用于光疗与成像的金纳米‑介孔硅纳米棒复合物及其制备方法与流程

本发明属于纳米生物医学领域，涉及一种用于光疗与成像的金纳米-介孔硅纳米棒复合物及其制备方法。

背景技术：

癌症的治疗一直备受关注。光热疗法和光动力学疗法是近几十年来发展起来的非手术治疗各种恶性肿瘤的有效方法，具有微创、选择性高等优点。光热疗法和光动力学疗法组成的联合治疗方法在更大程度上克服了彼此的局限性，同时大大地提高了对肿瘤的杀伤作用，降低了副反应的发生。

光声成像(Photoacoustic Imaging,PAI)是将光学成像和超声成像的优点结合起来的一种非侵入式成像技术。脉冲激光照射到生物组织部位，组织的光吸收域将产生相应的光声信号，通过此信号可以重建出组织中的光吸收分布图像。光声成像可以测量与跟踪癌症模型中的肿瘤生长状态和转移情况，对于肿瘤的研究有极大的帮助。

荧光成像(Fluorescence imaging)基于荧光物质被特定的外界能量所激发(如近红外线等)，引起其电子轨道像高能轨道跃迁，再释放能量回归最终的基态的过程中产生可被检测的荧光信号。活体生物荧光成像技术能够直接快速的测量各种癌症模型中的肿瘤生长、转移以及对药物的反应，可使肿瘤病灶被无创伤、高灵敏度的检测出。

近些年来，由于纳米材料良好的物理化学性质特征，其作为药物递送系统用于癌症治疗的研究被赋予极大的关注。然而，很多纳米材料在生物相容性、载药量、细胞摄取率等方面存在局限性。而介孔硅纳米棒(Mesoporous silica nanorods,MSNRs)凭借其较大的表面积，可调节的孔径，良好的生物相容性，更高的载药量，良好的细胞摄取率以及易于修饰等特征在潜在的生物医学应用中得到广泛的研究。而较大粒径的介孔二氧化硅纳米棒通常会有聚集的不稳定现象，并且存在像大部分载体一样的药物提前泄漏问题。因此采用适当的简洁制备方法克服以上问题，开发出一种适用度更好的介孔硅纳米载体对肿瘤的治疗及纳米生物医学领域具有重要意义。

金纳米棒(AuNRs)具有较高的光热能量转换率，易于调节的长径比以及较宽的光谱吸收范围，常被用作肿瘤的光热治疗。当吸收连续发射的近红外低能辐射后，金纳米棒内部会产生电子跃迁，当恢复至稳定状态时会产生大量的热，以此可以对肿瘤组织起到有效的杀伤作用。但是，金纳米棒的单独使用会造成长径比的改变，从而降低治疗效果。同时，大多数与光敏剂的联合使用需要多波长的转换，使治疗过程繁琐。

二氢卟吩e6作为第二代光敏剂，不仅具有卟啉环所特有的光物理性质，而且在光疗窗口中的最大吸收波长移至660nm处，此时对细胞的穿透力较强，摩尔吸收系数也有了明显的提高。相比较一代光敏剂而言，作用深度增加，产生的单线态氧较多，提高了肿瘤杀伤效能同时降低了毒副反应。但是由于其存在长时间的皮肤光敏效应并且不能靶向到肿瘤部位，这在治疗过程中会产生一定的毒副作用。目前尚未有金纳米棒包覆参杂Ce6的介孔硅纳米棒的组成用于光疗与成像的报道。

技术实现要素：

本发明的目的克服现有技术的不足，提供一种用于光疗与成像的金纳米-介孔硅纳米棒复合物。

本发明的第二个目的是提供一种用于光疗与成像的金纳米-介孔硅纳米棒复合物的制备方法。

本发明的第三个目的是提供一种用于光疗与成像的金纳米-介孔硅纳米棒复合物的应用。

本发明的技术方案概述如下：

用于光疗与成像的金纳米-介孔硅纳米棒复合物，用AuNRs-Ce6-MSNRs所示，所述AuNRs为金纳米棒的缩写，所述Ce6为二氢卟吩e6的缩写，所述MSNRs为介孔二氧化硅纳米棒的缩写。

用于光疗与成像的金纳米-介孔硅纳米棒复合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)Ce6-APTES的制备：按比例，将2.0-3.0mg的Ce6溶于1mL的DMSO中，加入5.0-7.0mg的EDC·HCL，在常温下搅拌20-30min，加入4.0-5.0mg的HOBT，在常温下反应30-50min，加入10-15μL APTES反应10-14h；Ce6是二氢卟吩e6的缩写；DMSO是二甲基亚砜的缩写；EDC·HCL是1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的缩写；HOBT是1-羟基苯并三唑的缩写；APTES是3-氨丙基三乙氧基硅烷的缩写；

(2)Ce6-MSNRs的制备：取10mL用氨水调节pH值在10-11间的水，在50-55℃搅拌条件下加入12.0-13.0mg CTAB，逐滴加入100-150μL步骤(1)获得的溶液，再逐滴加入12-18μL的TEOS，搅拌20-30min，加入15-20μL的Si-PEG，40-60℃搅拌条件下回流22-26h，12000-14000rpm离心5-10min，沉淀用无水乙醇洗3-4遍，加入30-40mL无水乙醇，在60-65℃搅拌条件下回流36-48h，除去模版剂CTAB，固液分离，固体用无水乙醇洗3-4次，每次12000-14000rpm离心5-10min，最后分散在10mL水中；MSNRs是介孔二氧化硅纳米棒的缩写；CTAB是十六烷基三甲基溴化铵的缩写；TEOS是正硅酸乙酯的缩写；Si-PEG是2-[甲氧基(聚氧乙烯)丙基]三甲氧基硅烷的缩写；

(3)AuNRs-Ce6-MSNRs的制备：取1mL步骤(2)获得的Ce6-MSNRs分散液，加入1-2mL220μg/mL的AuNRs水分散液，常温下搅拌反应5-7h，离心除去未吸附的AuNRs，沉淀分散在水中；AuNRs是金纳米棒的缩写；

上述用于光疗与成像的金纳米-介孔硅纳米棒复合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的优点：

(1)本发明所使用的光敏剂Ce6，Ce6的量一方面影响着介孔二氧化硅的形状，一方面发挥其光动力学治疗的作用，同时还作为荧光剂起到荧光示踪的作用；

(2)本发明所制备的Ce6-MSNRs，供价连接方式解决了药物未达到靶部位提前泄漏的问题，适宜长度的棒状介孔二氧化硅纳米粒子更有助于在肿瘤部位的聚集及细胞的摄取；

(3)本发明中所用的AuNRs，长度适宜，与MSNRs相匹配，同时吸收波长与Ce6相近，因此可以采用同一近红外激发光(660nm)触发光热与光动力学效果，使治疗更加简便可行，其作为光声造影剂，还可起到光声成像作用；

(4)本发明的AuNRs-Ce6-MSNRs可采用单光源激发，实现光热治疗与光动力学治疗，光声成像与荧光成像一体化，生物相容性良好，大大提高了肿瘤治疗的疗效，降低了毒副反应，制备与应用过程简单易行。

本发明运用聚乙二醇修饰的介孔二氧化硅纳米棒作为药物载体，具有光声成像和光热治疗作用的金纳米棒与具有荧光成像和光动力学治疗作用的二氢卟吩e6有效地结合，实现治疗与追踪诊断一体化。制备方法简单可行，可日后可大量制备。

附图说明

图1(a)为实施例2制备的Ce6-MSNRs透射电镜图；图1(b)为实施例2制备的AuNRs-Ce6-MSNRs透射电镜图；

图2为实施例2制备的Ce6-MSNRs的粒径分布图；

图3为实施例2制备的Ce6-MSNRs，AuNRs-Ce6-MSNRs及AuNRs的紫外可见光谱图；

图4为实施例2制备的Ce6-MSNRs出去模版前与除去模版后的红外光谱图；

图5为实施例2制备的AuNRs-Ce6-MSNRs的光热升温趋势图；

图6为实施例2制备的AuNRs-Ce6-MSNRs产生单线态氧的能力，紫外测定下DPBF浓度变化趋势图；

图7为MTT法检测实施例2制备的AuNRs-Ce6-MSNRs与其他对照组Ce6，Ce6-MSNRs的细胞相对存活率；

图8为实施例7中AuNRs-Ce6-MSNRs与对照组Ce6注射到肿瘤模型小鼠后的光声与荧光成像图；

图9为实施例8中AuNRs-Ce6-MSNRs与对照组PBS和Ce6注射到肿瘤模型小鼠后的光热成像图；

图10为实施例9中检测治疗效果，AuNRs-Ce6-MSNRs与其他对照组(PBS组，Ce6组,Ce6-MSNRs组)分别注射到各组小鼠体内后的肿瘤体积及体重变化趋势图。

具体实施方式

以下结合实施例和具体情况对本发明的具体实施方式作详细说明，但不作为对本发明保护范围的限制。除特别标明外，所用试剂和测试设备均为市售(Si-PEG购买自英国Fluorochem公司；AuNRs购买自香港NanoSeedz公司)。

在各实施例中：

AuNRs为金纳米棒的缩写；

Ce6为二氢卟吩e6的缩写；

MSNRs为介孔二氧化硅纳米棒的缩写；

DMSO是二甲基亚砜的缩写；

EDC·HCL是1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的缩写；

HOBT是1-羟基苯并三唑的缩写；

APTES是3-氨丙基三乙氧基硅烷的缩写；

MSNRs是介孔二氧化硅纳米棒的缩写；

CTAB是十六烷基三甲基溴化铵的缩写；

TEOS是正硅酸乙酯的缩写；

Si-PEG是2-[甲氧基(聚氧乙烯)丙基]三甲氧基硅烷的缩写；

实施例1

用于光疗与成像的金纳米-介孔硅纳米棒复合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)Ce6-APTES的制备：将2.0mg的Ce6溶于1mL的DMSO中，加入5.0mg的EDC·HCL，在常温下搅拌20min，加入4.0mg的HOBT，在常温下反应30min，加入10μL APTES反应10h；

(2)Ce6-MSNRs的制备：取10mL用氨水调节pH值在10-11间的水，在50℃搅拌条件下加入12.0mg CTAB，逐滴加入100μL步骤(1)获得的溶液，再逐滴加入12μL的TEOS，搅拌20min，加入15μL的Si-PEG(CH₃O(C₂H₄O)_9-12(CH₂)Si(OCH₃)₃)，40℃条件下回流22h，12000rpm离心5min，沉淀用无水乙醇洗3遍，加入30mL无水乙醇，在60℃磁力搅拌条件下回流36h，除去模版剂CTAB，固液分离，固体用无水乙醇洗3次，每次12000rpm离心5min，最后分散在10mL水中；

(3)AuNRs-Ce6-MSNRs的制备：取1mL步骤(2)获得的Ce6-MSNRs分散液，加入1mL220μg/mL的AuNRs水分散液，常温下搅拌反应5h，离心除去未吸附的AuNRs，沉淀分散在水中。

实施例2

用于光疗与成像的金纳米-介孔硅纳米棒复合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)Ce6-APTES的制备：将2.5mg的Ce6溶于1mL的DMSO中，加入6.0mg的EDC·HCL，在常温下搅拌25min，加入4.5mg的HOBT，在常温下反应40min，加入12μL APTES反应12h；

(2)Ce6-MSNRs的制备：取10mL用氨水调节pH值在10-11间的水，在52℃搅拌条件下加入12.5mg CTAB，逐滴加入125μL步骤(1)获得的溶液，再逐滴加入15μL的TEOS，搅拌25min，加入17μL的Si-PEG(CH₃O(C₂H₄O)_9-12(CH₂)Si(OCH₃)₃)，50℃搅拌条件下回流24h，13000rpm离心7min，沉淀用无水乙醇洗4遍，加入35mL无水乙醇，在62℃搅拌条件下回流42h，除去模版剂CTAB，固液分离，固体用无水乙醇洗4次，每次13000rpm离心7min，最后分散在10mL水中；(见图1，(a)，图2，图4)

(3)AuNRs-Ce6-MSNRs的制备：取1mL步骤(2)获得的Ce6-MSNRs分散液，加入1.5mL220μg/mL的AuNRs水分散液，常温下搅拌反应6h，离心除去未吸附的AuNRs，沉淀分散在水中。(见图1，(b)，图3)

实施例3

用于光疗与成像的金纳米-介孔硅纳米棒复合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)Ce6-APTES的制备：按比例，将3.0mg的Ce6溶于1mL的DMSO中，加入7.0mg的EDC·HCL，在常温下搅拌30min，加入5.0mg的HOBT，在常温下反应50min，加入15μL APTES反应14h；

(2)Ce6-MSNRs的制备：取10mL用氨水调节pH值在10-11间的水，在55℃搅拌条件下加入13.0mg CTAB，逐滴加入150μL步骤(1)获得的溶液，再逐滴加入18μL的TEOS，搅拌30min，加入20μL的Si-PEG(CH₃O(C₂H₄O)_9-12(CH₂)Si(OCH₃)₃)，60℃搅拌条件下回流26h，14000rpm离心10min，沉淀用无水乙醇洗3遍，加入40mL无水乙醇，在65℃搅拌条件下回流48h，除去模版剂CTAB，固液分离，固体用无水乙醇洗3次，每次14000rpm离心10min，最后分散在10mL水中；

(3)AuNRs-Ce6-MSNRs的制备：取1mL步骤(2)获得的Ce6-MSNRs分散液，加入2mL220μg/mL的AuNRs水分散液，常温下搅拌反应7h，离心除去未吸附的AuNRs，沉淀分散在水中。

实施例4：

测试AuNRs-Ce6-MSNRs的(实施例2制备)光热升温趋势

取0.8ml的AuNRs-Ce6-MSNRs分散液到1.5mL的EP管中，用660nm，1.0W/cm²功率的激光照射器照射样品5分钟，并利用配有热电偶微探针的温度监测器记录下0-5分钟内的温度变化。AuNRs-Ce6-MSNRs的光热升温趋势图如图5所示，可见AuNRs-Ce6-MSNRs在近红外激光的照射下升温效果明显，可以有效地用于光热治疗。

实验证明，实施例1、3制备的AuNRs-Ce6-MSNRs在在近红外激光的照射下升温效果明显。

实施例5：

测试AuNRs-Ce6-MSNRs(实施例2制备)产生单线态氧的能力

以1,3-二苯基异苯并呋喃(DPBF)作为单线态氧的捕获剂测量单线态氧的产生。

将3mL AuNRs-Ce6-MSNRs分散液与3mL AuNRs水分散(220μg/mL)分别与100μL的1.0μg/mL DPBF甲醇溶液混合，然后用660nm波长，1.0W/cm²功率的激光照射器照射5分钟，并在不同的时间点用紫外分光光度计测定DPBF在410nm波长处的吸光值。如图6所示，3分钟内，AuNRs-Ce6-MSNRs的DPBF在410nm处的紫外吸收明显降低，说明AuNRs-Ce6-MSNRs产生单线态氧的能力极强，可以较好地用于肿瘤的光动力学治疗。

实验证明，实施例1、3制备的AuNRs-Ce6-MSNRs产生单线态氧的能力极强。

实施例6：

细胞相对存活率实验，AuNRs-Ce6-MSNRs为实施例2制备

取对数生长期的4T1细胞以5×10⁴个/孔接种于96孔板，每孔100μL，待细胞贴壁生长24小时(大致贴壁80％)后给予药物培养，依次加入pH＝7.4磷酸盐缓冲液(PBS)，不同浓度的Ce6组、实施例2制备的Ce6-MSNRs组与AuNRs-Ce6-MSNRs组(Ce6的浓度从小到大：0.3μg/mL，0.6μg/mL，1.2μg/mL，2.4μg/mL，4.8μg/mL，9.6μg/mL)。给药物后孵育6h，用660nm激光照射(1.0W/cm²)，再继续孵育至24h，每孔中加入20μL的5mg/mL四甲基偶氮唑盐(MTT)(溶剂为pH＝7.4PBS)溶液，4h后吸出孔内培养液，每孔加入200μL二甲基亚砜(DMSO)，避光置摇床上低速振荡10min，使紫色结晶物充分溶解，用酶联免疫测定仪在490nm处测量吸光值，计算各组的细胞相对存活率。实验结果如图7所示，Ce6组和Ce6-MSNRs组对细胞的杀伤作用相当，而AuNRs-Ce6-MSNRs组的细胞毒性明显增强，说明AuNRs-Ce6-MSNRs在近红外激光照射下的光热与光动力学的联合治疗对癌症细胞更具杀伤能力，可以更加有效地应用于肿瘤治疗当中。

实验证明，实施例1、3制备的AuNRs-Ce6-MSNRs在近红外激光照射下的光热与光动力学的联合治疗对癌症细胞更具杀伤能力。

实施例7：

实施例2制备的AuNRs-Ce6-MSNRs注射到肿瘤模型小鼠后的光声与荧光成像(图中US为超声，PA为光声)

通过尾静脉向接种有4T1细胞的肿瘤模型小鼠体注射200μL的Ce6和AuNRs-Ce6-MSNRs(Ce6浓度均为9.6μg/mL)，在注射后2h，6h，12h，24h记录其荧光成像图像，观察各个时间点荧光成像分布情况。如图8b所示，注射12h后，AuNRs-Ce6-MSNRs在肿瘤部位达到最大聚集，且24h后仍有部分未被代谢。在注射Ce6、AuNRs-Ce6-MSNRs 12h后，进行光声成像的扫描，如图8a所示，与对照组Ce6相比，AuNRs-Ce6-MSNRs在肿瘤部位显示出更强的光声信号。两种成像结果均表明AuNRs-Ce6-MSNRs具有良好的肿瘤部位聚集效果，具有极大意义的治疗作用与诊断作用。

实验证明，实施例1、3制备的AuNRs-Ce6-MSNRs具有良好的肿瘤部位聚集效果。

实施例8：

实施例2制备的AuNRs-Ce6-MSNRs注射到肿瘤模型小鼠后的热成像

注射200μL对照组pH＝7.4PBS，Ce6,AuNRs-Ce6-MSNRs(Ce6浓度均为9.6μg/mL)12小时后，对肿瘤局部用660nm激光进行照射，并用近红外成像仪观察肿瘤部位在5分钟内特定时间点的升温情况。如图9所示，相对照组PBS组和Ce6组相比较，AuNRs-Ce6-MSNRs的体内升温效果明显，说明AuNRs-Ce6-MSNRs具有良好的光热治疗效果，对临床的肿瘤治疗具有极大意义。

实验证明，实施例1、3制备的AuNRs-Ce6-MSNRs体内升温效果明显。

实施例9：

治疗效果研究，AuNRs-Ce6-MSNRs为实施例2制备

接种有4T1细胞的肿瘤模型小鼠被分为四组(每组12只)，分别通过尾静脉注射pH＝7.4PBS，Ce6,Ce6-MSNRs,AuNRs-Ce6-MSNRs(Ce6浓度均为9.6μg/mL)，注射药物12h后给予激光照射，每隔一天给药一次并记录各组肿瘤模型小鼠的体重和肿瘤体积变化情况。如图10所示，相比较而言，注射AuNRs-Ce6-MSNRs组的小鼠肿瘤体积和体重变化均较稳定，说明该处方具有优异的抑制肿瘤作用。

实验数据结果表明，本发明制备所制备的光热与光动力联合治疗处方AuNRs-Ce6-MSNRs拥有良好的抗肿瘤作用和较低的副反应。