本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种联合用药物在治疗疟疾中的应用，该联合用药物的活性成分为青蒿素类药物和花青素。
背景技术：
疟疾(malaria)作为全世界最为严重且广泛流行的寄生虫病，到现在仍然威胁着大多数居民的身体健康。一直以来疟疾的主要防治手段之一就是抗疟药物。抗疟药物(如青蒿素类、喹啉类、抗叶酸类等)种类繁多且能够有效控制疟疾的流行和发生，随着时间的推移，由于疟原虫产生的抗药性，使得疟疾又大幅度肆意危害人们的健康，给人们带来不可想象的痛苦和压力。高效低毒的药理特性让青篙素及其衍生物被推荐为抗疟疾的首选药物。
青蒿素类药物是中国发明的从中药青蒿、黄花蒿、云南大头黄花蒿中提取的青蒿素及其半合成衍生物，以蒿甲醚为代表，为一类高效新型抗疟剂，本类药物已在全球疟区应用于恶性疟疾的治疗，取得了明显的经济效益和社会效益。本类药半衰期短，复燃率稍高。
鉴于当前防治抗药性恶性疟严峻的形势，who于2001年要求，今后开发的抗疟药应使用复方。目前已进入市场的青蒿素类复方有：青蒿素哌喹复方、青蒿素蒿甲醚复方、双氢青蒿素磷酸哌喹复方、青蒿琥酯阿莫地喹复方、青蒿琥酯磺胺多辛-乙胺嘧啶复方和蒿甲醚本芴醇复方等。蒿甲醚苯芴醇复方由于苯芴醇存在脂溶性的问题，导致疟疾流行区病人服药后吸收不足，在柬泰边境恶性疟治愈率不足80％。与青蒿素类药配伍的药物如阿莫地喹、磷酸哌喹和磺胺多辛-乙胺嘧啶，均广泛用于疟疾治疗，并产生了抗药性。所以选择一种没有广泛使用而且没有抗性的抗疟药，与青蒿素类药配伍形成新的有效青蒿素复方，具有广阔的运用前景。
花青素(cyanidinchloride)是一类广泛存在于植物中的水溶性类黄酮色素。具有类黄酮的典型结构，以c6－c3－c6为基本的c骨架。目前为止，已知的花青素可分为22大类，最常用的为以下六类:天竺葵色素、矢车菊色素、飞燕草色素、芍药色素、牵牛花色素和锦葵色素。花青素具有很强地清除自由基的能力，并且具有抗氧化、抗炎作用，抑菌作用，抗衰老、抗癌作用以及对肝脏，对心脑血管和视力的保护作用等生理活性。花青素属小分子、水溶性物质，易被人体快速吸收，能在口服45分钟后快速进入人体各个组织器官，在人体内有较好的生物利用度，对结缔组织亲和力强，在酸性环境下稳定，半衰期长，可达27小时，功效持久。根据实验显示长期服用花青素也未发现不良反应。本发明人通过多年研究发现花青素对疟原虫具有治疗和预防的作用，专利申请号2016112006718中已经有提到，但是单用该药治疗用药时间较长，而与其它抗疟药物配伍使用的效果未见相关的研究报道。
本发明克服了花青素和青蒿类药物的上述缺点，提供了一个疗效好、毒副作用小、性能稳定、成本价格相对低廉，并且符合who抗疟药指南的新的抗疟药物，对于全球疟疾防治具有重要意义。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题在于研究设计花青素和青蒿素类药物在治疗疟疾疾病中的联合应用。
本发明的目的是提供一种联合用药物在治疗疟疾疾病中的应用。
本发明中所述的疟疾为由疟原虫引起的疟疾。
本发明所述的联合用药物的活性成分是花青素类和青蒿素类药物。
本发明所述的青蒿素类药物包括青蒿素、二氢青蒿素、蒿乙醚、蒿甲醚、青蒿酯钠、青蒿琥酯、蒿醚林酸以及它们药理学上允许的盐类中的一种或几个化合物，优选青蒿素和蒿甲醚。
本发明所述的花青素包括花青素及其氯化物、琥珀酸盐等花青素衍生物，优选氯化花青素。
本发明涉及的联合用药物，含有第一活性成分青蒿素类药物，和第二活性成分花青素，以及任选的药学上可接受的辅料。其中青蒿类药物和花青素的有效量比为1：100～100：1，青蒿类药物的使用总剂量为10mg/kg～500mg/kg，花青素的使用总剂量为1mg/kg～500mg/kg。本发明的联合用药物中的活性成分的实际剂量水平可以进行改变从而获得能够有效达到需要的治疗响应的一定量的活性化合物。选定的剂量水平取决于具体化合物的活性、给药途径、待治疗疾病的严重程度以及待治疗患者的情况和前病史。
本发明涉及的联合用药物，活性成分花青素和青蒿素类药物可以在同一种制剂单元中，也可以分别在不同的规格制剂单元中。
本发明的另一个目的是提供一种用于治疗疟疾的方法，该方法是将第一活性成分青蒿素类药物和第二活性成分花青素联合施用到需要治疗的个体中，其中第一活性成分和第二活性成分可以同时施用到需要治疗的个体中，也可以分别施用到需要治疗的个体中，还可以依次施用到需要治疗的个体中，例如先施用第一活性成分，间隔一定时间再施用第二活性成分；也可以先施用第二活性成分，间隔一定时间再施用第一活性成分。给药途径可以是一种或多种任何可能的途径，根据患者状况和其他重要参数，这些途径包括口服、注射、呼吸道、皮肤、直肠和经粘膜。
本发明通过体内抗疟活性测定结果显示，花青素有较好的体内抗疟原虫活性。在细胞水平上花青素和青蒿素类药物均对敏感株3d7有显著的协同作用，能降低3d7虫株的生存率。在小鼠感染伯氏疟原虫模型中，发现花青素对青蒿素药抗疟活性有增效作用，并且延长了小鼠的存活时间。
附图说明
图1花青素在体内对伯氏疟原虫感染率的影响图
图1中
图2花青素和青蒿素对3d7虫株生存率影响图
图2中1组为青蒿素组(浓度分别为：0、0.01、0.1、1μg/ml)，2组为氯化花青素(浓度分别为：0、1、3、10μm)，3组为青蒿素+氯化花青素组(青蒿素0.21μg/ml，氯化花青素0.81μg/ml)*p<0.05**p<0.01
图3花青素联合青蒿素对感染伯氏疟原虫小鼠的存活率的影响图
图3中
图4花青素联合青蒿素对感染伯氏疟原虫小鼠的体重的影响图
图4中中
图5花青素联合青蒿素对伯氏疟原虫的抑制率的影响图
图5中
具体实施方式
本发明公开了一种联合用药物在治疗疟疾中的应用，下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：花青素在体内的抗疟活性测定
伯氏疟原虫伯氏株培养，其所用红细胞为昆明小鼠红细胞(来自中山大学实验动物中心)，所有的动物实验过程中对实验动物保护和使用根据nih标准进行。对小鼠进行输血感染，抽取雄性小鼠心脏血液，用5％葡萄糖盐水将血液稀释成每0.2ml内含1×106个受感染红细胞的悬液，腹腔接种小鼠。接种伯氏疟原虫3小时后，进行分组给药，每组10只，组别为：1、空白对照组(灌胃给予生理盐水)，2、磷酸氯喹阳性对照组(灌胃给予15mg/kg)，3、氯化花青素(来源于上海历鼎生物)(灌胃给予25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg)。连续给药4天，在接种感染后第0、2、4、6天尾静脉取血涂膜检查减虫率。
结果显示(如图1所示)，每天测量体重无明显差异(p>0.05)，花青素具有较好的体内抗疟原虫活性。
实施例2：在体外实验中评价花青素联合青蒿素类药物的抗疟作用
抗疟活性可以通过测量疟原虫dsdna含量来确定(corey,v.c.,etal.,abroadanalysisofresistancedevelopmentinthemalariaparasite.natcommun,2016.7:p.11901.)。在含20μl连续稀释测试氯化花青素、青蒿素、氯化花青素+青蒿素混合溶液(购自中国食品药品检定研究所)的96孔板的每个孔中加入感染了3d7虫株p.falciparum的红细胞混悬液(100μl，在rpmi1640培养基(gibco)中加入5g/lalbumax(gibco)和50mg/l庆大霉素(sigma)，使疟原虫血症达到0.5％，红细胞压积达到2％)，然后置于37℃，5％co2培养箱培养48小时。细胞用裂解液(sigma)(tris2.4g/l,edta1.86g/l,saponin0.08g/l,tritonx-1000.8ml/l)进行裂解，dsdna含量用10000xsybrgreeni试剂(invitrogen)测定，测定程序参照文献(plouffe,d.,etal.,insilicoactivityprofilingrevealsthemechanismofactionofantimalarialsdiscoveredinahigh-throughputscreen.procnatlacadsciusa,2008.105(26):p.9059-64.)。简要说来，就是将100μl培育的混合物和按文献说明配制好100μlsybrgreeni试剂混合，在室温下避光培育30-60分钟.然后100μl转移至黑色酶标板中。将酶标板放入enspire荧光酶标仪(perkinelmer)中，在485nm和535nm的吸光值下读取酵标板中每孔的荧光信号值。从剂量-效应曲线中计算出ic50。其中氯化花青素+青蒿素混合溶液中氯化花青素的浓度为其ic50值和青蒿素的浓度为其ic50值，氯化花青素和青蒿素的对3d7的ic50值如下表，对3d7虫株生存率的影响(如图2)：
结果显示，在细胞水平上花青素和青蒿素类药物对敏感株3d7有显著的协同作用，能降低3d7虫株的生存率(p>0.01)。
实施例3：花青素和青蒿素类药物联合用药的急性毒性试验
选18-22g的健康小鼠共240只，分为4组：即青蒿素、花青素、青蒿素100mg/kg与不同剂量花青素相加、花青素25mg/kg与不同剂量青蒿素相加，均为一次灌胃给药，按比例法测定ld50，然后连续观察14天小鼠观察小鼠的一般表现、呼吸及活动状态及有无惊厥等，中毒症状发生的时间、持续时间、恢复情况，记录动物死亡数、死亡时间，死亡动物进行尸体解剖，记录所观察到的变化。
实验结果表明,青蒿素为ld504208mg/kg±512.7mg/kg，花青素ld50为2750±252.5mg/kg，青蒿素100mg/kg与不同剂量花青素相加后花青素ld50为2340±213.6mg/kg，花青素25mg/kg与不同剂量青蒿素相加青蒿素ld50为3580mg/kg±456.9mg/kg，小鼠灌胃青蒿素和花青素5h后，小鼠开始出现死亡，大多数动物在一周内死亡，且死亡情况相似。给药剂量越大，中毒症状出现的时间越早，小鼠死亡数越多。表现为呼吸困难，给药后小鼠自发活动减少，至衰竭死亡。死亡动物解剖肉眼观察未见心、肝、肺、肾、脾等重要器官出血、坏死等异常表现。存活动物大部分出现症状4d后逐渐缓解。以上结果表明，青蒿素和花青素联合其ld50与单方比较，差异均不显著(p>0.05),表明两者联合用药后并不使急性毒性增加。
实施例4：花青素联合青蒿素类药物对伯氏疟原虫体内抗疟实验
采用peters“4天抑制试验”法。小鼠腹腔内接种1×107个鼠疟原虫，接种伯氏疟原虫3小时后，进行分组给药。随机分为7组，每组10只，组别为：1、正常对照组；2、模型组(灌胃给予生理盐水)；3、青蒿素组(灌胃给予100mg/kg)；4、蒿甲醚组(灌胃给予10mg/kg)；5、氯化花青素组(灌胃给予25mg/kg)；6、氯化花青素(25mg/kg)+青蒿素组(100mg/kg)；7、氯化花青素(25mg/kg)+蒿甲醚组(10mg/kg)。每天灌胃给药一次，连续给药4天，每天测量体重，尾静脉取血涂膜检查减虫率，计算药物对疟原虫的抑制率，观察各组动物的死亡数量和死亡时间，并计算动物的存活率和存活时间。
实验结果显示，以28天内存活鼠原虫抑制率、小鼠存活率和平均存活天数比较，复方组均比同剂量单方组有显著提高(p>0.01)(见图3和图5)，小鼠体重复方组比同剂量单方组降低的少(p>0.01)(见图4)。
实验结果说明，在小鼠感染伯氏疟原虫模型中，花青素和青蒿素类药物联合用药具有明显的协同抑制作用，可以增强青蒿素类药物对疟原虫的抑制作用，减少了小鼠的体重降低，延长了小鼠的存活时间。
由上可知，通过实施例1-4的实验结果表明，花青素在体内体外都具有一定的抗疟活性，在细胞水平上花青素和青蒿素类药物对敏感株3d7有显著的协同作用。在小鼠感染伯氏疟原虫模型中，发现花青素对青蒿素药物抗疟活性有增效作用，在一定程度上提高对疟原虫的抑制作用，还可以减少小鼠的体重降低，延长小鼠的存活时间。