本发明涉及化合物apigenin的新用途，尤其涉及apigenin在制备治疗或预防登革病毒感染药物中的应用。
背景技术：
登革病毒(denguevirus，denv)能够引起登革热，其通过伊蚊传播，严重感染者出现登革出血热和登革休克综合症，病死率极高。该病毒有四个血清型，血清2型是流行病株。本病主要在东南亚，太平洋地区和美洲的热带和亚热带国家中流行。中国广东省，海南省，广西省曾经有14次不同规模的登革热流行。中国登革热的主要传播媒介是埃及伊蚊和白蚊伊蚊。前者分布于南方沿海地区，后者则在南北地区广泛存在南北地区。有报道显示已经从蚊子体内分离到登革病毒。但是，目前在临床上还没有有效的治疗药物。
因此，我们应该高度重视对登革病毒的研究，加强对其的科研力度，做好相关知识和药物的储备，为我国在防控登革病毒感染的方面做出一定的贡献。
本发明涉及的化合物apigenin是一个2014年发表(ebenezerdemellocruz，etal.,leishmanicidalactivityofcecropiapachystachyaflavonoids:arginaseinhibitionandalteredmitochondrialdnaarrangement.phytochemistry,89(2013)71–77.)的新化合物，该化合物拥有全新的骨架类型(ebenezerdemellocruz，etal.,leishmanicidalactivityofcecropiapachystachyaflavonoids:arginaseinhibitionandalteredmitochondrialdnaarrangement.phytochemistry,89(2013)71–77.)，对于本发明涉及的apigenin在制备治疗或预防登革病毒感染药物中的用途属于首次公开，由于属于全新的结构类型，而且其对于治疗或预防登革病毒感染的活性强得意想不到，不存在由其他化合物给出任何启示的可能，具备突出的实质性特点，同时用于治疗或预防登革病毒感染显然具有显著的进步。
技术实现要素：
本发明的目的是在于提供了一种apigenin在作为制备治疗或预防登革病毒感染药物中的应用,apigenin能够有效地抑制登革病毒的增殖，但是对细胞毒性很小，可进一步开发为治疗登革病毒感染疾病的药物，具有广泛的应用前景。
所述化合物apigenin,结构如式(ⅰ)所示：
所述apigenin在制备治疗或预防登革病毒感染药物中的应用，apigenin对denv有抑制作用。
一种治疗或预防登革病毒感染药物，由apigenin为活性成分添加辅料制备而成，制备方法为取5克化合物apigenin,加入糊精195克，混匀，常规压片制成1000片。
一种治疗或预防登革病毒感染药物，由apigenin为活性成分添加辅料制备而成，制备方法为取5克化合物apigenin，加入淀粉195克，混匀，装胶囊制成1000粒。
本发明涉及的apigenin在制备治疗或预防登革病毒感染药物中的用途属于首次公开，由于骨架类型属于全新的骨架类型，而且其对于登革病毒抑制活性强得意想不到，不存在由其他化合物给出任何启示的可能，具备突出的实质性特点，同时用于登革病毒感染的防治显然具有显著的进步。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
1、apigenin对vero细胞的毒性实验：
vero细胞是denv的易感细胞。因此，本实验首先检测apigenin对vero细胞的细胞毒性，以不同浓度的apigenin作用于vero细胞，来了解在细胞存活率为90％以上的apigenin的最大使用浓度，为后续的apigenin对denv的抑制作用实验提供参考数据。
2、apigenin对denv的抑制实验：
以不同浓度的apigenin作用于已经感染了denv的vero细胞，来获得apigenin对病毒的抑制效率。本实验中的apigenin的使用浓度均在使vero细胞在90％以上存活率的浓度的范围内，因此，可以排除apigenin的浓度过高而对实验数据的分析产生影响。
apigenin在治疗或预防登革病毒感染药物中的(抑制)应用，其基本过程是：
a.apigenin对vero细胞的毒性实验：
vero细胞(非洲绿猴肾细胞)是denv的易感细胞。实验中的vero细胞购买于中国科学院上海生科院细胞资料中心；mtt试剂盒购于碧云天生物技术研究所；胎牛血清(fetalbovineserum，fbs)购买于美国gibco公司；细胞培养板购买于德国greinerbioone公司；dmem培养基和mem培养基购买于美国gibco公司。
实验步骤如下：
1：接种vero细胞：用含10％(v/v)胎牛血清的dmem培养基配成单个细胞悬液，以
每孔1000-10000个细胞接种到96孔细胞培养板，每孔接种体积100ul；
2：培养vero细胞：在37℃，5％(v/v)co2培养条件下，培养2天；
3：加入apigenin：吸弃每个孔中的dmem培养基，向各个孔中加入100ul用含10％(v/v)胎牛血清的dmem培养基稀释成相应浓度(0um，0.4um，1.2um，3.7um，11um，33um，100um，300um)的apigenin，对照孔加不加含10％(v/v)胎牛血清的dmem培养基100ul；
4：呈色：培养48小时后，每孔加mtt溶液10ul，在37℃，5％(v/v)co2培养条件下继续孵育4小时，然后加入formazan溶解液，在37℃，5％(v/v)co2培养条件下继续孵育4小时，直至在普通光学显微镜下观察发现formazan全部溶解；
(1)：测量：在570nm测定吸收值。
表1不同浓度的apigenin对vero细胞的毒性实验
b.apigenin对denv的抑制实验：
以vero细胞为培养病毒denv的细胞，moi为0.1，实验步骤如下：
在24孔细胞培养板中接入vero细胞，24小时后细胞长至单层(细胞覆盖孔底的面积约为80％～90％)，吸出培养基，接入病毒样品200ul，37℃吸附2小时。吸附完成后，吸弃各孔中的病毒液，用dmem培养基洗去未吸附的病毒。加入用含10％(v/v)胎牛血清的dmem培养基稀释的指定浓度(0um，0.04um，0.12um，0.37um，1.1um，3.3um，10.0um)的apigenin，于37℃、5％(v/v)co2的培养箱中培养42小时，收集各个孔中的上清，做病毒噬斑实验。
病毒噬斑实验：在24孔板中接入vero细胞，24小时后细胞长至单层(细胞覆盖孔底的面积约为80％～90％)，吸弃各孔中的培养基，接入用含3％(v/v)胎牛血清的dmem培养基10倍系列稀释的病毒样品200ul，37℃吸附2小时。吸附完成后将各个孔的上清板吸弃，用10％(v/v)fbs的dmem培养基洗去未吸附的病毒。加入新鲜的45℃预热的半固定培养基[a成分：3％(v/v)fbs，2×mem培养基，青霉素(美国amresco)和链霉素(美国amresco)终浓度分别为100u/ml，0.1mg/ml；b成分：1％(w/v)的琼脂糖(法国biowest)。a成分：b成分＝1:1(v/v)]，于37℃、5％(v/v)co2的培养箱中培养48～72小时。待噬斑形成后用结晶紫(美国amresco)染色(2％(w/v)结晶紫溶于10％(v/v)甲醛)，2小时后用流水冲去结晶紫和琼脂糖，在显微镜下对每孔产生的细胞噬斑，根据噬斑数和稀释倍数计算病毒的滴度(pfu/ml，pfu：plaqueformationunit噬斑形成单位)。pfu＝病毒稀释度×p/v，(p：空蚀斑数目；v：接种量)。在2次不同的时间进行实验。
表2不同浓度的apigenin对denv滴度降低及抑制作用
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：本发明通过对denv的抑制实验证实了apigenin对denv具有很好的抑制作用，从本质上证明了该药物在治疗denv感染疾病中具有广泛的应用背景。该发明能够为临床治疗由denv引起的疾病提供很好的候选药物，具有十分良好的应用前景。
本发明涉及的apigenin在制备治疗或预防登革病毒感染药物中的用途属于首次公开，由于骨架类型属于全新的骨架类型，而且其对于登革病毒抑制活性强得意想不到，不存在由其他化合物给出任何启示的可能，具备突出的实质性特点，同时用于登革病毒感染的防治显然具有显著的进步。
具体实施方式
本发明所涉及化合物apigenin的制备方法参见文献(ebenezerdemellocruz，etal.,leishmanicidalactivityofcecropiapachystachyaflavonoids:arginaseinhibitionandalteredmitochondrialdnaarrangement.phytochemistry,89(2013)71–77.)
以下通过实施例对本发明作进一步详细的说明，但本发明的保护范围不受具体实施例的任何限制，而是由权利要求加以限定。
实施例1：本发明所涉及化合物apigenin片剂的制备：
取5克化合物apigenin,加入制备片剂的常规辅料195克，混匀，常规压片机制成1000片。
实施例2：本发明所涉及化合物apigenin胶囊剂的制备：
取5克化合物apigenin，加入制备胶囊剂的常规辅料如淀粉195克，混匀，装胶囊制成1000粒。
下面通过药效学实验来进一步说明其药物活性。
apigenin作为在制备治疗或预防登革病毒感染药物中的(抑制)应用，其基本过程是：
a.apigenin对vero细胞的毒性实验：
vero细胞(非洲绿猴肾细胞)是denv的易感细胞。
实验步骤如下：
1：接种vero细胞：用含10％(v/v)胎牛血清的dmem培养基配成单个细胞悬液，以每孔1000-10000个细胞接种到96孔细胞培养板，每孔接种体积100ul；
2：培养vero细胞：在37℃，5％(v/v)co2培养条件下，培养2天；
3：加入apigenin：吸弃每个孔中的dmem培养基，向各个孔中加入100ul
用含10％(v/v)胎牛血清的dmem培养基稀释成相应浓度(0um，0.4um，1.2um，3.7um，11um，33um，100um，300um)的apigenin，对照孔加不加含10％(v/v)胎牛血清的dmem培养基100ul；
4：呈色：培养48小时后，每孔加mtt溶液10ul，在37℃，5％(v/v)co2培养条件下继续孵育4小时，然后加入formazan溶解液，在37℃，5％(v/v)co2培养条件下继续孵育4小时，直至在普通光学显微镜下观察发现formazan全部溶解；
5：测量：在570nm测定吸收值。
6：实验结果见表1。
b.apigenin对denv的抑制作用：
以vero细胞为培养病毒denv的细胞，moi为0.1，实验步骤如下：
1.在24孔细胞培养板中接入vero细胞，24小时后细胞长至单层(细胞覆盖孔底的面积约为80％～90％)，吸出培养基，接入病毒样品200ul，37℃吸附2小时。吸附完成后，吸弃各孔中的病毒液，用dmem培养基洗去未吸附的病毒。加入用含10％(v/v)胎牛血清的dmem培养基稀释的指定浓度(0um，0.04um，0.12um，0.37um，1.1um，3.3um，10.0um)的apigenin，于37℃、5％(v/v)co2的培养箱中培养42小时，收集各个孔中的上清，做病毒噬斑实验。
2.病毒噬斑实验：在24孔板中接入vero细胞，24小时后细胞长至单层(细胞覆
盖孔底的面积约为80％～90％)，吸弃各孔中的培养基，接入用含3％(v/v)胎牛血清的dmem培养基10倍系列稀释的病毒样品200ul，37℃吸附2小时。吸附完成后将各个孔的上清板吸弃，用10％(v/v)fbs的dmem培养基洗去未吸附的病毒。加入新鲜的45℃预热的半固定培养基[a成分：3％(v/v)fbs，2×mem培养基，青霉素和链霉素终浓度分别为100u/ml，0.1mg/ml；b成分：1％(w/v)的琼脂糖(法国biowest)。a成分：b成分＝1:1(v/v)]，于37℃、5％(v/v)co2的培养箱中培养48～72小时。待噬斑形成后用结晶紫(美国amresco)染色(2％(w/v)结晶紫溶于10％(v/v)甲醛)，2小时后用流水冲去结晶紫和琼脂糖，在显微镜下对每孔产生的细胞噬斑，根据噬斑数和稀释倍数计算病毒的滴度(pfu/ml，pfu：plaqueformationunit噬斑形成单位)。pfu＝病毒稀释度×p/v，(p：空蚀斑数目；v：接种量)。
3.实验结果见表2。
结论：apigenin对登革病毒具有很强的抑制作用，而且安全，因此apigenin在治疗登革病毒感染疾病中具有广泛的应用背景。