苏打与三聚磷酸钠(小苏打、三聚磷酸钠的用量质量比为3:1)混合水溶液浸泡15min，然后在去离子水冲淋下用海绵刷刷洗表面2次。
(2)胶原纤维提取溶剂的制备：按照摩尔比1.2:1的比例将环丙基溴和2-吡咯烷酮充分混合，先于超声频率40kHz、功率50W下超声处理30min，再于微波频率2450MHz、功率700W下微波处理5min，然后加热至回流状态保温搅拌60min，待混合溶液自然冷却至50-55℃后加入等重量的5-10℃去离子水，充分搅拌后静置分层，取水相，即得提取溶剂。
(3)胶原纤维溶液的制备：将上述刷洗后的15份胎牛皮送入冷冻干燥机中，干燥至含水量为10-15％后利用碎皮机粉碎成粒度为2-3mm的颗粒，再加入上述所制50份提取溶剂中，充分分散后静置15min，静置结束后转入球磨机中，球磨至细度小于50μm，然后加入0.5份pH＝3的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，充分混合后利用工作频率40Hz、功率600W的等离子表面处理机对所得混合物处理15s，处理结束后转入0～5℃环境中静置5h，随后加入1份聚丙烯酸和0.5份聚氧化乙烯，并加热至回流状态保温搅拌30min，最后过270目筛，所得滤液即为胶原纤维溶液。
(4)改性胶原纤维溶液的制备：向上述所制25份胶原纤维溶液中加入3份微晶纤维素、1份聚乙二醇6000和0.5份L-天冬氨酸，分散均匀后于35～40℃密封静置2h，充分混合，然后于微波频率2450MHz、功率700W下微波处理3min，再次充分混合，并利用工作频率40Hz、功率600W的等离子表面处理机处理15s，所得混合物在冰水浴下以10～15℃/min的速度冷却降温，待温度降至0～5℃后保温搅拌15min。
(5)止血凝胶的制备：向上述所制25份改性胶原纤维溶液中加入2份聚乙醇酸、2份聚卡波菲、0.5份维生素K和0.5份氨基己酸，充分混合均匀后分装入模具中，并利用γ射线消毒灭菌，最后经包装后于0～5℃条件下低温保存。
聚丙烯酸的改性：将15份聚丙烯酸和1份酪氨酸加入两倍重量份乙醇中，分散均匀后加热至回流状态保温搅拌10min，再加入5份白藜芦醇和0.5份乙二胺四乙酸二钠，继续于回流状态下保温搅拌30min，所得混合物自然冷却至35-40℃后立即转入0-5℃环境中静置8h，然后送入喷雾干燥机中，干燥后所得固体经研磨制成粉末。
实施例2
(1)胎牛皮预处理：以可溯源纯化胎牛皮为原料，将其完全展开后用保鲜膜包裹好，并置于-5～0℃环境中冷冻8h，再用温度10-15℃、质量分数5％的小苏打与三聚磷酸钠(小苏打、三聚磷酸钠的用量质量比为3:1)混合水溶液浸泡15min，然后在去离子水冲淋下用海绵刷刷洗表面2次。
(2)胶原纤维提取溶剂的制备：按照摩尔比1.2:1的比例将环丙基溴和2-吡咯烷酮充分混合，先于超声频率40kHz、功率50W下超声处理30min，再于微波频率2450MHz、功率700W下微波处理5min，然后加热至回流状态保温搅拌60min，待混合溶液自然冷却至50-55℃后加入等重量的5-10℃去离子水，充分搅拌后静置分层，取水相，即得提取溶剂。
(3)胶原纤维溶液的制备：将上述刷洗后的15份胎牛皮送入冷冻干燥机中，干燥至含水量为10-15％后利用碎皮机粉碎成粒度为2-3mm的颗粒，再加入上述所制45份提取溶剂中，充分分散后静置15min，静置结束后转入球磨机中，球磨至细度小于50μm，然后加入0.5份pH＝3的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，充分混合后利用工作频率40Hz、功率600W的等离子表面处理机对所得混合物处理15s，处理结束后转入0～5℃环境中静置5h，随后加入0.5份聚丙烯酸和0.5份聚氧化乙烯，并加热至回流状态保温搅拌30min，最后过270目筛，所得滤液即为胶原纤维溶液。
(4)改性胶原纤维溶液的制备：向上述所制30份胶原纤维溶液中加入3份微晶纤维素、1.5份聚乙二醇6000和0.5份L-天冬氨酸，分散均匀后于35～40℃密封静置2h，充分混合，然后于微波频率2450MHz、功率700W下微波处理3min，再次充分混合，并利用工作频率40Hz、功率600W的等离子表面处理机处理15s，所得混合物在冰水浴下以10～15℃/min的速度冷却降温，待温度降至0～5℃后保温搅拌15min。
(5)止血凝胶的制备：向上述所制25份改性胶原纤维溶液中加入2份聚乙醇酸、1份聚卡波菲、0.5份维生素K和0.5份氨基己酸，充分混合均匀后分装入模具中，并利用γ射线消毒灭菌，最后经包装后于0～5℃条件下低温保存。
聚丙烯酸的改性：将15份聚丙烯酸和2份酪氨酸加入两倍重量份乙醇中，分散均匀后加热至回流状态保温搅拌10min，再加入5份白藜芦醇和0.5份乙二胺四乙酸二钠，继续于回流状态下保温搅拌30min，所得混合物自然冷却至35-40℃后立即转入0-5℃环境中静置8h，然后送入喷雾干燥机中，干燥后所得固体经研磨制成粉末。
对实施例1和2所制备的止血凝胶进行性能测定，结果如下：
外观：凝胶状，表面光滑，无肉眼可见之杂质；
水分含量：≤80％(wt)；
凝胶强度：100～500g/cm2；
重金属含量：≤10μg/g(m/m)；
脂质体：≤1％(m/m)；
灰分：≤2％(m/m)；
pH值：≥4.0；
生物降解性：体内一月内全部降解；
抗菌/抑菌性能：对大肠杆菌、金球菌、白色念珠菌和绿脓杆菌的抑菌率均≥50％；
溶血率：≤5％；
细胞毒性：细胞毒性反应不大于1级；
无菌试验：无菌；
致敏试验：无迟发性超敏反应；
皮内反应试验：原发性刺激指数PII<0.4；
外源性DNA含量：外源性DNA残留量应≤10ng/ml(m/v)
热源：无热源；
急性全身毒性：无急性全身毒性；
遗传毒性：无遗传毒性；
凝胶时间：≤30s；
止血时间：≤1min。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。